Reguliavimas amilinas atleidimo nuo kultūringas triušio skrandžio fundic gleivinės cells

reglamento amilinas atleidimo nuo kultūringas triušių skrandžio fundic gleivinės ląstelių
Anotacija
faktai
amilinas (salelių amiloido polipeptido) yra hormonas, su siūlomų vaidmenų gliukozės reguliavimo homeostazės, skrandžio variklis ir sekrecijos funkcija ir gastroprotection. Į skrandžio gleivinės amilino yra nustatyta, bendrai lokalizuota su somatostatino D-ląstelių. Reglamentuojantys skrandžio amilinas spaudai veiksniai yra nežinoma. Šiame tyrime mes tyrė amilinas išleidimo reguliavimą iš skrandžio gleivinės ląstelių pirminės kultūros. Triušis fundic gleivinės ląstelės praturtintas D-ląstelių srovę išnešimo buvo auginamos 40 valandas. Amilinas and somatostatin spaudai per 2 valandas, reaguojant į agonistų buvo įvertintas.
Rezultatai
amilinas išleidimo buvo gerokai sustiprintas aktyvavimo baltymų kinazės C phorbol-12-miristatas-13-acetatas, adenilatciklazę su forskolin ir pakilimas ląstelėje kalcio su A23187. Cholecistokininas (CCK), epinefrino ir į gliukagoną panašaus peptido-1 (GLP-1) kiekviena stimuliuojama amilinas išsiskyrimą priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Maksimalus CCK-skatino spaudai buvo didesnis nei bet epinefrino ar GLP-1, net jei pastarosios dvi poveikis buvo sustiprintas isobutylmethylxanthine. Skatino amilinas laida buvo smarkiai slopino carbachol (pagal 51-59%) ir oktreotidą (pagal 33-42%). Somatostatin spaudai lygiagrečiai, kad amilino.
Išvadas Viesbutis The kultūringas D-ląstelių modelis suteikia studijuoti amilinas spaudai priemonėmis. Amilinas sekrecija stimuliuojama receptorių priklauso ir -independent aktyvavimo Ca 2 + /baltymų kinazės C ir adenilatciklazę būdus. Slopinimas yra susijęs su aktyvinimo muskarino receptorių ir auto reguliavimo pagal somatostatinas.
Faktai
amilinas (salelių amiloido polipeptido) yra 37 aminorūgščių peptidas daugiausia išreikštas kasos salelių iš Langerhanso [1, 2]. Amilinas taip pat buvo lokalizuota visame žmogaus virškinimo trakte [3], ir [4] smegenis. Daug paskutinis darbas buvo sutelktas į kasos amilino fiziologija; atrodo peptidas turi būti bendrai saugomi ir bendro-išskiriamas su insulino kasos B-ląstelių [5, 6], mažesnis dalis yra bendrai lokalizuota su somatostatinas kasos D-ląstelių [7].
amilinas yra manoma, kad funkcija kaip hormonas reguliavimo gliukozės homeostazės. Amilinas slopina bazinę ir insulino skatino glikogeno sintezę žiurkių skeleto raumenų [8, 9]; jis slopina insulino, somatostatin ir gliukagono sekreciją iš izoliuotų kasos salelių ir sveika nušvies kasos ir mažina po valgio gliukagono ir insulino sekreciją [10-12]. Amilinas taip pat gali prisidėti prie glikemijos kontrolės lėtėja skrandžio ištuštinimą [13]. Ji Be šių fiziologinių funkcijų, amilinas yra manoma, kad žaisti svarbų vaidmenį cukrinio diabeto patogenezės. Tai yra pagrindinis komponentas amiloido indėlius pacientams, sergantiems nuo insulino nepriklausomu cukriniu diabetu salelių [1, 2] ir trūkumas amilino gali prisidėti glikemijos kontrolės nepakankamumas būdingas insulino priklausomas cukrinis diabetas [14] ir į tyrimų su gyvūnais pati amilinas atrodo, kad sukelti atsparumą insulinui, [15].
fiziologinių poveikio virškinimo trakto įvairovė taip pat buvo aprašyta. Parenteriniu amilino turi anorectant poveikį [13], be to, gerokai sumažinant skrandžio ištuštinimą [16]. Apsaugos nuo veiksmų, nukreiptų prieš reserpine-, ir serotonino-sukeltas gastropatijos buvo aprašyta [17]. Į veną amilinas yra stiprus inhibitorius bazinei, pentagastrino ir 2-deoksi-D-gliukozė stimuliuojama skrandžio rūgšties sekrecijos žiurkėms [18] ir amilinas sumažintas rūgšties sekrecijos izoliuotos pelės skrandžio preparato [19]. Stimuliatorius poveikis gastrino serumo taip pat buvo pastebėta, nors tai galėjo antrinė su rūgšties sekrecijos [20] slopinimui. Laikantis šių veiksmų amilino privalomos svetainių buvo aptikta žiurkių skrandžio fundic gleivinės [21]. Per pasirodys virškinimo trakto amilinas bendrai lokalizuoti su kitomis virškinimo trakto peptidai. Naudojant in situ hibridizacijos
, imr.rnofluorescencija ir imunocitocheminiais, Mulder ir kt pervežimas parodė, kad amilinas daugiausia bendro lokalizuota su somatostatinas D-ląstelių žiurkių ir pelių antralinių gleivinės ir žiurkių fundic gleivinės [22]. A amilinas mažuma co-lokalizuota į atskirų populiacijų gastrino, kurių sudėtyje yra ląstelių antralinėje dalyje ir PYY, kurių sudėtyje yra ląstelių dugno. Studijos PDX-1 nepakankamo pelėmis (kurie nesugeba vystyti G-ląsteles) neparodė pakeitimo skrandžio amilinas išraiškos, patvirtindamas vyraujantis išraišką amilino per D-ląstelių [23]. Šie duomenys, rodantys amilinas ir amilinas receptorių buvimas kartu su farmakologinio poveikio, siūloma, kad amilinas gali turėti paracrine ir /ar endokrininės reguliavimo ir Patofiziologinis vaidmenį skrandžio gleivinės. Tačiau nėra tyrimus, nagrinėjančius procesus skrandžio amilinas sekrecijos. Tokie duomenys yra būtini tolesniam supratimui skrandžio amilinas fiziologija. Pirmines kultūras skrandžio ir žarnyno endokrininių ląstelių buvo panaudotos nagrinėti fiziologinį ir Patofiziologinis kontroliuoti kelių virškinimo trakto peptidų įskaitant gastrino, somatostatino, į gliukagoną panašaus peptido-1 (GLP-1) ir cholecistokinino (CCK) [24-30]. Bendro lokalizacija amilino su somatostatinas daro skrandžio fundic D-ląstelių paruošimo naudingą modelį išnagrinėti amilinas sekrecijos ląstelių lygiu kontrolę.
Šiame tyrime mes išnagrinėjome receptorių priklauso ir receptorių nepriklausomas reguliavimas amilino sekrecija iš kultūringas triušių skrandžio fundic gleivinės ląsteles. Cholecistokininas, į gliukagoną panašaus peptido-1 ir epinefrino stimuliuojama amilinas išsiskyrimą priklausomai nuo dozės ir muskarininių receptorių agonistas carbachol ir somatostatino receptorių agonistas oktreotidas slopinamas amilinas išsiskyrimą. Somatostatin ir amilinas spaudai įvyko tuo pat metu.
Rezultatai
receptorių nepriklausomas stimuliacija peptidas spaudai
pradžių įvertinti, ar amilinas spaudai gali būti aptikta iš triušienos fundic ląstelių kultūrų, buvo naudojami stiprūs receptorių nepriklausomas dirgiklius [ ,,,0],26] bendras ląstelių kiekis (TCC) iš amilino į kultūringas ląstelių paruošimo (801 ± 151 fmol /gerai) buvo maždaug nuo 4 iki 5 kartų mažesnis nei somatostatinas (3 768 ± 1325 fmol /gerai). Reikšmingas stimuliacija amilinas išleidimo įvyko aktyviai phorbol esterio (phorbol-12-miristatas-13-acetatas, PMA), kuris aktyvuoja baltymų kinazės C (PKC), aktyvavimo adenilatciklazę su forskolin ir fasadams intraceliulinės kalcio su jonoforų A23187 (pav 1). Phorbol esteris buvo labiausiai stiprus stimuliatorius, todėl 8,5 kartus padidėjo amilinas spaudai (bazinio išleisti 2,14 ± 0,8% padidėjo iki 18,5 ± 1,4% TCC). Forskolin padidėjo išleisti 3,3 karto (maksimalus spaudai 7.2 ± 1,4% TCC) ir A23187 1,8 karto (3,8 ± 0,5% TCC), tai buvo žymiai silpniau negu PMA. Nebuvo jokių reikšmingų skirtumų tarp somatostatino ir amilinas spaudai (1 pav.) Modelių. 1 pav receptorių nepriklausomas stimuliacija amilino (viršuje) ir somatostatino (apačioje) iš išaugintų D-ląstelių. Ląstelės buvo stimuliuojama su phorbol-12-miristatas-13-acetatas 100 nM (PMA), forskolin 10 mkm (dažnio) ir A23187 1 mikromolių 2 valandas. išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas rezultatai, vidurkis ± SEM, ** p
< 0,01, lyginant su kontrole, * p
< 0,05, lyginant su kontrole.
Receptorių priklauso nuo stimuliacijos
Ankstesni tyrimai parodė, kad CCK yra stiprus stimuliatorius somatostatino išleidimo [26]. Tai buvo patvirtinta čia. CCK priklausomai nuo dozės stimuliuojama atpalaidavimą amilino iš išaugintų ląstelių (2 pav.) Maksimalus stimuliacija A 2,75 karto padidėjo, 2,1 ± 0,7% bazinio spaudai padidėjo iki 5,9 ± 0,8% TCC, pasireiškė CCK 10 Nm. Panaši reakcija dozė modelis buvo pastebėtas už CCK-skatino somatostatino išleidimo nors maksimalus spaudai buvo santykinai didesnis somatostatinas (4.4 kartus, 1,1 ± 0,1% iki 5,2 ± 0,7% TCC) nei amilino (2 paveikslas). 2 pav CCK-skatino amilinas (viršuje) ir somatostatino (apačioje) išleidimas iš išaugintų D-ląstelių. Išauginti gleivinės ląstelės buvo stimuliuojama su CCK 2 valandas. išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas rezultatai, vidurkis ± SEM, * p
< 0,05, lyginant su kontrole.
Aktyvavimas adenilatciklazę-ryšiu receptorių, kuriems yra epinefrino arba į gliukagoną panašaus peptido-1 buvo nuo dozės priklausomu tiek padidėja tiek somatostatino (maksimalus padidėjimas 1,44 ir 1,35 karto padidėjusi) ir amilino išleidimo (1,36 ir 1,25 ir kartų atitinkamai) (3 ir 4 diagramas). 3 pav poveikis epinefrino ant amilino (viršuje) ir somatostatino (apačioje) išsiskyrimą iš išaugintų D-ląstelių. Ląstelės buvo stimuliuojama su Didinamos koncentracijos epinefrino (EPI) į buvimą ar nebuvimą isobutylmethylxanthine 100 mikrometrai (IBMX) 2 valandas. išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas rezultatai, vidurkis ± SEM, * p
< 0,05, lyginant su kontrole.
4 pav poveikis gliukagoną panašaus peptido-1 dėl amilino (viršuje) ir somatostatino (apačioje) išsiskyrimą iš išaugintų D-ląstelių. Ląstelės buvo stimuliuojama su Didinamos koncentracijos gliukagoną panašaus peptido-1 (GLP), esant arba nesant isobutylmethylxanthine 100 mikrometrai (IBMX) 2 valandas. išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas rezultatai, vidurkis ± SEM, * p
< 0,05, lyginant su kontrole.
Atsakymų į epinefrino ir GLP-1 buvo sustiprintas kartu vartojama fosfodiesterazės inhibitorių isobutylmethylxanthine (IBMX) (100 mikromolių). Bazinis amilinas spaudai buvo 2,0 ± 0,2% TCC ir maksimalus IBMX padidinto spaudai 3,2 ± 0,2% TCC su epinefrino 100 m ir 3,2 ± 0,3% TCC GLP-1 10 Nm. Bazinis somatostatino spaudai (1,1 ± 0,1% TCC) padidėjo iki 2,7 ± 0,1% TCC su epinefrino + IBMX ir 2,1 ± 0,4% TCC GPP-1 + IBMX. Tai vis dar buvo gerokai mažesnis nei CCK-skatino spaudai. Nebuvo modelio ar santykiu somatostatino ir amilinas atsakymų skirtumai (3 ir 4 pav).
Slopinamąjį reguliavimas amilinas išleidimo pervežimas Gydymas somatostatino analoginio oktreotidą pagaminti nedidelius, bet ne žymiai sumažinti tiek bazinę amilino ( 14%) ir bazinio somatostatinas (18%) sekrecija (5 paveikslas). Carbachol neturėjo akivaizdaus poveikio arba baziniu amilino ar somatostatino sekrecijos (5 paveikslas). CCK-skatino amilinas laida buvo smarkiai slopino oktreotidą (42%) ir muskarino agonisto carbachol (iki 51%). Panašiai epinefrino (su IBMX) -stimulated amilinas laida buvo slopinamas 33% oktreotidą ir 59% iki carbachol (tiek P
< 0,05). Kaip parodyta 6 pav, panašus modelis buvo pastebėtas su somatostatino išleidimo. 5 pav poveikis oktreotidą ir carbachol ant bazinio amilinas ir somatostatino paleidimo iš išaugintų D-ląstelių. D-ląstelės buvo stimuliuojama su bet oktreotidą 10 Nm (UŠT) arba carbachol 100 mikrometrai (CBH) 2 valandas ir išleidimo amilino ir somatostatinas įvertinti. Rezultatai išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas, vidurkis ± SEM.
6 pav slopinamąjį poveikį oktreotidą ir carbachol apie agonisto skatino amilino (viršuje) ir somatostatino (apačioje) išleidimo. D-ląstelės buvo stimuliuojama su bet CCK 10 nm ar epinefrino su isobutylmethylxanthine tiek 100 mikrometrai (EPI) kartu su oktreotidą 10 Nm (UŠT) arba carbachol 100 mikrometrai (CBH) 2 val. išreikštas% ląstelių kiekio peptido išleistas rezultatai, vidurkis ± SEM, * p
< 0,05 vs atitinkamos agonistas stimuliuojama spaudai.
Diskusijos
Tai pirmasis tyrimas išnagrinėti amilino išsiskyrimą iš skrandžio gleivinės ląstelių lygiu. Rezultatai parodė, kad amilinas buvo ne tik saugomos skrandžio gleivinės ląstelių bet taip pat, kad tariamas fiziologiniai agonistai reguliuojama išsiskyrimą peptido. Ankstesni tyrimai lokalizuota amilinas į skrandį naudojant Šiaurės sugeriamojo [31, 32], imunocitocheminiais [33], radioimuninė [3] ir in situ hibridizacijos
[22], tačiau skrandžio amilino išleidimo nebuvo įrodytas anksčiau.
skrandžio fundic amilino dauguma, atrodo, lokalizuota su somatostatinas per d-ląstelių [22] Todėl mes naudojamų kultūringas triušis "d-ląstelių modelį ištirti agentai kontroliuojančius ląstelių išsiskyrimą amilino ir palyginti tai somatostatino sekrecija.
Pradiniai tyrimai buvo atlikti su stipriai agentų žinoma, kad tiesiogiai aktyvuoti peptido sekreciją iš endokrininių ląstelių receptoriams nepriklausomas būdu [26] Phorbol esteriai (toks PMA) tiesiogiai aktyvuoti baltymų kinazės C temperatūroje, vidinis sluoksnis pagamintas iš ląstelių membranos; tai savo ruožtu aktyvina ląstelių procesus, reikalingus egzocitozės būdu. PMA buvo stiprus stimuliatorius tiek somatostatino ir amilinas sekrecijos. Kalcio jonoforai A23187, kuris padidina lygį ląstelėje kalcio ([Ca 2 +] i]), taip pat stimuliuojama amilinas spaudai, nors buvo žymiai silpniau negu PMA. Tai panašu į atsakymų matyti žmogaus antralinių [26] ir šunų fundic D-ląstelių [30], kur ji yra tikėti Rise [Ca 2 +] i daugiausia sudarant palankesnes sąlygas, o ne tiesiogiai stimuliuoja sekreciją. Tiesioginis aktyvavimo adenilatciklazę su forskolin taip pat skatino amilinas spaudai. Todėl pirminiai tyrimai parodė, kad amilinas spaudai galėtų būti skatinamas aktyvavimo vieną iš dviejų pagrindinių ląstelėje signaliniu keliu, žinoma, padidinti peptido sekreciją. Nusprendusi, kad šie keliai buvo aktyvus, mes ištirti, kurie fiziologiniai agentai galėtų skatinti amilinas sekrecijos receptoriams priklausomu būdu.
Cholecistokininas-8 gaminamas nuo dozės priklausomas padidėjimą amilinas ir somatostatino sekrecijos. CCK yra žinoma, kad stiprus in vitro
stimuliatorius somatostatino išleidimo iš antralinių ir fundic D-ląstelių [26, 30, 34]. Panaši reakcija, dozės buvo vertinamas už amilino, nors bendras prieaugis buvo šiek tiek didesnis už somatostatinas nei amilino. Tolesni tyrimai bus reikalingi siekiant nustatyti, ar tai yra atskiras baseinas somatostatinas specialiai išskiriami po stimuliacijos CCK. Fundic D-ląstelės atsiranda išreikšti tiek CCK-1 (CCK A) ir CCK-2 (gastrinas /CCK B) receptorius [35]. Aktyvinimas šių receptorių sukelia į fosfolipaze C, išleidimo diacylglerol ir inozitolio 1,4,5-trisphosphate ir po kilimu [Ca 2 +] Aš ir aktyvacijos PKC, todėl peptidų išleidimo [36 aktyvacijos ]. Šie rezultatai sutampa su už A23187 ir PMA stimuliacijos rezultatus. Todėl atrodo, kad CCK gali veikti kaip fiziologinio stimuliatorius amilinas spaudai.
Epinefrino ir GLP-1 gaminami mažų priklauso nuo dozės padidėja amilino ir somatostatino sekrecijos. Šis poveikis gali būti sustiprintas bendradarbiavimas elgesio su fosfodiesterazės inhibitorių IBMX, kuris slopina stovykla irimą ir sustiprina atsaką generuoja adenilatciklazę sujungtų receptorių. Tačiau atsakymai vis tiek buvo gerokai mažiau, kad tie, mačiau su aktyvavimo Ca 2 + /PKC rūšyse Bet kuri CCK ar PMA. Panašūs skirtumai jautrumas buvo aprašyta žmogaus antralinių [26] ir šunų fundic [30] D-ląstelių.
Šiol aprašytos fundic D-ląstelių vyraujantys slopinantis įtaka yra muskarino antagonistus [37, 38] ir autoreguliacija pagal somatostatino save [39, 40]. Atsakymai čia, apie kuriuos pranešta, yra laikantis duomenų apie somatostatino išleidimo iš šunų fundic D-ląstelių [30, 37]. Priešingai, muskarino yra stimuliuoti į antralinių D-ląstelių [41], tikriausiai atspindi tam tikrą skirtumą funkcija. Dabartinė tyrimas patvirtino slopinamąjį veiksmus tiek somatostatino analogas oktreotidą ir muskarino agonisto carbachol prieš somatostatino spaudai. buvo pastebėtas panašus slopinimas stimuliuojamos amilinas spaudai. Tai rodo, kad in vivo
slopinimas amilinas išleidimo apima parasimpatinę įvesties ir autokrining reguliavimą somatostatinas.
Kokiomis sąlygomis mokėsi somatostatin ir amilinas buvo išskiriami lygiagrečiai, kaip galima tikėtis, jei jie yra bendrai laikomi sekrecijos granulių. Insulinas ir amilinas yra bendrai išsiskiria iš kasos beta ląsteles, sekrecija paprastai vyksta lygiagrečiai [42-44], tačiau skirtumas sekrecijos buvo pranešta eksperimento modelių cukriniu diabetu [45, 46]. Tolesni tyrimai bus reikalingi labiau apibrėžti santykius tarp sekrecijos ir veiksmų skrandžio amilino ir somatostatinas santykius. Pavieniais kasos salelių du peptidai atrodo, kad kooperatyvas vaidmenį reguliuojant peptido sekreciją: kartu imunoneutralisation iš amilino ir somatostatinas lėmė didesnį stiprinimo insulino ir gliukagono sekreciją nei neutralizavimo atskirai [10]. Ji bus įdomu ištirti, ar panašūs rezultatai matomi su skrandžio funkcijų.
Po valgio spaudai žarnyno CCK ir GLP-1 slopina skrandžio ištuštinimą ir rūgšties sekrecijos [13, 47]. Šis poveikis yra nors turi būti meditavo bent jau iš dalies per tarpinių produktų, išleistų iš D-ląstelių, o ne tiesiogiai slopina rūgšties išskiriančių parietalinių ląstelių [48]. Buvo tikima, kad somatostatino buvo vienintelis tarpinis, bet dabartinės tyrimo rezultatai rodo, kad paracrine reguliavimas amilino iš Parietal, ECL- ir kitų endokrininių ląstelių gali turėti vaidmenį integruojančios atsakymų į valgį. Amilinas sukeltas slopinimo histamino paleistas iš žiurkių fundic gleivinės segmentų in vitro
buvo tarpininkaujant per padidėjusios somatostatino išleidimo [19], tačiau naudojant atrankinį somatostatino receptorių antagonistas Rossowski kt
parodė in vivo
žiurkėms, kad dalis rūgštis slopinantis veiksmų tiek amilino ir susijusios peptidų adrenomedullin buvo somatostatino nepriklausomas [49]. Konkretūs vaidmenys amilino skrandžio fiziologija reikalauja tolesnio eta tačiau šie duomenys rodo, kad vietoje išleistas amilinas tiesiogiai gali reguliuoti gleivinės funkcijas.
Atsakymus į epinefrino ir carbachol rodo, kad autonominė inervacija gali reguliuoti amilino sekreciją. Bendras balansas in vivo tada
priklausys nuo santykinio įvesties slopinančio muskarino ir stimuliuojantį adrenerginių sistemų, kartu su cirkuliuojančiu endokrininę ir vietos paracrine ir galbūt luminal veiksnius.
Išvada
Šio tyrimo metu apibūdina pirminį apibūdinimą reglamentuojantys skrandžio amilinas spaudai veiksniai. Įrodėme, kad amilinas spaudai gali būti skatinamas receptorių priklauso stimuliacija vienu iš Ca 2 + /PKC ir adenilatciklazę /Camp keliai ir kad fiziologiškai svarbūs peptidai ir nervinio tarpininkai gali sustiprinti amilinas spaudai. Tai patvirtina hipotezę, kad amilinas gali modulis skrandžio gleivinės funkciją. Šis tyrimas patvirtina, kad trumpalaikės ląstelių kultūros praturtintas išnešimo teiks modelį tyrinėti Patofiziologinis spaudai skrandžio amilino ir pateikti dar suprasti amilino vaidmuo reguliuojant skrandžio variklio ir sekrecijos funkcija maršrutą.
Metodai
medžiagos
Matrigel buvo gauta iš Universal Biologicals (Londonas, Jungtinė Karalystė), oktreotidą Novartis (Surrey, Jungtinė Karalystė) ir Ham F12 /Dulbecco modifikuota Eagle anketa mitybine terpe (50:50, v: v), glutaminas, Hanks subalansuotą druskos sprendimas ir serumas iš veršiuko embriono buvo įsigytas iš Gibco (Paisley, Jungtinė Karalystė). Sulfatuotų cholecistokininas-8 (CCK), žmogaus GPP-1 ir visi kiti reagentai buvo gauti iš Sigma (Poole, JK).
Mobilusis izoliacija ir kultūra
pirmines kultūras triušienos skrandžio fundic gleivinės ląstelių praturtintas D-ląstelės buvo gautas kaip aprašyta anksčiau [39, 48]. Trumpai, triušių fundic gleivinė buvo atliktas nuosekliam EDTA ir kolagenazės virškinimą. Gautas ląstelių suspensija buvo praturtintas D-ląstelių priešpriešinės srovės elutatriation naudojant "Beckman JE 5.0 standartinį rotorių kaip buvo aprašyta anksčiau. D-ląstelių praturtintas frakcija buvo resuspenduotos visiškai mitybinės terpės (Ham "F12 /Dulbecco modifikuota Eagle mitybinės terpės (50:50, v: v), kurių sudėtyje yra 2 mm glutaminas, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,22% NaHCO 3, 10% serumas iš veršiuko embriono, 1 mg /l, hidrokortizono, 8 mg /l, insulino, 100 mg /l, penicilino, 100 mg /l, gentamicino, 100 mg /l, streptomicino) ir kultivuojamos tam Matrigel-padengtų 24 duobučių audinių kultūros plokščių [50] esant tankio 1 × 10 6 ląstelių /gerai 40 valandų yra 5% CO 2, 95% oro atmosferoje 37 ° C temperatūroje.
Atleiskite tyrimai
kultivuojamos ląstelės buvo plaunamos 3 kartų spaudai Medium (Earl subalansuota druskos tirpalas, kuriame yra 0,1% galvijų serumo albumino ir 10 mm HEPES pH 7,4), kad pašalinti negyvas ir ne prilipusios ląsteles. Dar 1 ml išleidimo priemonė buvo įtraukta su bandomąja agonistų ir ląsteles inkubuojami 2 valandas 37 ° C temperatūroje, yra 5% CO 2, 95% oro atmosferoje. Po išsiskyrimo laikotarpiu kondicionieriai žiniasklaida buvo įsiurbiamas ir centrifuguoti ir taip pašalinti ne prilipusios ląsteles. Bendras korinio turinys peptidų ekstrahuojamas virinant 1 ml distiliuoto vandens. Sąlygotos žiniasklaidos ir ląstelių ekstraktai buvo laikomi -70 ° C temperatūroje, kol tiriami dėl peptidų kiekio [30].
Peptidų matavimo
somatostatin koncentracija buvo vertinama radioimuninė (RIA) su antiseruminį K2, kaip aprašyta anksčiau [39]. Pusė didžiausias slopinimas privalomas įvyko 2 fmol /vamzdelis ir vidaus tyrimas ir tarp testo variacijos buvo atitinkamai 7% ir 8% proc. Amilinas koncentracija buvo matuojama tiesiogiai ELISA (Penninsula Laboratories, Belmont, CA, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. Tyrimas turi 0.04-2 ng /ml ribose, ir viduje tyrimas ir inter-tyrimas variacijos < 5% ir < 14% atitinkamai. Naudojamas antikūnas turi 100% kryžminės reakcijos su amilino ir amilino-amidą, tačiau < 1% kryžminės reakcijos su CGRP ir nežymi reakcija su kitų biologiškai aktyvių peptidų. Į visus bandomuosius mėginiai vieno gyvūno preparato buvo tiriami toje pačioje RIA arba ELISA.
Statistinę analizę
Polipeptidas išleidimo per 2 valandas buvo išreikštas kaip bendro ląstelių kiekio (TCC) tos peptido procentais. Kiekvienas eksperimentinė sąlyga buvo išbandytas egzemplioriais ir rezultatai iš vieno gyvūnų paruošimo buvo laikomi n = 1. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SEM 3-6 atskirų gyvūnų preparatų. Kiekvienas 24 šulinėlių plokštelė visada įtraukti kontrolės (bazinių) šulinius ir teigiamų stimuliatorių. Peptidas spaudai stimuliatorių buvo lyginamas su baziniu išleidimo atitinkamoje 24 šulinėlių plokštelės. Vienpusis dispersinė analizė ir Stjudento porinio t-testą buvo siekiama nustatyti reikšmę. P
vertė < 0,05 buvo laikomas reikšminga
Santrumpų sąrašas
CCK:.
Cholecistokininas
ECL-: Rīga, enterochromaffin-kaip

>
GPP-1: Rīga, gliukagoną panašaus peptido-1
IAPP: Rīga, salelių amylioid polipeptidas
IBMX: Rīga, isobutylmethylxanthine
PKC: Rīga, baltymų kinazės C
PMA: Rīga, phorbol-12-miristatas -13-acetatas, TCC, bendra ląstelių kiekis.
deklaracijų
Padėka
šis darbas buvo iš dalies remiamą į medicinos mokslinių tyrimų tarybos mokymo stipendijos už ILPB.
Kai kurie iš duomenys buvo pateikiami abstrakčia forma tuo Jungtinė Europos Gastroenterologijos savaitės Birmingeme 1997
autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų. 12899_2003_47_MOESM1_ESM.jpeg Autorių originalus failas 1 pav 12899_2003_47_MOESM2_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 2 pav 12899_2003_47_MOESM3_ESM.jpeg Autorių originalios 3 pav 12899_2003_47_MOESM4_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 4 pav 12899_2003_47_MOESM5_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 5 paveiksle 12899_2003_47_MOESM6_ESM.jpeg Autorių originalus failas 6 pav Autorių įmokų
ILPB sumanyta ir skirta tyrimą, atliko ląstelių izoliaciją, kultūrą, atleiskite eksperimentus, imunologiniai ir parašė projektą ir galutinį versijas rankraščio. Velionis JC sumanyta tyrimą ir bendrai parašė pirmąjį rankraščio projektą.

• Rizikos veiksniai gylio infiltracija diferencijuotą depresija pradžioje skrandžio karcinoma: priimti prejudicinį analysis
• Skirtumas genų ekspresija pelių skrandžio dugno trūksta tarpo ląsteles Cajal