Karakterisering av magsäcks cellinjer etablerade från CEA424 /SV40 T-antigen-transgena möss med eller utan en mänsklig CEAtransgene

karakterisering av magsäcks cellinjer etablerade från CEA424 /SV40 T-antigen
-transgenic möss med eller utan en humant CEA
transgen Bild Sammanfattning
bakgrund
Gastric cancer är en av de vanligaste cancer världen. Patienter med magcancer på ett avancerat sjukdomsstadium har en dålig prognos på grund av den begränsade effekten av tillgängliga behandlingar. Därför är av yttersta vikt att utveckla nya terapier, som immunterapi för behandling av gastrisk cancer. Eftersom användbarheten av befintliga prekliniska modeller för utvärdering av immunterapier för gastric adenokarcinom är begränsad, var målet med denna studie att etablera murina in vivo
modeller som tillåter stegvis förbättring av immunterapier för magcancer.
Metoder
Eftersom inga murina magcancer cellinjer finns vi etablerade fyra cellinjer (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) från spontant utveckla tumörer CEA424 /SV40 T-antigen (CEA424 /Tag) möss och tre cellinjer härledda från dubbeltransgena avkommor av CEA424 /Tag möss parat sig med humant karcinoembryonalt antigen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) möss (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag är en transgen C57BL /6-mus stam härbärge Tag under kontroll av en -424 /-8 bp CEA genpromotor som leder till utveckling av invasiv adenocarcinom i den glandulära magen. Tumörcellinjer etablerade från CEA424 /Tag-CEA-möss uttrycker väldefinierade tumörantigenet CEA under kontroll av dess naturliga regulatoriska element.
Resultat
epiteliala ursprung tumörcellerna bevisades genom morfologisk kriterier, bland annat förekomsten av mucin inuti cellerna och expressionen av celladhesionsmolekyler EpCAM och CEACAM1. Alla cellinjer konsekvent uttrycker transgener CEA och /eller Tag och MHC klass I-molekyler som leder till deras mottaglighet för lys genom Tag-specifik CTL in vitro
. Trots presentationen av CTL-epitoper härledda från de transgena produkterna tumörcellinjer var tumörframkallande när inympade i C57BL /6, CEA424 /Tag eller CEA424 /Tag-CEA-transgena värdar och inga signifikanta skillnader i tumör ta och tumörtillväxt observerades i de olika värdar. Även om ingen spontan tumöravstötning observerades, vaccination av C57BL /6-möss med lysat från gastric carcinoma cellinjer skyddade C57BL /6-möss från tumör utmaning, som visar tumörbildning i tumörcellinjer i icke-transgen mus av H-2 b haplotyp.
Slutsats
Dessa tumörcellinjer ympade i olika syngeniska värdar skulle visa sig vara mycket användbar för att optimera immunterapi regimer för att slutligen testas i transgena djur utvecklar primära gastriska karcinom.
bakgrund
Gastric cancer är den näst vanligaste cancerformen i världen [1]. Det är ofta inte upptäcks förrän ett framskridet stadium; följaktligen 5-årsöverlevnaden är låg (10-20%). På grund av lokal invasion och metastas, strålningsterapi eller kemoterapi inte signifikant öka längden eller livskvaliteten för patienter med avancerad magsäckscancer. Därför behövs utveckling av nya neoadjuvant och adjuvant behandlingsmetoder. Immunterapi kan vara ett lovande alternativ. Ett antal immunterapi närmar som adoptiv överföring av tumörspecifika T-celler, och vaccination med användning av antingen odefinierade tumörantigener härledda från tumör lysat och tumörcellinjer eller definierade antigener tumör vanligen presenteras av dendritiska celler är under utvärdering för olika typer av cancer [2, 3] . För magcancer, var immunterapi inte tas på allvar hänsyn på grund av konceptet att magsäckscancer är dåligt immunogent. Därför har endast ett litet antal kliniska immunterapi försök rapporterats [4-7]. Dessutom har endast ett begränsat antal tumörassocierade antigener med potentiell användning för immunterapi identifierats [8-11]. Följaktligen är förmågan hos immunsystemet att känna igen och utrota gastric cancer i stort sett okänd. För att få insikt i effekten av olika immunterapier för behandling av magcancer och belysa den bakomliggande mekanismen av inducerade immunsvar djurmodeller av magcancer är oumbärliga.
För detta ändamål har flera grupper inklusive vårt nyligen etablerade transgena eller knacka utcheckning musstammar som utvecklar gastric adenom eller adenocarcinom i olika delar av magen efter olika latenser [12]. Vi har utvecklat en transgen magkarcinom C57BL /6 musmodell baserad på ett SV40 stort T-antigen (SV40 Tag) transgenen styrs av en humant karcinoembryonalt antigen (CEA) genpromotor (från -424 till -8 av translationsstartstället) [13 ]. I 100% av djuren, är dysplastiska crypt formation i magslemhinnan observerades i pyloric regionen redan 30 dagar gamla CEA424 /SV40 Tag-transgena möss. Dysplasi fortskrider till invasiva karcinom och vid dag 50 hela pyloric magslemhinnan har ersatts av karcinomceller. I åldern 90 till 110 dagar de transgena mössen blir döende och dör förmodligen undernäring på grund av blockering av pylorus [13]. Styrningen av Tag-expression genom en minimal CEA genpromotor tillåter tumörriktad expression av CEA genom att korsa CEA424 /SV40 Tag-transgena möss med humant CEA
-transgenic C57BL /6-möss, som uttrycker CEA transgenen i en liknande Spatiotemporal uttrycksmönster som återfinns hos människor [13, 14]. Den mänskliga tumörmarkör CEA uttrycks i många humana adenokarcinom, inklusive mer än 50% av gastriska karcinom [15, 16]. CEA används alltmer som målantigen för en mängd olika antikropps och cellmedierad tumörimmunterapi metoder [17-19]. CEA och Tag lämpliga immun målantigener sedan ett antal T-cellepitoper av dessa antigener har identifierats i C57BL /6 möss [20-22]. Även om dessa transgena musstammar spegla mycket nära gastriskt adenokarcinom utveckling hos människor, är experimenterande med dessa möss relativt tidsödande och dyrt på grund av de svårigheter att bestämma tumörtillväxt och kravet på avel transgena möss. Därför är det önskvärt att ha en syngen transplanterbar tumör systemet av gastriska adenokarcinom i immunkompetenta möss för optimering av en given immunterapi-protokoll innan den utvärderas i de transgena mössen. Här beskriver vi murina magcancer cellinjer etablerade från spontant utveckla tumörer av SV40 Tag-transgena möss som är tumörframkallande i både syngena vildtyp och transgena möss.
Metoder
musstammar och cellinjer sälja CEA424 /tag- transgena möss (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgena möss (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) och F1 möss från en korsning mellan CEA424 /Tag-transgena och CEA-transgena möss har tidigare beskrivits [13, 14]. Samtidigt de transgena linjerna har korsades till C57BL /6-möss (H-2 b) för mer än 15 generationer. De transgena linjer samt C57BL /6-möss (Charles River, Sulzfeld, Tyskland) avlades och hölls under standard patogenfria förhållanden i djuranläggningen av Institutet för Surgical Research, Ludwig-Maximilians-universitetet i München. Djurförsök genomfördes efter godkännande av den lokala djurskyddskommittén. För tumorigenicitetsprov och immunogenicitet analyser möss användes vid 8-12 veckors ålder. Afrikansk grön apnjure Cos7L cellinjen erhölls från American Tissue Culture CoUection (ATCC, Rockville, MD). BALB /c-härledda fibrosarkom Meth-A tillhandahölls vänligen av W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA-celler erhölls genom transfektion av Meth-A-celler med pRc /CMV-CEA expressionsplasmider använder FuGENE ™ 6 transfektionsreagens (Roche Molecular Biochemicals, Schweiz) enligt tillverkarens anvisningar. Meth-A-cTag och RBL5 /T transfektanter tidigare beskrivits [23] Upprättande av gastriska karcinom-cellinjer.
De gastriska karcinom som används för att fastställa tumörcellinjer erhölls från 8 olika, 13 veckor gamla möss. Fyra härrör från CEA424 /Tag-transgena möss och fyra från CEA424 /Tag-CEA-dubbeltransgena möss. Namnen på de cellinjer som härrör från den senare möss markeras med upphöjd "CEA". Alla odlingar utfördes i RPMI1640 utökat med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS "guld"; PAA Laboratories, Coelbe, Tyskland), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 | ig /ml streptomycin, icke-essentiella aminosyror och 1 mM natriumpyruvat (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), vidare hänvisat till som tumörmedium (TM). Tumörvävnader tvättades noggrant i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) supplementerad med 200 pg /ml gentamicin och 2,5 | ig /ml amfotericin B (GIBCO /Invitrogen), skuren i 1 mm 3 bitar med en skalpell och ströks ut i vävnadskultur kolvar innehållande TM. Odlingsmediet byttes var 3-4 dagar. Epitelceller och fibroblaster växer ut från de vävnadsfragment separerades genom cell skrapning, selektiv trypsinering och selektiv passaging med 1000 U /ml kollagenas och 500 U /ml hyaluronidas (Biochrom, Berlin, Tyskland). Under dissociation, var flaskorna övervakades under ett inverterat mikroskop och matsmältning stoppades när fibroblaster men inte epitelceller lösgjordes (trypsin) eller vice versa (kollagenas /hyaluronidas). Denna procedur upprepades varje vecka tills alla fibroblaster utslagen ur tumörcellkulturer. Under generering av 424GC cellinje var en fibroblast kultur etablerad från förorenande fibroblaster (424 fibroblaster). Sfäroider bildas inom 5-7 dagar efter sådd 0,5 × 10 3 mGC8 celler i Noble agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) -belagda 96-brunnars plattor (TPP-Biochrom, Berlin, Tyskland) i 200 | il TM som ersattes med färskt medium varannan dag. För att bedöma viabiliteten hos celler på ytan av sfäroiderna, var sfäroider inkuberades med FITC-märkt annexin V (Annexin V FITC Apoptos Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Tyskland) för detektering av apoptotiska celler eller med propidiumjodid för att identifiera nekrotisk celler enligt tillverkarens rekommendationer.
Flödescytometri analyser
för ytfärgning celler trypsinerades, tvättades med PBS och suspenderades i PBS /0,5% vikt /vol bovint serumalbumin (BSA) med tillsats av 0,02% vikt /volym natrium azid. För induktion av MHC-molekyler, inkuberades celler med 20 ng /ml av interferon-γ (IFNy; Peprotec, London, UK) under 24 timmar före skörd. Icke-specifik bindning av antikroppar till Fc-receptorer blockerades genom förinkubation av cellerna med 1 | j, g /10 6 celler av anti-CD16 /CD32 monoklonal antikropp (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland) under 15 min . Därefter inkuberades cellerna med 0,5 | j, g /10 6 celler av mAb av intresse för 30 min vid 4 ° C, tvättades två gånger, och i förekommande fall, därefter reagerade med en andra-steg-antikropp under 15 min vid 4 ° C . Cellerna tvättades två gånger och analyserades med en FACScan (BD, Mountain View, CA). Döda celler uteslöts genom propidiumjodidfärgning. Följande reagens och mAbs mot murina antigen från BD Pharmingen användes: fykoerytrin (PE) -konjugerad mus-IgG 2a anti-IA b biotinylerat mus-IgG 2a anti-H-2D b , PE-konjugerade mus-IgG 2aanti-H-2K b PE-konjugerat anti-mus CD80 /B7-1, PE-konjugerad rått-IgG 2a anti-mus CD40, PE-konjugerad rått-IgG 2a anti-mus CD86 /B7-2, fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugerad, armeniska hamster IgG 2 anti-mus CD80 /B7-1. FITC-konjugerad rått-IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugerad rått-IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugerade mus-IgG 2a anti-råtta SIRP, FITC-konjugerad armeniska hamster IgG 2anti-KLH och PE-konjugerad rått-IgG 2amAb tjänade som isotypkontrollerna. Mus-anti-mus CEACAM1 mAb CC1, råtta anti-mus CEACAM1 AgB10 [24] och råtta anti-mus E-cadherin och anti-mus EpCAM mAbs var en slags gåva från K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité Berlin, och P. Ruf, Trion Research, München, respektive. Den korsreaktiv mus-anti-human CEACAM mAb 4/3/17 (specifik för humant CEA /CEACAM5 i musen) köptes från GENOVAC (Freiburg, Tyskland). Murina antikroppar detekterades med PE-konjugerad get-anti-mus-IgG, rått-antikroppar med FITC-konjugerad åsne-anti-rått-IgG (DAKO).
Detektion av CEA och SV40 Tag genom Western blotting
Exponentiellt växande gastriska karcinomceller , Cos7L celler, Cos7L-CEA transfektanter, Meth-A-celler och Meth-A-cTag transfektanter som uttrycker en stympad cytoplasmatiskt ligger SV40 Tag skördades genom trypsinisering. Cellerna tvättades tre gånger i PBS och lyserades vid en densitet av 10 6 celler /ml i lysbuffert. Proteinkoncentration bestämdes med användning av BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Cellextrakt som motsvarar 10 | ig protein separerades med elektrofores genom 10% SDS-polyakrylamidgeler (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), som överförts till polyvinyliden fluoridmembran och inkuberades med 10 | j, g /ml anti-human CEACAM mAb 4/3/17 eller ett 1: 100 utspädd hamster anti-SV40 Tag antiserum (en slags gåva från K.-H. Scheidtmann, universitetet i Bonn). Bundna antikroppar bringades att reagera med pepparrotsperoxidas-märkta sekundära antikroppar och visualiserades med användning av ett kemiluminescens-baserat detektionssystem. (ECL; Amersham Biosciences Europé GmbH, Freiburg, Tyskland) Review Cell fördubblingstid bestämning
In vitro
fördubblingstider av cellinjerna bestämdes genom att stryka ut de gastriska karcinomceller i 24-brunnars plattor i TM vid de angivna utgångscellantal och räkning av cellprover från trippelbrunnar efter försiktig trypsinisering var 3 dagar i 21 dagar. In vivo
fördubblingstider beräknades från tumörvolymmätningar (se nedan) efter inokulering med tre olika startcellnummer (tre möss per grupp). Fördubblingstider beräknades från log-fasen av tillväxtkurvorna.
Tumörframkallande och immunogenicitet av cellinjerna
För tumorigenicitet för bedömning av tumörceller tvättades tre gånger i PBS och 50 fil av cellsuspensioner med de indikerade cellantalet injicerades subkutant i den rakade högra flanken av mössen. För att bestämma immunogeniciteten, 10 7 tumör celler /ml lyserades genom två på varandra följande frysning och upptiningscykler. Möss immuniserades fyra gånger med en veckas mellanrum med 10 6 lyserade tumörceller i den högra flanken. Tre veckor senare fick mössen genom subkutan injektion av 3 x 10 6 livskraftiga tumörceller i den vänstra flanken. Experimentgrupperna bestod av 4-6 möss. Tumörutveckling följdes av seriella mätningar av tumörstorlek och tumörvolymen beräknades i enlighet med ekvationen: tumörvolym (mm 3) = d 2 × D /2, där d och D var den kortaste och den längsta tumördiameter, respektive. Djur avlivades när tumörerna nått en volym av 300 mm 3.
Generering av Tag-specifika cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och stimulering av gastriska karcinomcellinjer
CTL genererades såsom tidigare beskrivits [23] . Kortfattat, möss intradermalt ympades med 1 pm guldpartiklar belagda med en Tag expressionsplasmid (BMG /CT-Ag.1 [23]) i den rakade buken huden med en heliumtryck (200 psi) drivs biolistiska anordningen (Helios genkanon; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Tyskland). Mjältceller erhållna 14 dagar efter vaccination återstimulerades med veckointervall med bestrålat RBL5 /T-transfektanter i RPMI-1640/10% FCS kompletterat med 30 lU /ml IL-2. RBL5 /T är en Rauscher-virus-transformerade T-lymfom-cellinje härledd från en C57BL6 (H-2b) mus transfekteras med en SV40 Tag expressionsplasmiden. För att generera epitop-specifika CTL, mjältceller tas 10 dagar efter vaccination återstimulerades in vitro med bestrålade, Tag peptid pulsade RBL5 celler. T1, T2 /3 och T4-epitop specificiteten för CTL reglerades genom bestämning av IFNy innehållet i medier efter stimulering med peptidpulsade målceller med hjälp av ELISA.
Cytokine detektering genom ELISA
För infångning och detektion av IFNy i supernatanterna genom konventionell sandwich-ELISA, använde vi mAb R4-6A2 och biotinylerad mAb XMG1.2, respektive (BD Pharmingen). Utplåning analyserades vid 405/490 nm på en TECAN mikro ELISA-avläsare (TECAN Crailsheim, Tyskland) med EasyWin programvara (TECAN). Detektionsgränsen för ELISA för IFNy var 20 pg /ml.
Resultat
Upprättande och fenotypen av magcancer cellinjer
8 magcancer prov 7 cellinjer kunde fastställas. Fyra cellinjer härleddes från CEA424 /Tag-transgena möss (424GC från en manlig mus, mGC3, kvinnlig, mGC5, manlig, och mGC8, hona) och tre rader från CEA424 /Tag-CEA-transgena möss (mGC2 CEA, manlig, mGC4 CEA, manlig, mGC11 CEA, hona). Den tid som behövs för att få rena epitelceller cellkulturer varierade kraftigt (medelvärde 6 månader, intervall 3-16 månader). Även om tumörcellerna växa som vidhäftande celler i odling, tenderar de att bilda aggregat i stället för att sprida över odlingssubstratet (Fig. 1A). Den epitelursprung av tumörcellerna hade dokumenterats genom morfologiska kriterier, bland annat av närvaron av mucin inuti cellerna (Fig. 1 A) och expressionsanalys av protein som vanligen uttrycks i epitelceller (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (Fig. 2A) . En reducerad halt av mucin hittades i alla cellinjer jämfört med innehållet i normala gastriska epitelceller men liknar den som finns i tumörceller inom den gastriska karcinom i transgena möss (Fig. 1A och [13]). Alla cellinjer visas CEACAM1 och EpCAM på sin yta med undantag mGC11 CEA, ingen av dem uttryckte E-cadherin (Fig. 2A och data ej visade). Alla cellinjer uttryckte MHC klass I H-2K och, och vid en mycket lägre nivå, H-2D-molekyler (Fig. 2B). Uttryck av båda proteinerna starkt förbättras genom IFNy stimulering. Inget uttryck av MHC klass Il-molekyler (I-Ab) detekterades (Fig. 2B och data ej visade). CD54, CD80, CD86 eller CD95 upptäcktes inte på någon cellinje (data visas ej). Figur 1 morfologi magcancer-cellinjer odlas som monoskiktkulturer eller som tredimensionella sfäroider. (A) Cellinjerna visar en något annorlunda epitelial morfologi. De flesta celler i alla cellinjer innehåller en karakteristisk intracellulär vakuolen (pilar) som sannolikt innehåller mucinous material färgas röd av PAS-metoden (sista bilden rätt i lägre panelen). (B) Sfäroid bildas genom odling mGC8 tumörceller på mjuk agar: vänster, faskontrast; höger, fluorescensfärgning av nekrotiska celler med propidiumjodid (röd) och apoptotiska celler med FITC-märkt annexinV (grön, markerade med pilspetsar) såsom beskrivs i "Material och metoder". Förstoring: reglagen motsvarar 10 um. MGC, murin magkarcinom.
Figur 2 Cellyteexpression av epiteliala markörer (A) och MHC klass I och Il-molekyler (B). Magkarcinom cellinjer bringades att reagera antingen med PE-märkta (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) eller med omärkta mAb (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM) följt av inkubation med PE-märkt anti-mus-IgG eller FITC -märkt anti-rått-IgG och analyserades med flödescytometri. Histogram visar de resultat som erhållits med antikroppar mot relevanta antigener med (öppen grå) eller utan (öppen svart) innan IFNy stimulans och irrelevanta antigener (grå fyllda kurvor).
För att avgöra potentialen i de cellinjer som skall användas för generering av tredimensionella tumörmodeller vi analyserat tumörcell sfäroid bildning in vitro. Såsom illustreras i fig. 1B cellinjerna bildade kompakta tumörcell sfäroiderna efter 8 dagars odling när 103-celler såddes i mjuk agar-belagd 96-brunnsplattor. Endast mindre inom experimentell variation observerades om storleken på sfäroider. Färgning med propidiumjodid och FITC-märkt annexin V visade att åtminstone ytskiktet av sfäroiderna bestod av viabla celler med mycket få döda celler fäst vid den (Fig. 1B).
Transgen expression av de gastriska karcinom-cellinjer
CEA och Tag kan fungera som tumörspecifika antigener (TSA) eller tumörassocierade antigener (TAA) efter transplantation av nybildade tumörcellinjer i immun syngena C57BL /6 och CEA- eller Tag-transgena möss, respektive. Även instrumentala i tumörbildning, är Tag transgenexpression inte alltid finns i tumörcellinjer härledda från Tag-transgena möss, som i TRAMP tumörcellinjer [25]. Detta fick oss att analysera uttryck och MHC klass I-begränsad presentation av Tag transgen liksom uttrycket av CEA i de etablerade magkarcinom cellinjer. CEA cellytan uttryck analyserades i cellinjer härledda från mag tumörer från dubbeltransgena möss genom flödescytometri och Western blot-analys. Medan uttrycket av CEA transgenen regleras av den fullständiga promotorregionen av den humana CEA-genen uttrycket av Tag styrs av en minimal -424 /-8 bp CEA-promotorn (Fig. 3A). Alla tre dubbeltransgena cellinjer uttryckte CEA på cellytan (Fig. 3B). I den gastriska karcinom cellinjen mGC2 CEA transgen-uttryckta CEA uppvisade en molekylvikt av 180 kDa som liknar den som finns i SV40-transformerade afrikanska gröna apnjurceller stabilt transfekterade med en CEA-expressionsvektor och till CEA hittas i människor. Som väntat var ingen CEA detekteras i 424GC celler, som fastställdes av en CEA-negativ Tag-transgen mus (Fig. 3C). Tagg befanns uttryckas genom Western-blotting och immunfluorescens-analys i alla cellinjer härledda från enkelt och dubbeltransgena möss (Fig. 3D och data ej visade). Detta fynd stöder också ursprunget av cellinjerna från magsäcken karcinom. Vidare 424GC cellinjen effektivt presenteras endogent bearbetade Tag-härledda peptider, särskilt T1 epitopen, i en MHC-I-begränsat sätt såsom bestäms genom induktion av IFNy-sekre byTag-specifik CTL (Fig. 4A). Dessutom var cellinjerna effektivt dödas av Tag-specifika CTL i cytotoxiska analyser (Fig. 4B). Figur 3 Expression av CEA och Tag av magcancer cellinjer härledda från CEA424 /tag- eller CEA424 /Tag × CEA-transgena möss. (A) struktur CEA och CEA424 /Tag transgener. Exonerna 1-10 av den humana CEA-genen som ingår i insatsen av kosmidklonen cosCEA1 [14] visas som färgkodade lådor (ljusblå, ledare, röd, IGV-liknande domän, blå IGC-liknande domän, grå, transmembrandomänen ,.. vit, 5 'och 3'-otranslaterade regionexoner Kompletterande vektorsekvenser anges som svarta lådor Placeringen av CEA minimal promotor närvarande i SV40 Tag genen transgen indikeras med streckade linjer, är namnen på de transgena linjer visas i vänstermarginalen. (B) Flödescytometri utfördes genom märkning av de angivna cellerna antingen med CEA-specifika mAb 26/3/13 (fyllda kurvor) eller en isotypmatchad antikropp (öppna kurvor) följt av PE-märkt get anti-mus-IgG-antikroppar. (C, D) för Western-analys, 10 | j, g av totalt protein från extrakt av 424GC eller mGC8 celler etablerade från CEA424 /TAG-transgena möss och mGC2CEA och mGC4CEA celler från CEA424 /Tag × CEA-transgena möss var storlek separeras genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores, överfördes till ett membran och bringas att reagera med CEA-specifika mAb 26/3/13 (C) eller hamster polyklonala anti-märkningsantikroppar (D). Extrakt från Cos7L-CEA och Meth-A-celler stabilt transfekterade med expressionsvektorer som kodar för CEA eller en Tag som saknar en region med den nukleära lokaliseringssignalen (cTag) tjänade som en positiv kontroll. Storlekarna på proteinmarkörer indikeras i den vänstra marginalen.
Figur 4 MHC klass I-begränsad presentation av Tag epitoper hos murina gastric carcinoma cellinjer. (A) epitop-specifika CTL genererade hos C57BL /6-möss genom DNA-immunisering med en Tag expressionsvektor och efterföljande expansion genom in vitro stimulering med Tag peptidladdade RBL5 celler inkuberades med bestrålade 424GC, 424-fibroblaster, RBL5 och Tag T1, T2 /3 eller T4 peptidpulsade RBL5 cellerna i 24 h och deras IFNy-sekretion i odlingsmediet bestämdes genom ELISA. Utsöndring av IFNy genom CTL stimulerade med 424GC celler tyder på att dessa celler närvarande SV40Tag-specifika peptider i en MHCI-begränsat sätt. (B) Coculture av 424GC och 424 fibroblaster behandlades med 107 Tag-specifika CTL i en petriskål under 48 h. Därefter utfördes icke-vidhäftande (döda) celler avlägsnas. Vänster, samodling före CTL behandling; höger, samodling efter behandling. Pilarna indikerar positionen av tumörcellerna före tillsats av CTL
Tumörframkallande av de gastriska karcinom-cellinjer
För att bestämma tumorigeniciteten av cellinjerna, olika nummer (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) av celler injicerades subkutant i C57BL /6-möss. Alla cellinjer kunde bilda tumörer i 100% av djuren, om minst 3 × 10 5 tumörceller injicerades (Fig. 5A). Tumörerna växte nästan exponentiellt utan dröjsmål tills de nådde en volym av 300 mm 3. Inga fjärrmetastaser kunde detekteras under observationstiden. Western blot-analys utfördes på transplanterade tumörer visade att båda transgenerna uttrycktes av de cellinjer som in vivo
(data ej visade). Fördubblingen tider tumörcellerna in vivo-delar på en starttumörbelastning av 10 6 celler varierade mellan 7,2 (mGC8) och 13,8 dagar (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
, alla cellinjer uppvisade liknande dubbleringstider på cirka 3 dagar (Fig. 5B). Vi jämförde vidare subkutan tumörbildning av de cellinjer i vildtyp (C57BL /6) och transgena möss. Inga signifikanta skillnader observerades i tumör ta och tumörtillväxt för cellinje 424GC när det injiceras subkutant i vild-typ eller CEA424 /Tag-transgena möss (Fig. 6A) och för mGC11 CEA celler efter injektion i vild-typ och CEA424 /Tag-CEA-transgena möss (Fig. 6B). Figur 5 In vivo (A) och in vitro tillväxtegenskaper (B) i murina gastric carcinoma cellinjer. Tre möss vardera injicerades med de angivna tumörcelldoser. Tumörtillväxt kvantifierades genom två vinkelräta mätningar av tumördiametern och beräkning av volymen som beskrivs i avsnittet Material och Metoder. För att bestämma tillväxt in vitro egenskaper, odlades celler i 24-brunnsplattor som börjar med de angivna cellantal. Vid olika tidpunkter celler från tre brunnar skördades och räknades. Resultaten visas som medelvärde +/- standardavvikelse (SD). Best fit kurvor samt fördubblingstider i dagar (inom parentes) beräknades med hjälp av GraphPad programvaran.
Figur 6 Tillväxt av magcancer cellinjer i vild-typ och transgena möss. 3 × 105 424GC-celler injicerades subkutant i C57BL /6 och CEA424 /Tag-transgena möss (A) eller 3 × 105 mGC11CEA celler injicerades i C57BL /6 och CEA424 /Tag × CEA-dubbeltransgena möss (B). Tumörtillväxt kvantifierades genom två vinkelräta mätningar av tumördiametern och beräkning av volymen som beskrivs i avsnittet Material och Metoder. Resultaten visas som medelvärde +/- SD (n = 3).
Immunogenicitet hos den gastriska karcinom-cellinjer
liknande tillväxten av tumörcellinjer in vildtyp och transgena möss tyder på att ingen signifikant immunsvar mot antingen tumörantigen (Tag, CEA) inträffade i tumörbärande möss. I själva verket kan ingen Tag-specifik CTL identifieras i mjälten hos tumörbärande vildtyp möss vid progressiv subkutan tillväxt av Tag-uttryck gastric cancerceller (data ej visade). Emellertid, när dubbeltransgena cellinjer växte i möss, CEA-specifika antikroppar kunde identifieras i vildtyp C57BL /6-möss, men inte i CEA-transgena möss (Fig. 7A). Dessutom tre immuniseringar av C57BL /6-möss med 106 fryst tinade mGC8 tumörceller med en veckas mellanrum antingen förhindrade tillväxt av subkutant injicerat levande mGC8 celler helt eller tumörutväxt försenades för nästan tre veckor beroende på den injicerade tumörcell dos (Fig. 7B , C). Dessa experiment visar att de tumörcellinjer är immunogena under vissa villkor. Emellertid inte C57BL /6-möss som inte spontant montera en effektiv tumörprogression begränsande immunsvar mot antingen tumörantigen under subkutan tumörtillväxt. Figur 7 Immunogenicitet hos MGC celler. (A) Anti-CEA-antikroppar bestämdes i serum hos C57BL /6 och CEA-transgena möss genom att använda flödescytometri. Alla möss hade successivt växande tumörer utan öppen nekros efter transplantation och tillväxt av de angivna cellinjer för 35-40 dagar. mGC4CEA celler inkuberades med serumet av de indikerade möss vid olika spädningar och bundna primära antikroppar detekterades med en PE-konjugerad anti-mus-antikropp. (B, C) Tre C57BL /6 möss vardera injicerades subkutant tre gånger med en veckas mellanrum med 1 x 106 mGC8 celler dödats av två frys-tö cykler. Två veckor efter den sista vaccineringen, utmanades mössen genom injektion med 1 x 106 (B) och 3 × 106 (C) levande mGC8 celler, respektive (ifyllda cirklar). Som kontroll, var tumörceller injicerades i icke-immuniserade möss (öppna cirklar). Tumörvolymerna beräknades som beskrivits i Material och Metoder. Resultaten visas som medelvärden +/- SD.
Diskussion
Huvudsyftet med denna studie var att etablera en terapeutisk modell av magcancer i immunkompetenta möss som skulle ge en djurmodell för att utvärdera anti-tumörimmunitet och immunoterapeutiska strategier.

• Primär gastric icke-Hodgkins lymfom hos kinesiska patienter: kliniska egenskaper och prognostiska faktorer
• GASTRICHIP: D2 resektion och hyper intraperitoneal kemoterapi vid lokalt avancerad magsäckscancer: en randomiserad och multicenter fas III-studie