Verordnung von Amylin Freisetzung aus kultivierten Kaninchen Magen-Fundus Schleimhaut cells

Verordnung von Amylin Freisetzung aus kultivierten Kaninchen Magen-Fundus Schleimhautzellen
Zusammenfassung
Hintergrund
Amylin (Insel-Amyloid-Polypeptid) ein Hormon, mit den vorgeschlagenen Rollen bei der Regulation der Glukose Homöostase, Magen-motorische und sekretorische Funktion und Gastroprotektion. In der Amylin Magenschleimhaut wird co-lokalisiert mit Somatostatin in D-Zellen gefunden. Die Faktoren sind Magen-Amylin Release Regulierung unbekannt. In dieser Studie haben wir die Regulation der Amylin-Freisetzung aus Zellen der Magenschleimhaut in der Primärkultur untersucht. Kaninchen Fundus Schleimhautzellen angereichert für D-Zellen, die durch Gegen Schlämmen wurden für 40 Stunden. Amylin und Somatostatin-Freisetzung über 2 Stunden in Reaktion auf Agonisten beurteilt.
Ergebnisse
Amylin-Freisetzung wurde durch die Aktivierung der Proteinkinase C mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat, Adenylatcyclase mit Forskolin und Elevations signifikant erhöht von intrazelluläres Calcium mit A23187. Cholecystokinin (CCK), Epinephrin und Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), die jeweils angeregt Amylin Freisetzung in einer dosisabhängigen Weise. Maximal CCK-stimulierte Freisetzung war größer als entweder Epinephrin oder GLP-1, auch wenn die Wirkungen der beiden letzteren durch Isobutylmethylxanthin verbessert wurden. Angeregt Amylin-Freisetzung wurde durch Carbachol (von 51-59%) und Octreotid (von 33-42%) signifikant gehemmt. Somatostatin Freisetzung parallel dass von Amylin.
Schlussfolgerungen
Die kultivierten D-Zellmodell ein Mittel des Studierens Amylin-Version bietet. Amylin-Sekretion wird durch Rezeptor-abhängige und -unabhängige Aktivierung von Ca stimulierte 2 + /Proteinkinase C und Adenylatcyclase Wege. Inhibition beinhaltet die Aktivierung von muskarinischen Rezeptoren und Autoregulation durch Somatostatin.
Hintergrund
Amylin (islet Amyloid-Polypeptid) ist ein 37-Aminosäuren-Peptid hauptsächlich in den pankreatischen Langerhans-Inseln exprimierten [1, 2]. Amylin wurde auch während des gesamten Gastrointestinaltrakt [3] und im Gehirn lokalisiert worden [4]. Viele neuere Arbeiten über die Physiologie von Pankreas Amylin konzentriert; das Peptid wird mit Insulin in pankreatischen B-Zellen [5, 6], ein kleinerer Anteil ist kolokalisiert mit Somatostatin in pankreatischen D-Zellen [7] zusammen gespeichert und co-sekretiert werden.
Amylin wird angenommen, dass Funktion als Glukose-Homöostase Hormon regulierend. Amylin inhibiert basalen und insulinstimulierten Glykogensynthese im Rattenskelettmuskel [8, 9]; es hemmt Insulin, Somatostatin und Glukagon-Sekretion von isolierten Pankreasinseln und intakt perfundierten Pankreas und es reduziert postprandialen Glukagon und Insulin-Sekretion [10-12]. Amylin kann auch durch eine Verlangsamung der Magenentleerung [13], um die glykämische Kontrolle bei. Es Neben diesen physiologischen Rollen, Amylin wird angenommen bedeutende Rolle in der Pathogenese von Diabetes mellitus spielen. Es ist der Hauptbestandteil der Amyloidablagerungen in den Inseln von Patienten mit nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus [1, 2] und Mangel an Amylin kann das Versagen der glykämischen Kontrolle typisch für insulinabhängigen Diabetes [14] und in Tierstudien beitragen Amylin scheint sich die Insulinresistenz zu induzieren [15].
eine Vielzahl von physiologischen Wirkungen auf den Gastrointestinaltrakt, wurden ebenfalls beschrieben. Die parenterale Verabreichung von Amylin hat eine anorectant Wirkung [13], zusätzlich zu deutlich die Magenentleerung zu reduzieren [16]. Eine Schutzwirkung gegen reserpine- und Serotonin-induzierte Gastropathie beschrieben worden ist [17]. Intravenöse Amylin ist ein potenter Inhibitor von basal, Pentagastrin und 2-deoxy-D-glucose Magensäuresekretion bei der Ratte [18] und Amylin reduzierten Säuresekretion in isolierten Maus Magen preparation [19] stimuliert. Eine stimulierende Wirkung auf die Serum-Gastrin ist auch berichtet worden, obwohl dies für die Hemmung der Säuresekretion Sekundär gewesen sein kann [20]. Im Einklang mit diesen Aktionen Amylin-Bindungsstellen wurden in Ratten-Magen-Fundus Schleimhaut [21] nachgewiesen. Innerhalb der Amylin Gastrointestinaltrakt erscheint mit anderen Magen-Darm-Peptide zur Zusammenarbeit lokalisieren. Mit In-situ-Hybridisierung
, Immunofluoreszenz und Immunzytochemie, Mulder et al
zeigte, dass Amylin überwiegend mit Somatostatin-co-lokalisiert in den D-Zellen von Ratten und Mäusen Antrum-Schleimhaut und Ratte Fundus Schleimhaut [22]. Eine Minderheit von Amylin co-lokalisiert auf getrennte Populationen von Gastrin-haltigen Zellen im Antrum und PYY haltigen Zellen im Fundus. Studien in PDX-1-defizienten Mäusen (die nicht G-Zellen zu entwickeln) zeigten keine Veränderung im Magen-Amylin Ausdruck, was bestätigt, vorherrschende Ausdruck von Amylin in D-Zellen [23]. Diese Daten das Vorhandensein von Amylin und Amylin-Rezeptoren, gekoppelt mit den pharmakologischen Wirkungen zeigt, vorgeschlagen, daß Amylin haben könnte eine parakrine und /oder endokrine Regulierung und pathophysiologische Rolle in der Magenschleimhaut. Allerdings gibt es keine Studien, die die beteiligten Prozesse im Magen-Amylin-Sekretion zu erkunden. Solche Daten sind die Voraussetzung für weiteres Verständnis von Magen-Amylin Physiologie. Primärkulturen von gastrischen und intestinalen endokrinen Zellen wurden, um die physiologischen und pathophysiologischen Steuerung mehrerer gastrointestinale Peptide einschließlich Gastrin, Somatostatin, Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und Cholecystokinin (CCK) [24-30] zu prüfen, verwendet werden. Die Co-Lokalisation von Amylin mit Somatostatin macht den Magen-Fundus D-Zellpräparat ein nützliches Modell, um die Kontrolle von Amylin Sekretion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
In dieser Studie haben wir untersucht, Rezeptor-abhängige und Rezeptor-unabhängige Regulierung von Amylin Sekretion aus kultivierten Kaninchen Magen-Fundus Schleimhautzellen. Cholecystokinin, Glucagon-like peptide-1 und Epinephrin stimuliert Amylin-Freisetzung in einer dosisabhängigen Art und Weise und der muskarinische Rezeptor-Agonist Carbachol und Somatostatin-Rezeptor-Agonist Amylin inhibiert Octreotid Freisetzung. Somatostatin und Amylin Freisetzung aufgetreten parallel.
Ergebnisse | Rezeptor-unabhängige Stimulation der Peptidfreisetzung
Um zunächst prüfen, ob Amylin-Freisetzung aus den Kulturen von Kaninchen Fundus Zellen, potente Rezeptor-unabhängige Stimuli nachgewiesen werden konnten verwendet [ ,,,0],26] die Gesamtzellgehalt (TCC) von Amylin in der kultivierten Zellpräparat (801 ± 151 fmol /Well) war etwa 4 bis 5-fach niedriger als die von Somatostatin (3 768 ± 1325 fmol /Well). Signifikante Stimulation der Amylin Freisetzung erfolgte mit dem aktiven Phorbolester (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat, PMA), das Proteinkinase C (PKC), die Aktivierung von Adenylatcyclase mit Forskolin und Erhöhung von intrazellulärem Calcium mit dem Ionophor A23187 (Abbildung aktiviert 1). Der Phorbolester war das potenteste Stimulans, bis 8,5 fachen Anstieg der Amylin-Freisetzung führt (basal 2,14 ± 0,8% auf 18,5 ± 1,4% der TCC Erhöhung Release). Forskolin Freisetzung erhöht 3,3-fache (maximale Freisetzung 7,2 ± 1,4% des TCC) und 23187 um 1,8-fach (3,8 ± 0,5% TCC), das waren deutlich weniger wirksam als PMA. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mustern von Somatostatin und Amylin-Freisetzung (Fig. 1). Abbildung 1-Rezeptor-unabhängige Stimulation von Amylin (oben) und Somatostatin (unten) aus kultivierten D-Zellen. Zellen wurden mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat 100 nM (PMA), 10 uM Forskolin (FSK) und 1 uM A23187 für 2 Stunden stimuliert. Die Ergebnisse sind als% der Zellinhalt von Peptid ausgedrückt freigegeben, Mittelwert ± SEM, ** P
< 0,01 vs. Kontrolle, * P
< 0,05 vs. Kontrolle.
Rezeptor-abhängige Stimulation
Frühere Studien haben gezeigt, dass CCK ein starkes Stimulans von Somatostatin-Release ist [26]. Dies wurde hier bestätigt. CCK dosisabhängig Freisetzung von Amylin aus den kultivierten Zellen stimuliert (Abbildung 2). Maximale Stimulation, eine 2,75-fache Erhöhung, 2,1 ± 0,7% Basalfreisetzung erhöhte sich auf 5,9 ± 0,8% TCC trat mit CCK 10 nM. Eine ähnliche Dosis-Antwort-Muster wurde für CCK-stimulierte Freisetzung Somatostatin gesehen obwohl maximale Freisetzung relativ höher für Somatostatin war (4,4 fach, 1,1 ± 0,1% auf 5,2 ± 0,7% TCC) als Amylin (Abbildung 2). Abbildung 2 CCK-stimulierte Amylin (oben) und Somatostatin (unten) Freisetzung aus kultivierten D-Zellen. Cultured Schleimhautzellen wurden 2 Stunden mit CCK stimuliert. Die Ergebnisse sind als% der Zellinhalt von Peptid ausgedrückt freigegeben, Mittelwert ± SEM, * P
< 0,05 vs. Kontrolle.
Aktivierung der Adenylatcyclase-gekoppelter Rezeptoren entweder mit Epinephrin oder Glucagon-like peptide-1 führte zu einer dosisabhängigen kleine Zunahme sowohl Somatostatin (maximale Zunahme 1,44 und 1,35 fache respectively) und Amylin-Freisetzung (1,36 und 1,25 und falten bzw.) (3 und 4). Abbildung 3: Wirkung von Adrenalin auf Amylin (oben) und Somatostatin (unten) Freisetzung aus kultivierten D-Zellen. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Epinephrin (EPI) in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 uM Isobutylmethylxanthin (IBMX) für 2 Stunden stimuliert. Die Ergebnisse sind als% der Zellinhalt von Peptid ausgedrückt freigegeben, Mittelwert ± SEM, * P
< 0,05 vs. Kontrolle.
4 Wirkung von Glucagon-like peptide-1 Abbildung auf Amylin (oben) und Somatostatin (unten) Freisetzung aus kultivierten D-Zellen. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Glucagon-like peptide-1 (GLP) in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 uM Isobutylmethylxanthin (IBMX) für 2 Stunden stimuliert. Die Ergebnisse sind als% der Zellinhalt von Peptid ausgedrückt freigegeben, Mittelwert ± SEM, * P
< 0,05 vs. Kontrolle., Die Reaktionen auf Adrenalin und GLP-1 wurden durch die gleichzeitige Verabreichung mit dem Phosphodiesterase-Inhibitor Isobutylmethylxanthin (IBMX) (100 &mgr; M) verbessert. Basal Amylin Freisetzung betrug 2,0 ± 0,2% TCC und maximale IBMX-Enhanced Release 3.2 ± 0,2% TCC mit Epinephrin bei 100 &mgr; M und 3,2 ± 0,3% TCC mit GLP-1 bei 10 nM. Basal Somatostatin Freisetzung (1,1 ± 0,1% TCC) erhöhte sich auf 2,7 ± 0,1% TCC mit Epinephrin + IBMX und 2,1 ± 0,4% TCC mit GLP-1 + IBMX. Diese waren immer noch deutlich weniger als CCK-stimulierte Freisetzung. Es gab keine Unterschiede im Muster oder das Verhältnis von Somatostatin und Amylin Antworten (3 und 4).
Inhibitorischen Regulation von Amylin Freisetzung
Die Behandlung mit dem Somatostatin-Analogon Octreotid produziert kleine, aber nicht-signifikanten Reduktion sowohl in basalen Amylin ( um 14%) und basal Somatostatin (um 18%) -Sekretion (Abbildung 5). Carbachol hatte keinen offensichtlichen Effekt auf entweder die basale Amylin oder Somatostatin-Sekretion (Abbildung 5). CCK-stimulierte Freisetzung von Amylin wurde erheblich durch Octreotid (um 42%) gehemmt und der Muskarinagonisten Carbachol (um 51%). Ähnlich Epinephrin (mit IBMX) stimulierte Amylin Freisetzung um 33% von Octreotid und 59% durch Carbachol gehemmt wurde (beide P
< 0,05). Wie in Abbildung 6 gezeigt, wurde ein ähnliches Muster mit Somatostatin-Release gesehen. Abbildung 5: Wirkung von Octreotid und Carbachol auf die basale Amylin und Somatostatin-Freisetzung aus kultivierten D-Zellen. D-Zellen wurden entweder mit Octreotid stimulierte 10 nM (OCT) oder Carbachol 100 uM (CBH) für 2 Stunden und Freisetzung von Amylin und Somatostatin beurteilt. Ergebnisse in% der Zellinhalt von Peptid freigesetzt, ± SEM bedeuten.
6 hemmenden Wirkungen von Octreotid und Carbachol auf Agonisten-stimulierte Amylin (oben) und Somatostatin (unten) Release Abbildung. D-Zellen wurden entweder mit 10 nM CCK oder Adrenalin mit Isobutylmethylxanthin beiden 100 uM (EPI) in Kombination mit Octreotid 10 nM (OCT) oder Carbachol 100 uM (CBH) für 2 Stunden stimuliert. Die Ergebnisse sind als% der Zellinhalt von Peptid ausgedrückt freigegeben, Mittelwert ± SEM, * P
< 0,05 vs. relevanten Agonisten-stimulierte Freisetzung.
Diskussion
Dies ist die erste Studie, die Freisetzung von Amylin aus Magenschleimhaut auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Ergebnisse zeigten, daß Amylin nicht nur in Zellen der Magenschleimhaut, sondern auch, dass die putative physiologischen Agonisten reguliert Freisetzung des Peptids gelagert wurde. Frühere Studien haben Amylin in den Magen unter Verwendung lokalisierter Northern Blotting [31, 32], Immunzytochemie [33], Radioimmunoassay [3] und in situ Hybridisierung
[22], aber die Freisetzung von Magen Amylin wurde bisher nicht nachgewiesen.
die Mehrheit der Magen-Fundus Amylin scheint mit Somatostatin in D-Zellen lokalisiert werden [22] aus diesem Grund haben wir die gezüchteten Kaninchen D-Zellen-Modell verwendet, um die Mittel zu steuern zelluläre Freisetzung von Amylin zu untersuchen und dieses Sekret zu vergleichen, Somatostatin.
Anfängliche Studien wurden mit potent Mitteln durchgeführt direkt Peptid Sekretion von endokrinen Zellen in einem Rezeptor-unabhängige Weise [26] Phorbol Ester (wie ein PMA) direkt aktiviert Proteinkinase C in der inneren Schicht der Zellmembran aktiviert bekannt; Dies wiederum aktiviert die zelluläre Prozesse für die Exocytose erforderlich. PMA war ein starkes Stimulans der beiden Somatostatin und Amylin-Sekretion. Die Calcium-A23187, deren Gehalt an intrazellulären Kalzium ([Ca 2 +] i]) erhöht auch die Amylin-Freisetzung stimuliert, obwohl es deutlich weniger wirksam als PMA war. Dies ist vergleichbar mit den Antworten in menschlichen antral [26] und Hunde-Fundus D-Zellen beobachtet [30], wo es ist, den Anstieg der glauben [Ca 2 +] i ist in erster Linie facilitative anstatt direkt Sekretion stimulieren. Direkte Aktivierung von Adenylat mit Forskolin Cyclase auch stimuliert Amylin-Release. Daher sind die ersten Studien gezeigt, daß Amylin-Freisetzung durch die Aktivierung von einer der beiden Hauptintrazelluläre Signalwege bekannt stimuliert werden konnten Peptid-Sekretion zu erhöhen. Nachdem festgestellt, dass diese Wege aktiv waren, erkundeten wir die physiologischen Mittel Amylin-Sekretion in einem Rezeptor-abhängige Weise anregen könnten.
Cholecystokinin-8 eine dosisabhängige Erhöhung der Amylin und Somatostatin-Sekretion produziert. CCK ist bekannt, ein potenter in vitro
Stimulans von Somatostatin-Freisetzung aus Antrum und Fundus D-Zellen zu sein [26, 30, 34]. Eine ähnliche Dosis-Antwort wurde für Amylin zu sehen ist, obwohl sich die Gesamt Inkrement etwas größer für Somatostatin als Amylin war. Weitere Studien sind erforderlich, um zu bestimmen, ob diese einen separaten Pool von Somatostatin stellt speziell nach Stimulation mit CCK abgesondert. Fundus-D-Zellen scheinen auszudrücken, sowohl die CCK-1 (CCK A) und CCK-2 (Gastrin /CCK B) Rezeptoren [35]. Die Aktivierung dieser Rezeptoren löst die Aktivierung von Phospholipase C, die Freisetzung von diacylglerol und Inositol-1,4,5-triphosphat und die anschließende Erhöhung der [Ca 2 +] i und Aktivierung von PKC, was zu einer Peptid-Freisetzung [36 ]. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Ergebnissen für A23187 und PMA-Stimulation. Daher scheint es, dass CCK als physiologischer Stimulator, der Amylin-Freisetzung wirken.
Epinephrin und GLP-1 hat kleine dosisabhängige Erhöhungen der Amylin und Somatostatin-Sekretion. Dieser Effekt konnte mit dem Phosphodiesterase-Inhibitor IBMX, die den Abbau von cAMP Mitbehandlung verbessert werden hemmt und verstärkt durch Adenylatcyclase gekoppelten Rezeptoren erzeugt Antworten. Jedoch waren die Reaktionen immer noch deutlich weniger als jene, mit der Aktivierung des Ca gesehen 2 + /PKC Signalweg entweder durch CCK oder PMA. Ähnliche Unterschiede in den Empfindlichkeiten in menschlichen antral [26] und Hunde-Fundus [30] D-Zellen.
Die vorherrschenden hemmenden Einflüsse bisher beschriebenen auf Fundus D-Zellen sind Muscarinagonisten [37, 38] und Autoregulation wurden beschrieben durch Somatostatin selbst [39, 40]. Die Antworten hier berichtet sind mit den Daten auf Somatostatin-Freisetzung aus Hunde-Fundus D-Zellen im Einklang [30, 37]. Im Gegensatz dazu sind Muscarin-Rezeptoren stimulierenden zu antralen D-Zellen [41], wahrscheinlich einen bestimmten Unterschied in Funktion widerspiegelt. Die aktuelle Studie bestätigt die hemmenden Wirkungen von sowohl dem Somatostatin-Analogon Octreotid und Muskarinagonisten Carbachol gegen Somatostatin-Release. Eine ähnliche Hemmung der stimulierten Amylin-Freisetzung wurde gesehen. Dies deutet darauf hin, dass in vivo
Hemmung von Amylin Freisetzung Parasympathikus Eingangs- und autokrinen Regulation durch Somatostatin beinhaltet.
Unter allen Bedingungen untersucht Somatostatin und Amylin wurden parallel sezerniert wird, wie erwartet werden kann, wenn sie in sekretorischen Granula zusammen gespeichert sind. Insulin und Amylin sind Co-abgesondert von Pankreas-β-Zellen, die Sekretion erfolgt in der Regel parallel [42-44], aber Differential-Sekretion wurde in Experiment Modellen von Diabetes mellitus [45, 46] berichtet. Weitere Studien werden benötigt, um die Beziehung zwischen der Sekretion und Aktionen von Magen Amylin und Somatostatin definieren. In isolierten pankreatischen Inseln scheinen die beiden Peptide bei der Regulierung der Peptid-Sekretion eine kooperative Rolle zu spielen: kombinierte imunoneutralisation von Amylin und Somatostatin führte zu größeren Steigerung von Insulin und Glukagon-Sekretion als Neutralisierung entweder allein [10]. Es wird interessant sein zu untersuchen, ob ähnliche Ergebnisse mit Magen-Funktionen zu sehen sind.
Postprandiale Freisetzung von Darm-CCK und GLP-1 hemmen die Magenentleerung und Säuresekretion [13, 47]. Diese Effekte sind zwar zumindest teilweise über Zwischenprodukte von der D-Zelle freigesetzt meditierte werden und nicht durch direkt auf den Säure absondernden Parietalzellen Hemmung [48]. Man glaubte, dass Somatostatin die einzige Zwischen war aber die Ergebnisse der aktuellen Studie legen nahe, dass parakrine Regulation von Amylin von parietalen, ECL- und anderen endokrinen Zellen eine Rolle in den integrativen Reaktionen auf Mahlzeiten. Die Amylin-induzierte Hemmung von Histamin aus Ratte Fundus Schleimhaut Segmente in vitro freigesetzt
wurde über erhöhte Somatostatin-Freisetzung vermittelt [19], aber einen selektiven Somatostatin-Rezeptor-Antagonist Rossowski et al
zeigte in vivo
bei Ratten mit, dass ein Teil der Säure-Hemmwirkungen sowohl Amylin und dem damit verbundenen Adrenomedullin-Peptid wurden Somatostatin-unabhängige [49]. Die spezifischen Rollen von Amylin im Magen-Physiologie erfordern weitere Aufklärung aber diese Daten deuten darauf hin, dass lokal frei Amylin der Regulierung der Schleimhaut Funktionen direkt fähig ist., Die Reaktionen auf Adrenalin und Carbachol legen nahe, dass autonome Innervation die Sekretion von Amylin regulieren kann. Die Gesamtbilanz in vivo
würde dann auf der relativen Eingang der hemmenden Muscarin und stimulierenden adrenergen Systeme abhängen, kombiniert mit endokrinen und lokale parakrine zirkulierenden und möglicherweise luminalen Faktoren.
Fazit
Diese Studie beschreibt die erstmalige Beschreibung die Faktoren regulieren Magen-Amylin-Release. Wir haben gezeigt, dass Amylin Freisetzung kann durch rezeptorabhängige Stimulation von entweder der Ca 2 + /PKC und Adenylatcyclase /cAMP Wege und dass physiologisch relevanten Peptiden und neuronale Vermittler können Amylin Freisetzung stimuliert werden zu verbessern. Dies unterstützt die Hypothese, dass der Magenschleimhaut Funktion kann das Modul Amylin. Diese Studie bestätigt, dass die kurzfristigen Kulturen von Schlämmen angereicherten Zellen ein Modell liefern die pathophysiologischen Freisetzung von Magen-Amylin und bieten eine Strecke von weiteren Verständnis der Rolle von Amylin bei der Regulierung der Magen-motorische und sekretorische Funktion.
Methoden zur Erforschung
Werkstoffe
Matrigel wurde von den Universal Biologicals (London, UK), Octreotid von Novartis (Surrey, UK) und Hams F12 /Dulbecco-modifiziertem Eagle-Kulturmedium erhalten (50:50, v: v), Glutamin, Hanks ausgeglichener Salz Lösung und fötalen Kälberserum wurden von Gibco (Paisley, UK) erworben. Sulfatierte Cholecystokinin-8 (CCK), human GLP-1 und alle anderen Reagenzien wurden von Sigma (Poole, UK).
Zellisolierung und Kultur
Primärkulturen von Kaninchen-Magenfundus Schleimhaut für D-Zellen angereicherten Zellen wurden erhalten, wie zuvor beschrieben [39, 48]. Kurz gesagt wurde Fundus Schleimhaut Kaninchen auf sequentielle EDTA und Collagenaseverdau unterworfen. Die resultierende Zellsuspension wurde für D-Zellen durch Gegenfluß elutatriation angereichert einen Beckman JE 5,0 Standardrotor verwendet, wie zuvor beschrieben. Die D-Zelle angereicherte Fraktion wurde in komplettem Kulturmedium (Ham-F12 /Dulbeccos modifiziertem Eagle-Kulturmedium resuspendiert (50:50, v: v), enthaltend 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,22% NaHCO 3, 10% fötalem Kälberserum, 1 mg /l Hydrocortison, 8 mg /l Insulin, 100 mg /l Penicillin, 100 mg /l Gentamicin, 100 mg /l Streptomycin) und kultiviert auf Matrigel beschichteten 24-Well-Gewebekulturplatten [50] bei einer Dichte von 1 × 10 6 Zellen /Napf 40 Stunden lang in einer Atmosphäre von 5% CO 2, 95% Luft bei 37 ° C.
Studies
Kultivierte Zellen wurden gewaschen Lösen 3 mal in Freisetzungsmedium (Earl ausgewogene Salzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin, 10 mM HEPES pH 7,4, enthaltend) tot und nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen. Eine weitere 1 ml des Freisetzungsmediums wurde mit Testagonisten und Zellen für 2 Stunden bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2, 95% Luft inkubiert. Nach der Freisetzungszeitraum wurde das konditionierte Medium abgesaugt und zur Entfernung nicht-adhärenter Zellen zentrifugiert. Zelluläre Gesamt-Gehalt an Peptid wurde durch Kochen in 1 ml in destilliertem Wasser extrahiert. Konditionierte Medien und Zellextrakte wurden bei -70 ° C gelagert, bis sie für die Peptid-Gehalt untersucht [30].
Peptide Messung
Somatostatin-Konzentrationen wurden durch Radioimmunoassay (RIA) mit Antiserum K2 bewertet, wie zuvor [39] beschrieben. Die halbmaximale Hemmung der Bindung erfolgte bei 2 fmol /Röhrchen, und die Intra-Assay und Inter-Assay Variation wurden 7% und 8% Prozent. Amylin-Konzentrationen wurden durch direkten ELISA (Halbinsel Laboratories, Belmont, CA, USA) gemessen werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Der Test hat eine Reichweite von 0,04 bis 2 ng /ml, und Intra-Assay und Inter-Assay-Variation von < 5% und < 14% betragen. Der verwendete Antikörper hat 100% Kreuzreaktivität mit Amylin und Amylin-amid aber < 1% Kreuzreaktivität mit CGRP und vernachlässigbare Reaktion mit anderen biologisch aktiven Peptiden. Alle Versuchsproben von einem einzigen Tier Zubereitung wurden in der gleichen RIA oder ELISA untersucht.
Statistical analysis
Peptidfreisetzung während der 2-Stunden-Zeitraum wurde als Prozentsatz der gesamten Zellgehalt (TCC) dieses Peptid exprimiert. Jede Versuchsbedingung wurde in Doppelbestimmung und die Ergebnisse von einem einzelnen Tier Herstellung getestet wurden als N = 1. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM von 3-6 getrennten Tierpräparaten exprimiert werden. Jede 24-Well-Platte enthalten immer die Kontrolle (basal) Brunnen und positive Stimulanzien. Peptidfreisetzung von Stimulanzien wurde im Vergleich zum Basalfreisetzung auf der entsprechenden 24-Well-Platte. Einweg-Varianzanalyse und Student-gepaarter t-Test wurden verwendet, Bedeutung zu bestimmen. Ein P
Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen
Liste der Abkürzungen
CCK.
Cholecystokinin
ECL-:
enterochromaffinen-


GLP-1:
Glucagon-like peptide-1
IAPP:
Inselchen amylioid Polypeptid
IBMX:
Isobutylmethylxanthin
PKC:
Proteinkinase C
PMA:
Phorbol-12-Myristat -13-Acetat, TCC, Gesamtzellinhalt.
Erklärungen
Acknowledgments
Diese Arbeit teilweise für ILPB von einem Medical Research Council Ausbildung Gemeinschaft unterstützt wurde. Einige der
Daten wurden '
im Folgenden sind die Autoren die Links Original eingereichten Dateien für Bilder' eingereichten Originaldateien für Bilder in abstrakter Form an der United European Gastroenterology Week in Birmingham 1997
Autoren vorgestellt. 12899_2003_47_MOESM1_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12899_2003_47_MOESM2_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 2 12899_2003_47_MOESM3_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 3 12899_2003_47_MOESM4_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 4 Original-Datei '12899_2003_47_MOESM5_ESM.jpeg Autoren für Abbildung 5 12899_2003_47_MOESM6_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für 6 Beiträge der Autoren
ILPB konzipiertes und die Studie entwickelt, führte die Zellisolierung, Kultur, Freisetzungsversuche, Immunoassays und schrieb Entwurf und Endfassung des Manuskripts. Der späte JC konzipierte die Studie und Co-Autor des ersten Manuskripts Entwurf.

• Risikofaktoren für die Tiefe der Infiltration in den frühen Magenkarzinom unterschieden gedrückt: eine vorläufige analysis
• Differentielle Genexpression in der murinen Magenfundus interstitiellen Cajal-Zellen fehlt