Asetus amyliinin vapautumista viljellyistä kaniinin mahalaukun fundic limakalvon cells

asetuksen amyliinin vapautumista viljellyistä kanin mahan fundic limakalvoilta
tiivistelmä
tausta
Amylin (saarekesolujen amyloidipolypeptidi) on hormoni, jossa ehdotetaan rooleja säätelyssä glukoosin homeostaasiin, mahalaukun moottori ja eritystoiminnan ja gastroprotection. Mahalaukun limakalvon amyliinistä löydetään yhteistyössä paikallistaa somatostatiinin D-soluissa. Sääteleviä tekijöitä mahalaukun amyliinistä julkaisu ei tunneta. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet sääntelyä amyliinityyppien vapautumisen mahalaukun limakalvon soluista primääriviljelmässä. Kanin fundic limakalvon soluja rikastettu D-soluihin Vastavirtaelutriaatiota viljeltiin 40 tuntia. Amyliini ja somatostatiinin vapautumista 2 tunnin aikana vastauksena agonisteja arvioitiin.
Tulokset
amyliini vapautuminen parantaa huomattavasti proteiinikinaasi C forboli-12-myristaatti-13-asetaatti, adenylaattisyklaasin forskoliinilla ja korkeus solunsisäisen kalsiumin A23187. Kolekystokiniini (CCK), epinefriini ja glukagonin kaltainen peptidi-1 (GLP-1), joista kukin stimuloitiin amyliinin vapautumista annoksesta riippuvaisella tavalla. Maksimaalinen CCK stimuloimaa julkaisu oli suurempi kuin joko adrenaliini tai GLP-1, vaikka vaikutukset kahden jälkimmäisen tehostettiin isobutyylimetyyliksantiinin. Stimuloitu amyliini vapautuminen estyi merkittävästi vuoteen karbakolin (by 51-59%) ja oktreotidi (by 33-42%). Somatostatiinin vapautumista paralleled että amyliinin.
Johtopäätökset
Viljelty D-cell malli tarjoaa keinon tutkia amyliinin vapautumisen. Amyliini eritystä stimuloivat reseptorin riippuvia ja riippumattaman aktivointi Ca 2 + /proteiinikinaasi C ja adenylaattisyklaasin polkuja. Inhibitio käsittää aktivointi muskariinireseptorien ja auto-sääntelyä somatostatiini.
Tausta
Amylin (saarekesolujen amyloidipolypeptidi) on 37 aminohapon peptidi ekspressoidaan pääasiallisesti haiman Langerhansin saarekkeissa [1, 2]. Amyliini on myös paikallistettu koko maha-suolikanavan [3] ja aivoissa [4]. Paljon viimeaikainen työ on keskittynyt fysiologian haiman amyliinityyppien; peptidi näyttää yhteistyötä varastoida ja yhteistyö erittyy insuliinin haiman B-soluissa [5, 6], pienempi osa on yhteistyössä paikallistaa somatostatiinin haiman D-soluissa [7].
Amylin uskotaan toimivat hormoni säätö- glukoosihomeostaasi. Amyliini estää pohjapinta ja insuliinistimuloidun Glykogeenisynteesin rotalla luustolihasten [8, 9]; se estää insuliini, somatostatiini ja glukagonin eritystä eristettyjen haiman saarekkeiden ja ehjä perfusoitiin haima ja vähentää kuluttua ateriasta glukagonin ja insuliinin eritystä [10-12]. Amyliini voivat myös edistää glukoositasapainon hidastamalla mahalaukun tyhjenemistä [13]. Se Lisäksi nämä fysiologiset tehtävät, amyliini uskotaan pelata merkittävä rooli patogeneesissä diabetes mellitus. Se on tärkeä komponentti amyloidisaostumia saarekkeiden potilailla, joilla on insuliinista riippuvainen diabetes mellitus [1, 2] ja puute amyliinin voi edistää epäonnistuminen glykeemisen kontrollin tyypillinen insuliinista riippuvainen diabetes [14], ja eläinkokeissa amyliini itsessään vaikuttaa aiheuttaa insuliiniresistenssiä [15].
erilaisia ​​fysiologisia vaikutuksia maha-suolikanavaan, on myös kuvattu. Parenteraalisesti amyliinin on anorectant vaikutus [13], lisäksi vähentää merkittävästi mahalaukun tyhjenemistä [16]. Protectant kanteen reserpine-, ja serotoniinin aiheuttamaa gastropathy on kuvattu [17]. Suonensisäinen amyliinistä on voimakas estäjä pohjapinta, pentagastriinin ja 2-deoksi-D-glukoosin stimuloimaa mahahapon eritystä rotan [18] ja amyliinistä vähennetään hapon erityksen eristettyjen hiiren vatsan valmistelussa [19]. Stimuloiva vaikutus seerumin gastriini on myös raportoitu, vaikkakin tämä voi olla toissijainen Hapon erityksen estyminen [20]. Sopusoinnussa näiden toimien amyliinin sitovaa kohtaa on havaittu rotan mahalaukun fundic limakalvon [21]. Maha amyliinistä näyttää yhteistyöhön paikallistaa muiden ruoansulatuskanavan peptidien. Käyttämällä in situ
hybridisaatio, immunofluoresenssilla ja immunosytokemia, Mulder ym
osoitti amyliinin pääasiassa yhteistyössä paikallistaa somatostatiinin D-soluissa rotan ja hiiren antral limakalvon ja rotan fundic limakalvon [22]. Vähemmistö amyliinin yhteistyön paikallistettu erillisiä populaatioita gastriini sisältävien solujen antrumiin ja PYY sisältävien solujen silmänpohjan. Tutkimukset PDX-1 hiirissä (joka ei kehity G-solut) ei osoittanut muutosta mahalaukun amyliinistä ilmaisun, vahvistaa hallitseva ilmaus amyliinin sisällä D-soluissa [23]. Nämä tiedot osoittavat läsnäolo amyliinin ja amyliinin reseptoreihin, yhdessä farmakologisia vaikutuksia, ehdotti, että amyliini voisi olla paracrine ja /tai hormonitoimintaa sääntely- ja patofysiologista rooli mahan limakalvon. Kuitenkaan ole tutkimuksia, joissa kartoitetaan prosessien mahalaukun amyliinistä eritystä. Tällaiset tiedot ovat edellytys lisää ymmärrystä mahalaukun amyliinin fysiologia. Primaariviljelmissä mahalaukun ja suoliston endokriiniset solut on käytetty tutkimaan fysiologisia ja patofysiologisia valvonta useita ruoansulatuskanavan peptidien, kuten gastriini, somatostatiini, glukagonin kaltainen peptidi-1 (GLP-1) ja kolekystokiniini (CCK) [24-30]. Kolokalisaation amyliinin kanssa somatostatiinin tekee mahalaukun fundic D-solun valmistamiseksi hyödyllinen malli tutkia valvonnan amyliinin erityksen solutasolla.
Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet reseptori-riippuvainen ja reseptori-riippumaton sääntely amyliinin eritystä viljellyissä kanin mahan fundic limakalvon soluja. Kolekystokiniini, glukagonin kaltainen peptidi-1 ja adrenaliini stimuloi amyliinistä vapautumista annoksesta riippuvaisella tavalla ja muskariinireseptoreihin agonisti karbakolikloridin ja somatostatiini reseptoriagonisti okreotidi estyy amyliinin vapautumista. Somatostatiini ja amyliinistä vapautuminen tapahtui rinnakkain.
Tulokset
Reseptori-riippumaton stimulaation peptidin vapautumisen
aluksi arvioida, amyliinistä vapautumista voitiin havaita viljelmistä kanin fundic solujen, voimakas reseptori-riippumaton ärsykkeisiin käytettiin [ ,,,0],26] Kokonaissolutiheys sisältöä (TCC) amyliinin viljellyissä solu- valmisteen (801 ± 151 fmol /kuoppa) oli noin 4-5 kertaa pienempi kuin somatostatiinin (3 768 ± 1325 fmol /kuoppa). Merkittävä stimulaatio amyliinin vapautumista tapahtui aktiivisen forboliesterillä (forboli-12-myristaatti-13-asetaatti, PMA), joka aktivoi proteiinikinaasi C: n (PKC), adenylaattisyklaasin aktivoinnin forskoliinilla ja solunsisäisten kalsiumin kanssa A23187 (kuvio 1). Forboliesteri oli voimakkain stimulantti, joka johtaa 8,5 kertainen lisäys amyliinistä vapautumisen (pohjapinta vapauttaa 2,14 ± 0,8% kasvaen 18,5 ± 1,4% TCC). Forskoliini lisääntynyt vapauttaa 3,3 kertaiseksi (maksimaalinen vapautuminen 7,2 ± 1,4% TCC) ja A23187 1,8 kertaiseksi (3,8 ± 0,5%: TCC), nämä olivat merkittävästi vähemmän tehokas kuin PMA. Ei ollut merkittäviä eroja malleja somatostatiinin ja amyliinityyppien vapautumista (Fig. 1). Kuva 1-reseptoriin riippumaton stimulaation amyliinina (ylhäällä) ja somatostatiini (alhaalla) viljellyistä D-soluissa. Soluja stimuloitiin forboli-12-myristaatti-13-asetaattia 100 nM (PMA), forskoliinia 10 uM (FSK) ja A23187 1 uM: ssa 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM, ** P
< 0,01 vs. kontrolli, * P
< 0,05 vs. kontrolli.
Receptor-riippuvainen stimulaation
Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CCK on voimakas stimulantti somatostatiinin vapautumista [26]. Tämä vahvistettiin täällä. CCK annoksesta riippuvalla stimuloitu vapautuminen amyliinin viljellyistä soluista (kuvio 2). Maksimaalinen stimulaatio, 2,75 kertainen lisäys, 2,1 ± 0,7% perusvapatumisen kasvoi 5,9 ± 0,8% TCC, tapahtui CCK 10 nM. Samanlainen annosvaste malli nähtiin CCK-stimuloidun somatostatiinin vapautumista, vaikka maksimaalinen vapautuminen oli suhteellisen suurempi somatostatiinin (4,4-kertaisesti, 1,1 ± 0,1%: sta 5,2 ± 0,7% TCC) kuin amyliini (kuvio 2). Kuvio 2 CCK-stimuloidaan amyliinina (ylhäällä) ja somatostatiini (alhaalla) vapautumista viljellyistä D-soluissa. Viljellyt limakalvon soluja stimuloitiin CCK: ssa 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM, * P
< 0,05 vs. kontrolli.
Adenylaattisyklaasin aktivointi-reseptorien joko epinefriiniä tai glukagonin kaltainen peptidi-1 johti annoksesta riippuvan pientä lisäystä sekä somatostatiinin (maksimaalinen lisäys 1,44 ja 1,35-kertaiseksi) ja amyliini julkaisu (1,36 ja 1,25 ja kertaiseksi) (kuviot 3 ja 4). Kuvio 3 vaikutus adrenaliini päällä amyliinina (ylhäällä) ja somatostatiini (alhaalla) vapautumista viljellyistä D-soluissa. Soluja stimuloitiin kasvavia pitoisuuksia adrenaliinin (EPI) läsnä ollessa tai puuttuessa isobutyylimetyyliksantiinin 100 uM (IBMX) 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM, * P
< 0,05 vs. kontrolli.
Kuvio 4 vaikutus glukagonin kaltaisen peptidi-1 amyliini (ylhäällä) ja somatostatiini (alhaalla) vapautumista viljellyistä D-soluissa. Soluja stimuloitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa glukagonin kaltaisen peptidi-1 (GLP) läsnä ollessa tai puuttuessa isobutyylimetyyliksantiinin 100 uM (IBMX) 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM, * P
< 0,05 vs. kontrolli.
Vastaukset adrenaliinin ja GLP-1 parannettiin samanaikaisen fosfodiesteraasiestäjä isobutyylimetyyliksantiinin (IBMX) (100 uM). Basal amyliinistä julkaisu oli 2,0 ± 0,2% TCC ja maksimaalinen IBMX-avusteinen release 3,2 ± 0,2% TCC kanssa adrenaliinin 100 uM ja 3,2 ± 0,3% TCC GLP-1 10 nM. Basal somatostatiinin vapautumista (1,1 ± 0,1% TCC) kasvoi 2,7 ± 0,1% TCC kanssa adrenaliinin + IBMX ja 2,1 ± 0,4% TCC GLP-1 + IBMX. Nämä olivat edelleen huomattavasti vähemmän kuin CCK stimuloimaa release. Ei ollut eroja rakenteessa tai suhde somatostatiinin ja amyliinityyppien vasteet (kuvat 3 ja 4).
Inhiboivat sääntely Amyliinin vapautumisen
Hoito somatostatiinianalogilla okreotidi tuotetaan pieni mutta ei merkittäviä vähennyksiä sekä perus- amyliini ( 14%) ja pohjapinta somatostatiinin (18%) erittymistä (kuvio 5). Karbakoli ei ollut selvää vaikutusta joko pohjapinta amyliinin tai somatostatiinin erittymistä (kuvio 5). CCK stimuloimaa amyliini vapautuminen estyi merkittävästi vuoteen oktreotidi (42%) ja muskariini agonistin karbakolin (51%). Samoin adrenaliini (jossa IBMX) stimuloidut amyliini vapautuminen estyi 33%: iin oktreotidia ja 59%: iin karbakolin (molemmat P
< 0,05). Kuten kuviossa 6 on esitetty, samanlaista mallia nähtiin somatostatiinin vapautumista. Kuva 5 vaikutus Oktreotidin ja karbakolikloridin perustason amyliini ja somatostatiinin vapautumista viljellyistä D-soluissa. D-soluja stimuloitiin joko oktreotidia 10 nM (MMA) tai karbakolille 100gM (CBH) 2 tuntia ja vapautumisen amyliinin ja somatostatiinin arvioitu. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM.
Kuva 6 inhiboivat vaikutukset Oktreotidin ja karbakolikloridin agonistilla stimuloiman amyliinina (ylhäällä) ja somatostatiini (alhaalla) julkaisu. D-soluja stimuloitiin joko CCK 10 nM tai adrenaliinin kanssa isobutyylimetyyliksantiinin sekä 100 uM (EPI) yhdistettynä oktreotidi 10 nM (MMA) tai karbakolille 100gM (CBH) 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan% solun sisällön peptidin vapautetaan, keskiarvo ± SEM, * P
< 0,05 vs. asiaan agonisti-stimuloitu vapautuminen.
Keskustelu
Tämä on ensimmäinen tutkimus tarkastella vapauttamista amyliinityyppien mahalaukun limakalvon solutasolla. Tulokset osoittivat, että amyliini paitsi varastoida mahalaukun limakalvon soluissa, mutta myös, että otaksuttu fysiologisia agonistit säädellä vapautumista peptidin. Aiemmat tutkimukset ovat lokalisoitu amyliinistä mahalaukkuun käyttämällä blottauksella [31, 32], immunosytokemiassa [33], radioimmunomääritys [3] ja in situ
hybridisaatio [22], mutta vapautuminen mahalaukun amyliinityyppien ei ole osoitettu aikaisemmin.
suurin osa mahalaukun fundic amyliinityyppien näyttää paikallistaa somatostatiini sisällä D-soluissa [22] Siksi olemme käyttäneet viljelty kani D-cell malli tutkimaan ohjaavia solujen vapautumista amyliinin ja verrata tätä somatostatiinin eritystä.
Alustavat tutkimukset suoritettiin voimakkaita aineita, joiden tiedetään suoraan aktivoida peptidi eritystä endokriinisten solujen reseptori-riippumattomalla tavalla [26] forboliesterit (kuten PMA) suoraan aktivoivat proteiinikinaasi C: sisäkerroksessa solukalvon; Tämä puolestaan ​​aktivoi solun tarvittavia prosesseja eksosytoosilla. PMA oli voimakas stimulantti sekä somatostatiinin ja amyliinistä eritystä. Kalsium A23187, mikä lisää tasoja solunsisäisen kalsiumin ([Ca 2 +] i]) myös kannustanut amyliinistä julkaisu, vaikka se oli merkittävästi vähemmän tehokas kuin PMA. Tämä on samanlainen kuin vasteita nähdään ihmisen antral [26] ja koiran fundic D-soluihin [30], jossa se on sitä mieltä, että nousu [Ca 2 +] i on pääosin edistävän pikemminkin kuin suoraan stimuloiva eritystä. Suora aktivointi adenylaattisyklaasin forskoliinilla myös edistänyt amyliinin vapautumista. Siksi alkuperäisen tutkimukset osoittivat, että amyliinistä vapautuminen voitaisiin edistää aktivoimalla jompikumpi kahdesta solunsisäinen signalointi reittien tiedetään lisäävän peptidin erittymistä. Päättää, että nämä reitit olivat aktiivisia, selvitimme joka fysiologiset aineet voivat stimuloida amyliinistä eritystä reseptori-riippuvainen tavalla.
Kolekystokiniini-8 tuotti annoksesta riippuvan kasvu amyliini ja somatostatiinin eritystä. CCK: n tiedetään olevan voimakas in vitro
stimulantti somatostatiinin vapautumista antral ja fundic D-soluihin [26, 30, 34]. Samanlainen annosvaste nähtiin amyliinistä, vaikka yleinen kasvu oli hieman suurempi somatostatiinin kuin amyliinistä. Lisätutkimuksia tarvitaan, onko tämä edustaa erillinen allas somatostatiinin nimenomaan erittyvän stimulaation jälkeen CCK. Fundic D-solut vaikuttavat ilmentävän sekä CCK-1 (CCK A) ja CCK-2 (gastriini /CCK B) reseptoreihin [35]. Aktivointi näihin reseptoreihin laukaisee aktivoitumista fosfolipaasi C, vapautumista diacylglerol ja inositoli 1,4,5-trisfosfaatti ja myöhemmin nousu [Ca 2 +] i ja aktivointi PKC, joka johtaa peptidin vapautumista [36 ]. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tuloksia A23187 ja PMA stimulaatiota. Siksi näyttää siltä, ​​että CCK voi toimia fysiologinen nautintoaine Amyliinin vapautumisen.
Adrenaliini ja GLP-1 tuotettu pieni annosriippuvaisen nousun amyliini ja somatostatiinin eritystä. Tätä vaikutusta voitaisiin tehostaa yhteistyötä käsittelemällä fosfodiesteraasiestäjä IBMX, joka estää cAMP jakautuminen ja vahvistaa vasteita syntyy adenylaattisyklaasin reseptoreihin. Kuitenkin vastaukset olivat edelleen huomattavasti vähemmän kuin ne nähnyt aktivoitumisen Ca 2 + /PKC reitin joko CCK tai PMA. Samanlaisia ​​eroja herkät on kuvattu ihmisen antral [26] ja koiran fundic [30] D-soluissa.
Vallitseva estävät vaikutukset ovat kuvattu tähän mennessä on fundic D-solut ovat muskariiniagonistien [37, 38] ja autoregulaatio by somatostatiinin itse [39, 40]. Vastaukset raportoitu tässä ovat sopusoinnussa tiedot somatostatiinin vapautumista koiran fundic D-soluihin [30, 37]. Sen sijaan, muskariinireseptoreihin ovat stimuloiva antral D-soluihin [41], mikä johtuu todennäköisesti tietty ero toiminto. Nykyinen tutkimus vahvisti estäviä vaikutuksia sekä somatostatiini-analogi oktreotidi ja muskariini- agonisti karbakolikloridin vastaan ​​somatostatiinin vapautumista. Samanlainen inhibitio stimuloidun amyliinityyppien vapautuminen nähtiin. Tämä viittaa siihen, että in vivo
eston amyliinityyppien vapautumisen liittyy parasympaattisen tulo ja autokriininen sääntelyä somatostatiini.
Kaikissa olosuhteissa tutkittu somatostatiini ja amyliinistä erittyi rinnakkain, koska voidaan odottaa, jos ne ovat yhteistyössä tallennettu eritysjyvästen. Insuliini ja amyliini ovat yhteistyössä erittyy haiman β-solujen eritys tapahtuu normaalisti rinnakkain [42-44], mutta ero eritys on raportoitu kokeessa malleissa sokeritaudin [45, 46]. Lisätutkimuksia tarvitaan määritellä tarkemmin suhdetta eritystä ja toimia mahalaukun amyliinin ja somatostatiini. Yksittäisissä haiman saarekkeiden kaksi peptidejä näyttää olevan osuuskunta säätelijänä peptidi eritykseen: yhdistetty imunoneutralisation amyliinin ja somatostatiinin suurempana parantamiseksi insuliinin ja glukagonin erittymistä kuin neutralointi yksinään [10]. On mielenkiintoista tutkia, onko samanlaisia ​​tuloksia nähdään mahalaukun toiminnot.
Aterian jälkeisiä vapautuminen suoliston CCK ja GLP-1 estänyt mahalaukun tyhjenemistä ja erityksen [13, 47]. Nämä vaikutukset ovat kuitenkin on meditated ainakin osittain kautta välituotteiden vapautuu D-solun sijasta suoraan estämällä happo-erittävien parietaalisolujen [48]. Uskottiin, että somatostatiinin oli ainoa väli- mutta tulokset nykyisen tutkimuksen mukaan paracrine asetuksessa amyliinistä parietal, ECL- ja muut endokriiniset solut voivat olla rooli integroiva vastauksia aterioita. Amylii- inhiboivan histamiinin vapautetaan rotan fundic limakalvon segmenttien in vitro
oli välittyvät lisääntynyt somatostatiinin vapautumista [19], mutta valikoivan somatostatiinireseptoripositiivisten antagonisti Rossowski ym
osoitti in vivo
rotilla että osa happo-estäviä vaikutuksia sekä amyliinin ja siihen liittyvä peptidi adrenome- olivat somatostatiini-riippumaton [49]. Erityinen roolit amyliinityyppien mahalaukun fysiologiassa vaativat vielä selvennystä mutta nämä tiedot viittaavat siihen, että paikallisesti vapautuu amyliinistä on suoraan kykenee säätelemään limakalvon toimintoja.
Vastaukset adrenaliinin ja karbakolille viittaavat siihen, että autonomisen hermotuksen voi säädellä eritystä amyliinin. Yleinen tasapaino in vivo
riippuisi suhteellisesta panos estävää muskariini ja stimuloivia adrenergisiin järjestelmät yhdistettynä verenkierrossa hormonitoimintaa ja paikallisten paracrine ja mahdollisesti luminaalinen tekijöistä.
Päätelmät
Tutkimuksessa kuvataan ominaispiirteiden sääteleviä tekijöitä mahalaukun amyliinin vapautumista. Olemme osoittaneet, että amyliinistä vapautuminen voidaan stimuloida reseptori riippuvaa stimulaatio joko Ca 2 + /PKC ja adenylaattisyklaasin /cAMP reittejä ja että fysiologisesti relevantti peptidit ja hermoston välittäjäaineiden voi parantaa amyliinin vapautumista. Tämä tukee oletusta, että amyliinistä voi moduuli mahalaukun limakalvon toimintaa. Tämä tutkimus osoittaa, että lyhyen aikavälin soluviljelmät rikastetaan elutrioimalla tarjoaa mallin tutustumiseen patofysiologisia vapautumista mahalaukun amyliinin ja tarjota reitin edelleen ymmärtää rooli amyliinityyppien säätelyssä mahalaukun moottorin ja eritystoiminnan. Tool Menetelmät
Materiaalit
matrigeelin saatiin Universal Biologicals (London, UK), oktreotidi Novartis (Surrey, UK) ja Hamin F12 /Dulbeccon modifioitua Eaglen viljelyväliaineessa (50:50, v: v), glutamiini, Hanks Balanced salt liuosta ja vasikan sikiön seerumia hankittiin Gibco (Paisley, UK). Sulfatoituja kolekystokiniini-8 (CCK), ihmisen GLP-1 ja kaikki muut reagenssit hankittiin Sigmalta (Poole, UK).
Cell eristämistä ja viljelyä
primaariviljelmät kanin mahan fundic limakalvon soluja rikastettu D-soluja saatu kuten on kuvattu aiemmin [39, 48]. Lyhyesti, kani fundic limakalvo alistettiin peräkkäinen EDTA ja Kollagenaasikäsittelyn. Saatu solususpensio rikastettu D-solujen vastavirtaelutrioinnilla elutatriation käyttäen Beckman JE 5,0 standardin roottorin kuten aiemmin on kuvattu. D-solun rikastettu fraktio suspendoitiin uudelleen täydelliseen viljelyalustaan ​​(Hamin F12 /Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (50:50, v: v), joka sisälsi 2 mM glutamiinia, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,22% NaHCO 3, 10% vasikan sikiön seerumia, 1 mg /l hydrokortisonia, 8 mg /l insuliinia, 100 mg /l penisilliiniä, 100 mg /l gentamysiini, 100 mg /l streptomysiiniä), ja niitä viljeltiin Matrigel-päällystetty 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille, [50] tiheydellä 1 x 10 6 solua /kuoppa 40 tunnin ajan atmosfäärissä 5% CO 2, 95% ilmaa 37 ° C: ssa.
Vapauta Tutkimukset
Viljellyt solut pestiin 3 kertaa vapautumisen väliaineessa (Earl tasapainotettua suolaliuosta, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia, 10 mM HEPES, pH 7,4) ja poistaa kuollutta ja tarttumattomat solut. Lisäksi 1 ml julkaisu alustaa lisättiin sisältävä testi agonistit ja soluja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO 2, 95% ilmaa. Julkaisun jälkeen ajan, käytetty elatusaine aspiroitiin ja sentrifugoitiin poistamaan tarttumattomat solut. Solun kokonais-pitoisuus peptidi uutettiin keittämällä 1 ml tislattua vettä. Elatusaine ja solu-uutteet säilytettiin -70 ° C: ssa, kunnes siitä määritettiin peptidin sisältö [30].
Peptide mittaus
somatostatiini pitoisuudet arvioitiin radioimmunomäärityksellä (RIA) antiseerumilla K2, kuten aiemmin on kuvattu [39]. Puolimaksimaalisen sitoutumisen inhibitio ilmeni 2 fmol /putki ja määrityksen sisäinen ja määritysten välinen vaihtelu oli 7% ja 8% prosenttia vastaavasti. Amyliini mitattiin suoralla ELISA: lla (Peninsula Laboratories, Belmont, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määritys on erilaisia ​​0,04-2 ng /ml, ja määrityksen sisäinen ja määritysten välinen vaihtelu < 5% ja < 14%: lla. Käytetty vasta-aine on 100% ristireaktiivisuutta amyliinin ja amyliinin-amidi mutta < 1% ristireaktiivisuutta CGRP ja vähäinen reaktio muiden biologisesti aktiivisten peptidien. Kaikki kokeellinen näytteitä yhden eläimen valmiste testattiin samalla RIA tai ELISA.
Tilastollinen
peptidi vapautuminen aikana 2 tunnin jakson aikana ilmaistiin prosenttiosuutena koko solun sisällön (TCC) mainitun peptidin. Kukin koetilalle testattiin kahtena ja tulokset yhdestä eläimen valmiste pidettiin N = 1. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM 3-6 erillisten eläimen valmisteita. Jokainen 24 kuoppalevylle aina mukana ohjaus (perus) kuoppiin ja positiivinen piristeitä. Peptidi vapautuminen stimulantit verrattiin pohjapinta julkistus asiaa 24 kuoppalevylle. Yksisuuntaisen varianssianalyysin ja Studentin parillista t-testiä käytettiin merkitsevyyden määrittämiseen. S P
arvo < 0,05 pidettiin merkittävänä.
Lyhenteet
CCK:
kolekystokiinin
ECL-:
enterochromaffin kaltainen


GLP-1:
glukagonin kaltainen peptidi-1
IAPP:
saarekesolujen amylioid polypeptidi
IBMX:
isobutyylimetyyliksantiinin
PKC:
proteiinikinaasi C
PMA:
forboli-12-myristaatti -13-asetaattia, TCC, solun koko sisällön.
julistukset
Kiitokset
Tätä työtä tukee osittain Medical Research Council koulutus apurahan ILPB.
Jotkut tiedot esiteltiin abstraktissa muodossa Yhdistyneissä Euroopan Gastroenterology Week Birminghamissa 1997
kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12899_2003_47_MOESM1_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12899_2003_47_MOESM2_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12899_2003_47_MOESM3_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12899_2003_47_MOESM4_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 12899_2003_47_MOESM5_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 12899_2003_47_MOESM6_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto luku 6 Kirjoittajien Osuudet
ILPB suunniteltu ja tutkimuksessa, joka suoritettiin solujen eristäminen, kulttuuri, vapautuskokeissa, immunomäärityksiä ja kirjoitti luonnosta ja lopulliset versiot käsikirjoituksen. Myöhään JC raskaaksi tutkimuksen ja yhteistyötä kirjoitti ensimmäisen käsikirjoituksen luonnos.

• Riskitekijöitä syvyys tunkeutuminen eriytetty masentunut aikaisin mahakarsinoo-: alustava analysis
• Differential geeniekspressiota hiiren mahan silmänpohjan puuttuu interstitiaalinen solujen Cajal