Regulação da libertação de amilina de coelho cultivadas gástrica Regulamento fúndica mucosa cells

da libertação de amilina de coelho cultivadas células da mucosa fúndica gástricas da arte abstracta
Fundo
Amylin (polipeptídeo amilóide das ilhotas) é uma hormona com papéis sugeridos na regulação da glicose homeostase, motora gástrica e função secretória e gastroproteção. No amilina mucosa gástrica é encontrado co-localizada com somatostatina na D-cells. Os fatores que regulam a libertação de amilina gástrica são desconhecidos. Neste estudo nós investigamos a regulação da libertação de amilina a partir de células da mucosa gástrica em cultura primária. Células da mucosa fúndica de coelho enriquecido com D-células por elutriação de contracorrente foram cultivadas durante 40 horas. A amilina e somatostatina libertação ao longo de 2 horas, em resposta a agonistas foram avaliadas. Os resultados

libertação de amilina foi significativamente aumentado por activação da proteína cinase C com forbol-12-miristato-13-acetato de etilo, a adenilato-ciclase com forscolina e de elevação cálcio intracelular com A23187. A colecistoquinina (CCK), epinefrina e glucagon-like peptide-1 (GLP-1) cada estimularam a libertação de amilina de uma forma dependente da dose. libertação máxima a CCK-estimuladas era maior do que qualquer epinefrina ou de GLP-1, mesmo quando os efeitos dos dois últimos foram reforçados por isobutilmetilxantina. libertação de amilina estimulada foi significativamente inibida pelo carbacol (por 51-59%) e octreótido (por 33-42%). liberação de somatostatina paralelo ao da amilina.
Conclusões
O modelo D-cell cultivadas fornece um meio de estudar libertação de amilina. secreção de amilina estimulada por receptor-dependente e independente de activação de Ca 2 + /proteína-quinase C e adenilato ciclase vias. Inibição envolve a activação dos receptores muscarínicos e auto-regulação pela somatostatina.
Fundo
Amylin (polipeptídeo amilóide das ilhotas) é um peptídeo de 37 aminoácidos predominantemente expresso nas ilhotas pancreáticas de Langerhans [1, 2]. A amilina foi também localizada em todo o tracto gastrointestinal [3] e no cérebro [4]. trabalhos recentes muito tem-se centrado sobre a fisiologia da amilina de pâncreas; o péptido parece ser co-armazenado e co-segregada com a insulina em células B pancreáticas [5, 6], uma proporção menor é co-localizado com somatostatina em células pancreáticas D [7]. A amilina
se acredita funcionar como uma homeostase da glicose hormona reguladora. A amilina inibe a síntese de glicogénio basal e estimulada por insulina no músculo esquelético de rato [8, 9]; inibe a insulina, somatostatina e secreção de glucagon a partir de ilhotas pancreáticas isoladas e pâncreas perfundido intacta e reduz glucagon pós-prandial e secreção de insulina [10-12]. Amylin também podem contribuir para o controlo da glicemia, retardando o esvaziamento gástrico [13]. É além destas funções fisiológicas, acredita-se que a amilina para desempenhar um papel significativo na patogénese da diabetes mellitus. É o principal componente de depósitos amilóides nos ilhéus de pacientes com diabetes não-insulino dependente mellitus [1, 2] e deficiência de amilina pode contribuir a falha do controlo glicémico típico de diabetes dependente de insulina [14] e em estudos com animais própria amilina parece induzir a resistência à insulina [15].
uma variedade de efeitos fisiológicos sobre o tracto gastrointestinal, também têm sido descritos. A administração parentérica de amilina tem um efeito anorectant [13], para além de reduzir significativamente o esvaziamento gástrico [16]. A acção protectora contra gastropatia reserpine-, e induzida por serotonina tem sido descrita [17]. amilina intravenosa é um potente inibidor de basal, pentagastrina e 2-desoxi-D-glicose estimulada a secreção de ácido gástrico no rato [18] e a amilina reduz a secreção de ácido no estômago preparação rato isolado [19]. Um efeito estimulante sobre a gastrina de soro também foi relatada, embora isto possa ter sido secundária para a inibição da secreção de ácido [20]. De acordo com estas acções da amilina-sítios de ligação foram detectados em rato mucosa fúndica gástrica [21]. Dentro do tracto gastrintestinal amilina parece co-localizam com outros péptidos gastrointestinais. Usando a hibridização in situ
, imunofluorescência e imunocitoquímica, Mulder et ai
mostrou predominantemente que a amilina co-localizada com somatostatina nas células D de rato e ratinho mucosa antral e mucosa fúndica de rato [22]. Uma minoria de amilina co-localizado para populações distintas de células contendo gastrina no antro e as células contendo-PYY na região do fundo. Estudos em ratinhos PDX-1 deficiente (que não conseguem desenvolver células G) não demonstrou nenhuma alteração na expressão de amilina gástrica, confirmando a expressão predominante de amilina dentro de células D [23]. Estes dados que mostram a presença de receptores de amilina e amilina, juntamente com os efeitos farmacológicos, sugerido que a amilina pode ter um parácrina e /ou endócrina papel regulador e fisiopatológica na mucosa gástrica. No entanto não existem estudos que exploram os processos envolvidos na secreção de amilina gástrico. Esses dados são um pré-requisito para uma maior compreensão da fisiologia amilina gástrico. As culturas primárias de células endócrinas gástrico e intestinal foram utilizados para examinar o controlo fisiológico e fisiopatológico de vários péptidos gastrointestinais, incluindo a gastrina, somatostatina, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) e a colecistocinina (CCK) [24-30]. A co-localização de amilina com somatostatina faz com que a preparação de D-célula fúndica gástrica um modelo útil para analisar o controlo da secreção de amilina no nível celular.
No presente estudo examinámos receptor-dependente e independente de receptor de regulação de amilina secreção de coelho cultivadas células da mucosa fúndica gástricas. A colecistoquinina, glucagon-like peptide-1 e epinefrina estimularam a libertação de amilina de uma forma dependente da dose e o muscarínico carbacol agonista do receptor e receptor de somatostatina octreótido agonista inibida libertação de amilina. Somatostatina e libertação de amilina ocorreram em paralelo.

Resultados da estimulação independente de Receptor de libertação do péptido
Para avaliar inicialmente se libertação de amilina pode ser detectado a partir de culturas de células fúndica de coelho, foram utilizados estímulos independente de receptores potentes [ ,,,0],26] o teor total de células (TCC) de amilina na preparação de células de cultura (801 ± 151 fmol /poço) foi de aproximadamente 4 a 5 vezes mais baixa do que a somatostatina (3 768 ± 1325 fmol /poço). estimulação significativa de libertação de amilina ocorreu com o éster de forbol activo (forbol-12-miristato-13-acetato, PMA) que activa a proteína cinase C (PKC), a activação da adenilato-ciclase com forscolina e de elevação do cálcio intracelular com o ionóforo A23187 (Figura 1). O éster de forbol foi o estimulante mais potente, levando a 8,5 vezes de aumento na libertação de amilina (basal liberar 2,14 ± 0,8%, aumentando para 18,5 ± 1,4% do TCC). Forskolin aumento da liberação de 3,3 vezes (libertação máxima de 7,2 ± 1,4% do TCC) e A23187 em 1,8 vezes (3,8 ± 0,5% TCC), estes eram marcadamente menos potente do que o PMA. Não houve diferenças significativas entre os padrões de somatostatina e de libertação de amilina (Fig. 1). A Figura 1 estimulação independente de receptor de amilina (topo) e somatostatina (inferior) a partir de células cultivadas D. As células foram estimuladas com forbol-12-miristato-13-acetato de 100 nM (PMA), forscolina 10 uM (FSK) e A23187 1 uM durante 2 horas. Resultados expressos em% do conteúdo da célula de péptido libertado, média ± SEM, ** P Art < 0,01 vs. controlo, * P Art < 0,05 vs. controlo.
Estimulação dependente do receptor
Estudos anteriores demonstraram que a CCK é um potente estimulante da libertação de somatostatina [26]. Isto foi confirmado aqui. CCK dependente da dose, estimularam a libertação de amilina das células cultivadas (Figura 2). estimulação máxima, um aumento de 2,75 vezes, de 2,1 ± 0,7% de libertação basal aumentada para 5,9 ± 0,8% TCC, ocorreu com CCK 10 nM. Um padrão de resposta à dose semelhante foi observado para a libertação de somatostatina estimulada por CCK embora libertação máxima foi relativamente maior para a somatostatina (4,4 vezes, 1,1 ± 0,1% para 5,2 ± 0,7% TCC) de amilina (Figura 2). Figura 2 amilina estimulada pela CCK (topo) e somatostatina libertação (parte inferior) do D-células cultivadas. células da mucosa em cultura foram estimuladas com CCK durante 2 horas. Resultados expressos em% do conteúdo da célula de péptido libertado, média ± SEM, * P Art < 0,05 vs. controlo.
A activação dos receptores acoplados a adenilato-ciclase com, quer epinefrina ou glucagon-like peptide-1 levou a um pequeno aumento, dependente da dose, tanto somatostatina (aumento máximo de 1,44 e 1,35 vezes, respectivamente) e libertação de amilina (1,36 e 1,25 vezes, respectivamente e) (Figuras 3 e 4). Figura 3 Efeito de epinefrina em amilina (topo) e somatostatina libertação (parte inferior) do D-células cultivadas. As células foram estimuladas com concentrações crescentes de epinefrina (EPI), na presença ou ausência de isobutilmetilxantina 100 uM (IBMX) durante 2 horas. Resultados expressos em% do conteúdo da célula de péptido libertado, média ± SEM, * P Art < 0,05 vs controlo. Figura 4
efeito do glucagon-like peptide-1 on amilina (topo) e somatostatina libertação (parte inferior) do D-células cultivadas. As células foram estimuladas com concentrações crescentes de glucagon-like peptide-1 (GLP), na presença ou ausência de isobutilmetilxantina (IBMX 100 uM) durante 2 horas. Resultados expressos em% do conteúdo da célula de péptido libertado, média ± SEM, * P Art < 0,05 vs. controlo.
As respostas a epinefrina e GLP-1 foram aumentada por co-administração com o inibidor da fosfodiesterase isobutilmetilxantina (IBMX) (100 uM). libertação de amilina basal foi de 2,0 ± 0,2% TCC e libertação máxima IBMX-aumentada de 3,2 ± 0,2% TCC com adrenalina a 100 mM e 3,2 ± 0,3% TCC com GLP-1 a 10 nM. liberação de somatostatina basal (1,1 ± 0,1% TCC) aumentou para 2,7 ± 0,1% TCC com epinefrina + IBMX e 2,1 ± 0,4% TCC com GLP-1 + IBMX. Estes ainda eram significativamente menos de libertação estimulada por CCK. Não houve diferenças no padrão ou relação de somatostatina e amilina respostas (Figuras 3 e 4).
Regulação inibitória da libertação de amilina
O tratamento com o octreotide somatostatina analógico produzido pequenas, mas não significativas reduções tanto amilina basal ( 14%) e somatostatina basal (18%) de secreção (Figura 5). O carbacol não teve qualquer efeito óbvio de ambos amilina basal ou a secreção de somatostatina (Figura 5). libertação de amilina de CCK-estimulada foi significativamente inibida por octreótido (42%) e o agonista muscarínico carbacol (51%). Da mesma forma epinefrina (com IBMX) estimulada por libertação de amilina foi inibido por 33% pelo octreotido e 59% por carbacol (ambos P
< 0,05). Como mostrado na Figura 6, um padrão similar foi observado com libertação de somatostatina. Figura 5 Efeito de octreotida e carbacol em amilina e somatostatina libertação basal de células-D em cultura. D-células foram estimuladas com 10 nM de octreótido (OCT) ou carbacol 100 pM (CBH) durante 2 horas e a libertação de amilina e somatostatina avaliada. Resultados expressos como% de teor de células de péptido libertado, média ± SEM.
Figura 6 Efeitos inibidores de octreotida e carbacol em amilina estimulada pelo agonista (topo) e somatostatina libertação (parte inferior). D-células foram estimuladas com 10 nM de CCK ou epinefrina com isobutilmetilxantina ambos 100 uM (EPI) em combinação com octreotida 10 nM (OCT) ou carbacol 100 pM (CBH) durante 2 horas. Resultados expressos em% do conteúdo da célula de péptido libertado, média ± SEM, * P Art < 0,05 libertação estimulada por agonista vs relevante.

Discussão Este é o primeiro estudo para analisar a libertação de amilina de mucosa gástrica, ao nível celular. Os resultados demonstraram que a amilina não só foi armazenado em células da mucosa gástrica, mas também que os agonistas fisiológicos putativos regulada libertação do péptido. Estudos anteriores localizada amilina para o estômago usando Northern blotting [31, 32], imunocitoquímica [33], radioimunoensaio [3] e in situ
hibridação [22], mas a libertação de amilina gástrica não foi demonstrada anteriormente.
a maioria dos amilina fúndica gástrico parece estar localizada com somatostatina dentro D células-[22] Portanto, temos usado o modelo D-cell coelho cultivadas para investigar os agentes controladores de libertação celular de amilina e comparar isso com somatostatina secreção.
os estudos iniciais foram realizados com agentes potentes conhecidos para activar directamente a secreção de peptídeo a partir de células endócrinas de um modo independente do receptor [26] ésteres de forbol (PMA tal) activar directamente a proteína quinase C na camada interna da membrana celular; Isto por sua vez activa os processos celulares necessários para a exocitose. PMA foi um potente estimulante tanto da secreção de somatostatina e amilina. O ionóforo de cálcio A23187, que aumenta os níveis de cálcio intracelular ([Ca 2 +] i]) também estimularam a libertação de amilina, embora foi significativamente menos potente do que o PMA. Isto é semelhante às respostas observadas nos antral humano [26] e D-células fúndica canina [30] onde é acreditam que o aumento na [Ca 2 +] i é principalmente facilitadora em vez de estimular directamente a secreção. activação directa de adenilato-ciclase com forscolina também estimularam a libertação de amilina. Por conseguinte, os estudos iniciais demonstraram que a libertação de amilina pode ser estimulada por activação de uma das duas principais vias de sinalização intracelulares conhecidos por aumentar a secreção de péptido. Tendo determinado que estas vias foram activo, exploramos agentes fisiológicos que pode estimular a secreção de amilina de um modo dependente do receptor.
Colecistoquinina-8 produziu um aumento dependente da dose na secreção de amilina e somatostatina. CCK é conhecido por ser um potente in vitro
estimulante da libertação de somatostatina de células D-antrais e fúndica [26, 30, 34]. Uma resposta à dose semelhante foi observado para a amilina, embora o incremento global era ligeiramente maior para a somatostatina do que a amilina. serão necessários mais estudos para determinar se isso representa uma piscina separada da somatostatina especificamente secretado após a estimulação com CCK. -D fúndica células parecem expressar ambos os receptores CCK-1 (CCK A) e CCK-2 (gastrina /CCK B) [35]. A activação destes receptores provoca a activação de fosfolipase C, a libertação de diacylglerol e inositol 1,4,5-trifosfato e a subsequente elevação da [Ca 2 +] i e a activação de PKC, levando à libertação do péptido [36 ]. Estes resultados são consistentes com os resultados para a estimulação com PMA e A23187. Por conseguinte, afigura-se que a CCK pode funcionar como um estimulante fisiológico da libertação de amilina.
Epinefrina e de GLP-1 produzida pequenos aumentos dependentes da dose na secreção de amilina e somatostatina. Este efeito poderia ser aumentada por co-tratamento com o inibidor da fosfodiesterase IBMX, o que inibe a quebra de cAMP e amplifica as respostas geradas por receptores acoplados de ciclase de adenilato. No entanto, as respostas foram ainda significativamente menor do que as observadas com a activação do Ca percurso de 2 + /PKC por qualquer CCK ou PMA. Diferenças semelhantes nas sensibilidades foram descritos em antral humano [26] e fúndica canina [30] D-células.
As influências inibidoras predominantes descritos até agora em células-D fúndica são agonistas muscarínicos [37, 38] e por auto-regulação somatostatina em si [39, 40]. As respostas aqui relatados estão em consonância com os dados sobre a libertação de somatostatina a partir de células D-caninos fúndica [30, 37]. Em contraste, os receptores muscarínicos estão estimuladora de células D antrais [41], provavelmente reflectindo uma diferença específica em função. O presente estudo confirmou as ações inibidoras tanto da octreotide somatostatina-analógico e carbacol agonista muscarínico contra a libertação de somatostatina. A inibição semelhante de libertação de amilina estimulada foi visto. Isto sugere que a inibição in vivo da libertação de amilina
envolve entrada parassimpático e regulação autócrina por somatostatina.
Sob todas as condições estudadas somatostatina e foram amilina segregada em paralelo, como pode ser esperado se eles são co-armazenado em grânulos secretores. A insulina e a amilina são co-segregado a partir de culas pancreicas, a secreção ocorre normalmente em paralelo [42-44], mas a secreção diferencial tem sido relatada em modelos experimentais de diabetes mellitus [45, 46]. serão necessários mais estudos para definir melhor a relação entre a secreção e ações de amilina gástrica e somatostatina. Em ilhéus pancreáticos isolados os dois peptídeos parecem ter um papel de co-operatória na regulação da secreção de péptidos: imunoneutralisation combinada de amilina e somatostatina resultou em maior aumento da secreção de insulina e de glucagon do que a neutralização de, quer isoladamente [10]. Será interessante analisar se resultados semelhantes são vistos com funções gástricas.
Liberação pós-prandial de CCK intestinal e GLP-1 inibem o esvaziamento gástrico e secreção ácida [13, 47]. Estes efeitos são muito embora a ser ponderado pelo menos em parte, através de intermediários libertados a partir da D-célula, em vez de por inibição directa da célula parietal que segrega-ácido [48]. Acredita-se que a somatostatina foi o único intermediário, mas os resultados do presente estudo sugerem que a regulação parácrina pela amilina da parietal, ECL- e outras células do sistema endócrino pode ter um papel nas respostas integrativas para refeições. A inibição induzida pela amilina de histamina libertada a partir de ratos segmentos da mucosa fúndica in vitro
foi mediada através de aumento da libertação de somatostatina [19], mas usando um antagonista do receptor de somatostatina selectivo Rossowski et ai
mostraram in vivo em ratos que
um parte das ações de ácido-inibitório de ambos amilina eo adrenomedullin peptídeo relacionado eram-somatostatina independente [49]. As funções específicas de amilina em fisiologia gástrica requerem elucidação adicional, mas estes dados sugerem que a amilina é libertada localmente directamente capazes de regular funções de mucosa.
As respostas de epinefrina e carbacol sugerem que a inervação autonômica pode regular a secreção de amilina. O saldo global in vivo
dependeria então a entrada relativa dos sistemas adrenérgicos muscarínicos e estimulantes inibitórios, combinado com endócrino e parácrino local e fatores possivelmente luminais circulação.
Conclusão
Este estudo descreve a caracterização inicial de os factores que regulam a libertação de amilina gástrico. Nós demonstramos que a libertação de amilina pode ser estimulada por estimulação dependente do receptor de qualquer uma das Ca 2 + /PKC e a adenilato-ciclase /vias de AMPc e que os péptidos fisiologicamente relevantes e mediadores neurais pode aumentar a libertação de amilina. Isso apóia a hipótese de que a amilina pode módulo de função da mucosa gástrica. Este estudo confirma que as culturas de curto prazo de células enriquecidas por elutriation irá fornecer um modelo para explorar a liberação fisiopatológico da amilina gástrica e fornecer uma rota de compreender melhor o papel da amilina na regulação da motora gástrica e função secretora.
Métodos
Materiais
Matrigel foi obtido a partir de Universal Biologicals (Londres, Reino Unido), octreotida da Novartis (Surrey, Reino Unido) e F12 de Ham /meio de cultura de Eagle modificado de Dulbecco (50:50, v: v), glutamina, Hanks salina equilibrada e solução de soro fetal de vitela foram adquiridos de Gibco (Paisley, Reino Unido). Sulfatada colecistoquinina-8 (CCQ), o GLP-1 humano e todos os outros reagentes foram obtidos a partir de Sigma (Poole, Reino Unido).
Isolamento e cultura celular
As culturas primárias de células da mucosa gástrica de coelho fúndica enriquecidas em células D eram obtida conforme descrito anteriormente [39, 48]. Resumidamente, coelho mucosa fúndica de EDTA foi submetido a digestão com colagenase e sequencial. A suspensão de células resultante foi enriquecida para células D por elutatriation contracorrente utilizando um rotor Beckman padrão JE 5,0 como anteriormente descrito. A fracção enriquecida com células D foi ressuspenso em meio de cultura completo (meio F12 de Ham /Dulbecco modificado de Eagle cultura (50:50, v: v), contendo 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES pH 7,4, 0,22% de NaHCO 3, 10% de soro fetal de vitelo, 1 mg /l de hidrocortisona, 8 mg /l de insulina, 100 mg /l de penicilina, 100 mg /l de gentamicina, 100 mg /l de estreptomicina) e foram cultivadas em Matrigel-revestidas 24 placas de cultura de tecido [50] a uma densidade de 1 x 10 6 células /poço, durante 40 horas numa atmosfera de 5% de CO 2, 95% de ar a 37 ° C.
Datas Estudos
As células cultivadas foram lavadas três vezes em meio de libertação (solução salina equilibrada de Earl contendo 0,1% de albumina de soro de bovino, HEPES 10 mM, pH 7,4) para remover células mortas e não-aderente. Mais 1 ml de meio de libertação foi adicionado contendo agonistas de ensaio e as células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2, 95% de ar. Após o período de libertação, o meio condicionado foi aspirado e centrifugado para remover as células não-aderentes. conteúdo celular total de péptido foi extraído por ebulição em 1 ml de água destilada. Os meios condicionados e os extractos celulares foram armazenadas a -70 ° C até serem testadas quanto ao teor de péptido [30].
medição Péptido
concentrações de somatostatina foram avaliados por radioimunoensaio (RIA) com anti-soro K2, tal como descrito anteriormente [39]. metade da inibição máxima de ligação ocorreu em 2 fmol /tubo e a intra-ensaio e inter-ensaio de variação foram de 7% e 8% por cento, respectivamente. As concentrações de amilina foram medidos por ELISA directa (Península Laboratories, Belmont, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio tem uma gama de 0.04-2 ng /ml, e intra-ensaio e inter-ensaio de variação de < 5% e < 14%, respectivamente. O anticorpo utilizado tem 100% de reactividade cruzada com a amilina e amilina-amida mas < 1% de reactividade cruzada com CGRP e reacção negligenciável com outras péptidos biologicamente activos. Todas as amostras experimentais de uma preparação único animal foram ensaiadas na mesma RIA ou ELISA. A análise estatística

libertação do péptido durante o período de 2 horas foi expressa como a percentagem do teor total de células (TCC) de que o péptido. Cada condição experimental foi testado em duplicado e os resultados de uma preparação único animal foram considerados como N = 1. Os resultados são expressos como a média ± SEM de 3-6 animais preparações separadas. Cada placa de 24 poços sempre incluído controle (basal) poços e estimulantes positivos. libertação do péptido por estimulantes foi comparada com a libertação basal na placa de 24 poços relevante. one-way análise de variância e teste t pareado de Student foram usados ​​para determinar a significância. Um valor de P <
; 0,05 foi considerado significativo: Lista de abreviaturas
CCK:.
Colecistoquinina
ECL-:
enterochromaffin-like


GLP-1:
glucagon-like peptide-1
IAPP:
polipeptídeo ilhéu amylioid
IBMX:
isobutilmetilxantina
PKC:
proteína quinase C
PMA:
forbol-12-miristato -13-acetato, TCC, o conteúdo da célula total.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa de formação Medical Research Council para ILPB.
Alguns dos dados foram apresentados na forma de resumo na Semana Europeia United Gastroenterologia em Birmingham 1997.
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ILPB concebido e desenhado o estudo, realizado o isolamento de células, cultura, experiências de libertação, imunoensaios e escreveu projecto e as versões finais do manuscrito. O falecido JC concebeu o estudo e co-escreveu o primeiro rascunho manuscrito.

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