Karakterisering av adenokarsinom cellelinjer etablert fra CEA424 /SV40 T antigen-transgene mus med eller uten menneskelig CEAtransgene

Karakterisering av adenokarsinom cellelinjer etablert fra CEA424 /SV40 T antigen
-transgenic mus med eller uten en menneskelig CEA
transgen
Sammendrag Bakgrunn
Gastric kreft er en av de hyppigste kreftformer over hele verden . Pasienter med magekreft på et avansert stadium av sykdommen har en dårlig prognose, på grunn av den begrensede effekt av tilgjengelige terapier. Derfor er utviklingen av nye behandlingsformer, for eksempel immunterapi for behandling av magekreft er av største betydning. Siden brukbarheten av eksisterende prekliniske modeller for evaluering av immunterapi for mage adenokarsinomer er begrenset, er målet med denne studien var å etablere murine in vivo
modeller som tillater trinnvis forbedring av immunterapi for magekreft.
Metoder
Siden ingen murine mage adenokarsinom cellelinjer er tilgjengelige vi etablert fire cellelinjer (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) fra spontant utvikle svulster i CEA424 /SV40 T antigen (CEA424 /Tag) mus og tre cellelinjer avledet fra double-transgen avkom av CEA424 /Tag mus parret med humant carcinoembryonic antigen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) mus (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag er en transgen C57BL /6 mus belastning harbo Tag under kontroll av en -424 /-8 bp CEA-genet promoter som fører til utvikling av invasiv adenokarsinom i kjertelmagen. Tumorcellelinjer etablert fra CEA424 /Tag-CEA-mus som uttrykker den veldefinert tumor antigen CEA under kontroll av dets naturlige regulatoriske elementer.
Resultater
epitelial opprinnelse av tumorcellene ble påvist ved morfologiske kriterier, inkludert tilstedeværelse av mucin inne i cellene og ekspresjonen av celleadhesjonsmolekyler EpCAM og CEACAM1. Alle cellelinjer konsekvent uttrykke transgener CEA og /eller Tag og MHC klasse I molekyler som fører til deres mottakelighet for lysering av Tag-spesifikk CTL in vitro
. Til tross for presentasjon av CTL-epitoper avledet fra transgene produkter tumorcellelinjer var tumorigent når podet inn C57BL /6, CEA424 /Tag eller CEA424 /Tag-CEA-transgene verter og ingen signifikante forskjeller i tumor ta og ble observert tumorvekst i de ulike verter. Selv om ingen spontan tumor avvisning ble observert, vaksinering av C57BL /6 mus med lysater fra gastrisk carcinom cellelinjer beskyttede C57BL /6 mus fra tumor utfordring, som viser den tumorigenisitet av tumorcellelinjer i ikke-transgen mus av H-2 b haplotype.
Konklusjon
Disse tumorcellelinjer podet på forskjellige syngene vertene skulle vise seg å være svært nyttig for å optimalisere immunterapi regimer som skal endelig testet i transgene dyr utviklings primære mage karsinomer.
Bakgrunn
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen på verdensbasis [1]. Det er ofte ikke oppdages før et avansert stadium; dermed de fem-års overlevelse er lav (10-20%). På grunn av lokal invasjon og metastase, strålebehandling eller kjemoterapi ikke signifikant øke lengden eller livskvaliteten til pasienter med avansert magekreft. Derfor er utvikling av nye neoadjuvant og adjuvant behandlingsmetoder nødvendig. Immunterapi kan være et lovende alternativ. En rekke immunterapi tilnærminger som adoptiv overføring av tumor-spesifikke T-celler, og vaksinering enten ved hjelp av udefinerte tumorantigener avledet fra tumor-lysater og tumorcellelinjer eller definerte tumorantigener som vanligvis presenteres av dendrittiske celler som blir evaluert for forskjellige kreft [2, 3] . For mage kreft, ble immunterapi ikke tatt på alvor i betraktning på grunn av konseptet at magekreft er dårlig immunogen. Derfor er bare et lite antall kliniske utprøvinger immunterapi har blitt rapportert [4-7]. I tillegg er det bare et begrenset antall tumor-assosierte antigener med potensiell bruk for immunterapi blitt identifisert [8-11]. Følgelig er evnen av immunsystemet til å gjenkjenne og utrydde gastriske cancere i stor grad ukjent. For å få innsikt i effekten av ulike immunterapi for behandling av magekreft, og for å klargjøre den underliggende mekanismen for induserte immunresponser dyremodeller av adenokarsinom i ventrikkel er uunnværlige.
For å oppnå dette, har flere grupper inkludert vår nylig etablert transgen eller banke utsjekking musestammer som utvikler mage adenomer eller adenokarsinomer i ulike deler av magen etter forskjellige ventetider [12]. Vi har utviklet en transgen gastrisk karsinom C57BL /6 mus modell basert på et SV40 stort T-antigen (SV40 Tag) transgenet kontrollert av en human carcinoembryonic antigen (CEA) genpromoteren (-424 til -8 fra det translasjonelle startsetet) [13 ]. I 100% av dyrene, blir dysplastisk krypt-dannelse i mageslimhinnene observert i sekken allerede i 30 dag gamle CEA424 /SV40 Tag-transgene mus. Dysplasi utvikler seg til invasive karsinomer og ved dag 50 hele pyloric mageslimhinnen er blitt erstattet av carcinomceller. Mellom en alder av 90 til 110 dager gene mus blir døende og dør trolig av underernæring på grunn av blokkering av pylorus [13]. Kontrollen av Tag uttrykk ved en minimal CEA-genpromoteren lar tumor-rettet ekspresjon av CEA ved å krysse CEA424 /SV40 Tag-transgene mus med human CEA
-transgenic C57BL /6-mus som uttrykker den CEA transgenet i en lignende spatiotemporal uttrykket mønster som finnes hos mennesker [13, 14]. Den humane tumor markør CEA er uttrykt i mange humane adenocarcinomas, inkludert mer enn 50% av gastriske karsinomer [15, 16]. CEA er i økende grad anvendt som målantigen for en rekke av antistoff, og celle-medierte immunterapi tumorfremgangsmåter [17-19]. CEA og Tag er egnede immunterapi målantigener siden en rekke av T-celle-epitoper av disse antigenene er blitt identifisert i C57BL /6 mus [20-22]. Selv om disse transgene musestammer speil meget tett gastrisk adenokarsinom utvikling hos mennesker, eksperimentering med disse mus er forholdsvis tidkrevende og kostbart på grunn av vanskeligheter med å bestemme tumorvekst og kravet til avl transgene mus. Derfor er det ønskelig å ha en syngenisk transplantable tumor system av mage-adenokarsinomer hos immunkompetente mus for optimalisering av en gitt immunterapi protokollen før den blir evaluert i de transgene mus. Her beskriver vi murine gastrisk adenokarsinom cellelinjer etablert fra spontant utvikle svulster i SV40 Tag-transgene mus som er tumorigent både syngene villtype og transgene mus.
Metoder
musestammer og cellelinjer
CEA424 /Click-kode gene mus (C57BL /6-Tg (CEACAM5-tag) L5496Wzm), CEA-transgene mus (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm, CEA2682) og F1-mus fra en krysning mellom CEA424 /Tag-transgene og CEA-transgene mus er blitt beskrevet tidligere [13, 14]. Imens transgene linjer har blitt backcrossed til C57BL /6 mus (H-2 b) for mer enn 15 generasjoner. De transgene linjer samt C57BL /6 mus (Charles River, Sulzfeld, Tyskland) ble avlet og holdt under standard patogen-frie forhold i dyret anlegget ved Institutt for kirurgisk forskning, Ludwig-Maximilians-universitetet i München. De dyreforsøk ble utført etter godkjenning av lokale dyrevelferd komiteen. For tumorigenitet og immunogenisitet analyser mus ble brukt ved 8-12 ukers alder. Afrikansk grønn ape nyre Cos7L cellelinjen ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Den BALB /c-avledet fibrosarkom Meth-A ble vennlig levert av W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA celler ble oppnådd ved transfeksjon av Meth-A celler med PRC /CMV-CEA ekspresjonsplasmider ved hjelp Fugene ™ 6 transfeksjon reagens (Roche Molecular Biochemicals, Sveits) i henhold til produsentens anvisninger. Meth-A-cTag og RBL5 /T transfektanter ble tidligere beskrevet [23].
Etablering av magekreft cellelinjer
gastrisk karsinom som brukes til å etablere cellelinjer ble oppnådd fra 8 forskjellige, 13 uker gamle mus. Fire avledet fra CEA424 /Tag-transgene mus og fire fra CEA424 /TAG-CEA-dobbel transgene mus. Navnene på cellelinjer avledet fra sistnevnte mus er preget av hevet "CEA". Alle kulturer ble utført i RPMI1640 supplementert med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS "Gold"; PAA Laboratories, Coelbe, Tyskland), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, ikke-essensielle aminosyrer og 1 mM natriumpyruvat (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), videre kalt tumor medium (TM). Tumorvev ble grundig vasket i fosfatbufret saltløsning (PBS) supplert med 200 ug /ml gentamicin og 2,5 ug /ml amfotericin B (GIBCO /Invitrogen), skåret i 1 mm 3 stykker med en skalpell og sådd ut i vevskultur kolber som inneholder TM. Kulturmediet ble skiftet hver 3-4 dag. Epitelceller og fibroblaster som vokser ut av vevet fragmenter ble separert ved celle skraping, selektiv trypsinering og selektiv aging med 1000 U /ml kollagenase og 500 U /ml hyaluronidase (Biochrom, Berlin, Tyskland). Under dissosiasjon, ble kolbene overvåket under en invertert mikroskop og fordøyelse ble stoppet når fibroblaster, men ikke epitelceller ble løsnet (trypsin) eller vice versa (collagenase /hyaluronidase). Denne prosedyren ble gjentatt hver uke helt til alle fibroblaster ble eliminert i tumorcellekulturer. I løpet av genereringen av 424GC cellelinjen, ble en fibroblast kultur etablert fra forurensende fibroblaster (424 fibroblaster). Sfæroidene ble dannet i løpet av 5-7 dager etter utsåing 0,5 x 10 3 mGC8 celler i Noble-agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland)-belagte 96-brønners plater (TPP-Biochrom, Berlin, Tyskland) i 200 ul TM hvilken ble erstattet med friskt medium hver to dager. For å vurdere levedyktigheten til cellene på overflaten av kulene, ble kulene inkubert med FITC-merket annexin V (Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Tyskland) for påvisning av apoptotiske celler eller med propidiumjodid for å identifisere nekrotisk celler i henhold til produsentens anbefalinger.
Strømningscytometri-analyser
for overflatefargings celler ble trypsinert, vasket med PBS og suspendert i PBS /0,5% vekt /volum bovint serumalbumin (BSA) supplert med 0,02% vekt /volum natrium- azid. For induksjon av MHC-molekyler, ble celler inkubert med 20 ng /ml interferon-γ (IFNy, Peprotec, London, UK) i 24 timer før høsting. Ikke-spesifikk binding av antistoff mot Fc-reseptorer ble blokkert ved preinkubasjon av cellene med 1 ug /10 6-celler av anti-CD16 /CD32 monoklonalt antistoff (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland) i 15 minutter . Deretter ble cellene inkubert med 0,5 ug /10 6 celler av mAb av interesse i 30 min ved 4 ° C, vasket to ganger, og eventuelt deretter omsettes med en andre-trinns-antistoff i 15 minutter ved 4 ° C . Cellene ble vasket to ganger og analysert ved hjelp av en FACScan (BD, Mountain View, California). Døde celler ble ekskludert av propidiumjodidfarging. De følgende reagenser og mAbs mot murine antigener fra BD Pharmingen ble anvendt: fykoerytrin (PE) -konjugert mus-IgG 2a anti-IA b, biotinylert mus-IgG 2a anti-H-2d b , PE-konjugert mus-IgG 2aanti-H-2K b, PE-konjugert anti-mus CD80 /B7-1, PE-konjugert rotte-IgG 2a anti-mus CD40, PE-konjugert rotte IgG 2a anti-mus CD86 /B7-2, fluorescein (FITC) konjugert, armensk hamster IgG 2 anti-mus CD80 /B7-1. FITC-konjugert rotte IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugert rotte IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugert mus IgG 2a anti-rotte SIRP, FITC-konjugert armensk hamster IgG 2anti-KLH og PE-konjugert rotte IgG 2amAb fungerte som isotype kontroller. Mouse anti-mus CEACAM1 mAb CC1, rotte anti-mus CEACAM1 AgB10 [24] og rotte anti-mus E-cadherin og anti-mus EpCAM mAbs var en slags gave fra K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité Berlin, og P. Ruf, Trion Research, München, henholdsvis. Den kryss-reaktivt mus-anti-humant mAb CEACAM 4/3/17 (spesifikt for humant CEA /CEACAM5 i mus) ble anskaffet fra GENOVAC (Freiburg, Tyskland). Murine antistoffer ble detektert med PE-konjugert geit-anti-mus IgG, rotteantistoffer med FITC-konjugert esel-anti-rotte-IgG (DAKO).
Påvisning av CEA og SV40 Tag ved Western blotting
Eksponensielt voksende gastriske carcinomceller , Cos7L celler, Cos7L-CEA-transfektanter, Meth-A-celler og Meth-A-cTag transfektanter som uttrykker en avkortet cytoplasmisk lokalisert SV40 Tag ble høstet ved trypsinering. Celler ble vasket tre ganger i PBS og lysert ved en tetthet på 10 6 celler /ml i lysebuffer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Celleekstrakter tilsvarende 10 ug protein ble separert ved elektroforese gjennom 10% SDS-polyakrylamidgeler (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), overført til polyvinyliden fluorid-membraner og inkubert med 10 ug /ml anti-humant mAb CEACAM 4/3/17 eller en 1: 100 fortynnet hamster anti-SV40 Tag antiserum (en slags gave av K.-H. Scheidtmann, Universitetet i Bonn). Bundet antistoffer ble reagert med hest reddik peroxidase-merket sekundære antistoffer og visualisert ved hjelp av en chemiluminescence basert deteksjon system. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland)
Cell dobling tid besluttsomhet
In vitro
doblingstidene for de cellelinjer ble bestemt ved utsåing mage carcinoma celler i 24-brønners plater i TM ved de angitte startcellenummer og telling av celleprøver fra triplikatbrønner etter mild trypsinisering hver 3. dag i 21 dager. In vivo
doblingstidene ble beregnet fra tumorvolummålinger (se nedenfor) etter inokulering med tre forskjellige startcellenummer (tre mus pr gruppe). Doblingstidene ble beregnet ut fra log-fasen av vekstkurvene.
Tumorgenisitet og immunogenisitet av cellelinjene
For tumorgenisitet vurderingstumorceller ble vasket tre ganger i PBS og 50 ul av cellesuspensjoner med de angitte celletallene ble injisert subkutant i høyre flanke barbert av musene. For å bestemme immunogenisitet, 10 7 tumor celler /ml ble lysert ved to påfølgende fryse og tinesykluser. Mus ble immunisert fire ganger ukentlig med 10 6 lyserte kreftceller i høyre flanke. Tre uker senere ble musene utfordret ved subkutan injeksjon av 3 x 10 6 levedyktige tumorceller i den venstre flanke. Eksperimentelle grupper besto av 4-6 mus. Tumorutvikling ble etterfulgt av serielle målinger av tumorstørrelse og tumorvolumet ble beregnet i henhold til ligningen: tumorvolum (mm 3) = d 2 x D /2, hvor D og D var den korteste og den lengste tumordiameter, henholdsvis. Dyrene ble avlivet når tumorene nådde et volum på 300 mm 3.
Generering av Tag-spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og stimulering av gastrisk karsinom-cellelinjer
CTL ble samlet som tidligere beskrevet [23] . I korthet, mus ble intradermalt inokulert med 1 mikrometer gullpartikler belagt med en Tag uttrykk plasmid (BMG /CT-Ag.1 [23]) i den barberte abdominal huden ved hjelp av en helium trykk (200 psi) drevet biolistic enhet (Helios genet pistol; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland). Miltceller erholdt 14 dager etter vaksinasjon ble restimulert ukentlig med bestrålte RBL5 /T-transfektanter i RPMI-1640/10% FCS supplert med 30 IE /ml IL-2. RBL5 /T er en Rauscher-virus-transformerte T-lymfom cellelinje avledet fra en C57BL6 (H-2b) mus transfektert med en SV40 Tag ekspresjonsplasmid. For å generere epitop-spesifikke CTL, miltceller tatt 10 dager etter vaksinasjon ble restimulert in vitro med bestrålt, Tag peptid-pulset RBL5 celler. T1, T2 /3 og T4 epitop spesifisitet av de CTL ble kontrollert ved bestemmelse av IFNy innholdet i mediet ved stimulering med peptid-pulset målceller ved hjelp av ELISA.
Cytokin påvisning ved ELISA
For fangst og deteksjon av IFNy i supernatanter av konvensjonell sandwich-ELISA, brukte vi mAb R4-6A2 og biotinylert mAb XMG1.2, henholdsvis (BD Pharmingen). Utryddelse ble analysert ved 405/490 nm på en TECAN mikro ELISA-leser (TECAN Crailsheim, Tyskland) med EasyWin programvare (TECAN). Påvisningsgrensen av ELISA med hensyn på IFNy var 20 pg /ml.
Resultater
Etablering og fenotype av gastrisk karsinom-cellelinjer
Fra 8 magekarsinom prøvene 7 cellelinjer kan bli etablert. Fire cellelinjer ble avledet fra CEA424 /Tag-transgene mus (424GC, fra en hannmus, mGC3, kvinnelig, mGC5, male, og mGC8, kvinnelig) og tre linjer fra CEA424 /Tag-CEA-transgene mus (mGC2 CEA, mannlig, mGC4 CEA, mannlig, mGC11 CEA, hunn). Den tiden det tar å få rene epiteliale cellekulturer varierte sterkt (gjennomsnittlig 6 måneder, range 3-16 måneder). Selv om tumorcellene å vokse som adherente celler i kultur, har de en tendens til å danne aggregater i stedet for å spres på kulturen substratet (Fig. 1A). Den epitelial opprinnelse av tumorcellene ble påvist ved morfologiske kriterier, inkludert tilstedeværelsen av mucin i cellene (Fig. 1A) og uttrykket analyse av protein som vanligvis uttrykkes i epitelceller (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (Fig. 2A) . En redusert innhold av mucin ble funnet i alle cellelinjer, sammenlignet med innholdet i normale gastriske epitel-celler, men lik den som finnes i tumorceller i gastrisk karsinom i transgene mus (Fig. 1A og [13]). Alle cellelinjer vist CEACAM1 og EpCAM på deres overflate, bortsett fra mGC11 CEA, ingen av dem uttrykt E-cadherin (fig. 2A og data ikke vist). Alle cellelinjer uttrykte MHC klasse I H-2K og, og ved et mye lavere nivå, H-2D-molekyler (fig. 2B). Uttrykk for begge proteiner ble sterkt forbedret med IFNy stimulering. Ingen ekspresjon av MHC klasse II-molekyler (I-Ab) ble påvist (Fig. 2B og data ikke vist). CD54, CD80, CD86 eller CD95 ble ikke oppdaget på noen cellelinje (data ikke vist). Figur 1 Morfologi av magekreft cellelinjer dyrket som monolagskulturer eller som tredimensjonale kuler. (A) Cellelinjene viser en litt annen epitelial morfologi. De fleste cellene i alle cellelinjer inneholde en karakteristisk intracellulær vacuole (piler) som trolig inneholder mucinous materialet farget rød av PAS-metoden (siste bildet til høyre i nedre panel). (B) spheroid dannet ved dyrkning mGC8 kreftceller på soft agar: venstre, fasekontrast; høyre, fluorescens farging av nekrotiske celler med propidiumjodid (rød) og apoptotiske celler med FITC-merket annexinV (grønn, markert ved pilene), som beskrevet i "Materialer og metoder". Forstørrelse: barer tilsvarer 10 mikrometer. MGC, murin gastrisk karsinom.
Figur 2 Celleoverflate-ekspresjon av epitel-markører (A) og MHC klasse I og II-molekyler (B). Gastrisk karsinom cellelinjer ble omsatt enten med PE-merket (H-2Kb, H-2DB, I-Ab) eller med umerket mAb (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM) etterfulgt av inkubasjon med PE-merket anti-mus IgG eller FITC -merket anti-rotte-IgG og analysert ved strømningscytometri. Histogrammer viser resultatene oppnådd med antistoffer mot relevante antigener med (åpen grå) eller uten (åpne svart) før IFNy stimulering og irrelevante antigener (grå fylte kurver).
For å bestemme den potensielle av cellelinjene som skal brukes for generering av tre-dimensjonale tumormodeller vi analyserte tumorcelle sfæroid dannelse in vitro. Som illustrert i fig. 1B cellelinjene som dannes kompakte tumorcelleklumper etter 8 dagers dyrking når 103-celler ble podet inn i soft agar-belagte 96-brønners plater. Bare mindre intra-eksperimentelle variasjon ble observert når det gjelder størrelsen av kulene. Farging med propidiumjodid og FITC-merket annexin V viste at i det minste overflatelaget av kulene besto av levedyktige celler med svært få døde celler som er knyttet til den (fig. 1B).
Transgene ekspresjon av magekreft cellelinjer
CEA og Tag kan tjene som tumor-spesifikke antigener (TSA) eller tumorassosierte antigener (TAA) etter transplantasjon av de nyetablerte tumorcellelinjer i immunocompetent syngene C57BL /6 og CEA- eller Tag-transgene mus, henholdsvis. Selv om instrumental i tumordannelse, er Tag transgene uttrykk ikke alltid finnes i tumorcellelinjer avledet fra Tag-transgene mus, som i Tramp tumorcellelinjer [25]. Dette fikk oss til å analysere ekspresjonen og MHC klasse I-begrenset presentasjon av Tag transgenet, så vel som ekspresjon av CEA i de etablerte gastrisk karsinom-cellelinjer. CEA celleoverflate-ekspresjon ble analysert i cellelinjer avledet fra gastriske tumorer av doble transgene mus ved strømningscytometri og Western blot-analyse. Selv om ekspresjonen av transgenet CEA reguleres ved fullstendig promoter-regionen i det humane CEA-gen ekspresjon av Tag styres av en minimal -424 /-8 bp CEA-promoteren (fig. 3A). Alle tre doble transgene cellelinjer uttrykte CEA på celleoverflaten (fig. 3B). I gastrisk karsinom cellelinje mGC2 CEA transgene-uttrykte CEA oppviste en molekylvekt på 180 kDa som ligner den som finnes i SV40-transformerte afrikansk grønn ape nyre celler stabilt transfektert med et CEA ekspresjonsvektor og til CEA i mennesker. Som forventet ble det ikke CEA påvist i 424GC celler, som ble etablert fra en CEA-negative Tag-transgene mus (Fig. 3C). Tag ble funnet å bli uttrykt ved Western blotting og immunofluorescensanalyse i alle cellelinjer avledet fra enkle og doble transgene mus (fig. 3D og data ikke vist). Dette funnet støtter også opprinnelsen av cellelinjer fra magen karsinomer. Videre 424GC cellelinjen effektivt presentert endogent bearbeidet Tag-avledede peptider, spesielt T1 epitop, i et MHC-I-begrenset måte som bestemt ved induksjon av IFNy sekresjon byTag-spesifikk CTL (Fig. 4A). Videre er cellelinjer ble effektivt drept av Tag-spesifikk CTL in cytotoksiske analyser (fig. 4B). Figur 3 Uttrykk for CEA og Tag av magekreft cellelinjer avledet fra CEA424 /Click-kode eller CEA424 /Tag × CEA-transgene mus. (A) Oppbygging av CEA og CEA424 /Tag transgener. De eksoner 1-10 av menneske CEA-genet finnes innsatsen av kosmid klone cosCEA1 [14] vises som fargekodede bokser (lys blå, leder, red, IGV-lignende domene, blå IGC-lignende domene, grå, transmembrane domene;.. hvitt, 5'- og 3'-ikke-translaterte område eksoner Flankevektorsekvenser er vist som svarte bokser plasseringen av CEA minimal promoter som er tilstede i SV40-Tag-genet transgenet er indikert med stiplede linjer, er navnene på de transgene linjer vist i venstre marg. (B) Strømningscytometri ble utført ved merking av de angitte celler enten med CEA-spesifikt mAb 26/3/13 (fylte kurver), eller et isotype-matchet-antistoff (åpne kurver) fulgt av PE-merket geit- anti-mus IgG antistoffer. (C, D) for Western analyse, 10 mikrogram total protein fra ekstrakter av 424GC eller mGC8 celler etablert fra CEA424 /Tag-transgene mus og mGC2CEA og mGC4CEA celler fra CEA424 /Tag × CEA-transgene mus var størrelse separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese, overført til en membran og omsettes med CEA-spesifikt mAb 26/3/13 (C) eller hamster polyklonale anti-tag antistoff (D). Utdrag fra Cos7L-CEA og Meth-A celler stabilt transfektert med ekspresjonsvektorer koder CEA eller en tagg mangler en region med kjernefysiske lokalisering signal (cTag) fungerte som en positiv kontroll. Størrelsene på proteinmarkører er indikert i venstre marginer.
Figur 4 MHC klasse I-begrenset presentasjon av Tag epitoper av murine magekreft cellelinjer. (A) epitop-spesifikk CTL generert på C57BL /6 mus ved DNA-immunisering med et Tag ekspresjonsvektor og påfølgende utvidelse ved in vitro stimulering med Tag peptid belastede RBL5 celler ble inkubert med bestrålte 424GC, 424 fibroblaster, RBL5 og Tag T1, T2 /3 eller T4 peptid-pulset RBL5-celler i 24 timer, og deres IFNy sekresjon til kulturmediet ble bestemt ved hjelp av ELISA. Utskillelse av IFNy ved CTL stimulert med 424GC celler indikerer at disse cellene til stede SV40Tag-spesifikke peptider i en MHCI-begrenset måte. (B) coculture av 424GC og 424 fibroblaster ble behandlet med 107 Tag-spesifikk CTL i en petriskål i 48 timer. Deretter ble ikke-heft (døde) celler fjernet. Venstre, coculture før CTL behandling; høyre, coculture etter behandling. Piler indikerer posisjonen av tumorcellene før tilsetning av CTL
tumorgenisitet av gastrisk carcinom cellelinjer
For å bestemme tumorigenisitet av cellelinjene, forskjellige tall (1 x 10 5;. 3 x 10 5; 1 x 10 6) av celler ble injisert subkutant i C57BL /6 mus. Alle cellelinjer var i stand til å danne tumorer i 100% av dyrene, hvis minst 3 x 10 5-tumorceller ble injisert (Fig. 5A). Svulstene vokste nesten eksponentielt uten noen forsinkelse før de nådde et volum på 300 mm 3. Ingen fjernmetastaser kunne påvises i løpet av observasjonstiden. Western blot-analyse utført på transplanterte tumorer viste at begge transgener ble uttrykt av cellelinjer in vivo plakater (data ikke vist). Doblingstidene til tumorcellene in vivo
på et utgangstumorbelastning på 10 6 celler varierte mellom 7,2 (mGC8) og 13,8 dager (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
, alle cellelinjer oppviste lignende doblingstider på ca. 3 dager (fig. 5B). Vi ytterligere i forhold subkutan tumor dannelsen av cellelinjer i villtype (C57BL /6) og transgene mus. Ingen signifikante forskjeller ble observert i tumor ta og tumorvekst for cellelinjen 424GC når injisert subkutant inn i vill-type eller CEA424 /Tag-transgene mus (Fig. 6A) og for mGC11 CEA-celler etter injeksjon inn i vill-type og CEA424 /Tag-CEA-transgene mus (fig. 6B). Figur 5 In vivo (A) og in vitro-vekstegenskaper (B) av murine gastrisk carcinom cellelinjer. Tre mus hver ble injisert med de angitte tumorcelle doser. Tumorvekst ble kvantifisert ved hjelp av to vinkelrette målinger av tumordiameter og beregning av det volum som er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. For å bestemme in vitro-vekstegenskaper, ble celler dyrket i 24-brønners plater som starter med de indikerte celle tall. Ved forskjellige tidspunkter celler fra triplikatbrønner ble høstet og tellet. Resultatene er vist som gjennomsnitt +/- standard avvik (SD). Best tilpassede kurver samt dobling ganger i dag (i parentes) ble beregnet ved bruk av GraphPad programvare.
Figur 6 Vekst av magekreft cellelinjer i villtype og transgene mus. 3 x 105 424GC celler ble injisert subkutant i C57BL /6 og CEA424 /Tag-transgene mus (A) eller 3 x 105 mGC11CEA celler ble injisert i C57BL /6 og CEA424 /Tag x CEA-dobbelt transgene mus (B). Tumorvekst ble kvantifisert ved hjelp av to vinkelrette målinger av tumordiameter og beregning av det volum som er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Resultatene er vist som gjennomsnitt +/- SD (n = 3).
Immunogenisitet av gastrisk karsinom-cellelinjer
lik veksten av tumorcellelinjer i vill-type og transgene mus indikerer at ingen signifikant immunrespons til enten tumor antigen (Tag, CEA) oppstod i tumorbærende mus. Faktisk er ingen Tag-spesifikke CTL kunne identifiseres i milten hos tumorbærende villtype mus ved subkutan progressiv vekst av Tag-uttrykkende gastrisk karsinom-celler (data ikke vist). Men når doble transgene cellelinjer som vokste i mus, CEA-spesifikke antistoffer kan bli identifisert i villtype C57BL /6-mus, men ikke i CEA-transgene mus (Fig. 7A). Videre tre vaksinasjoner av C57BL /6 mus med 106 fryse-tint mGC8 tumorceller med ukentlige intervaller enten hindret veksten av subkutant injisert levende mGC8 celler helt eller svulst utvekst ble forsinket i nesten tre uker, avhengig av den injiserte tumorcelle dose (Fig. 7B , C). Disse forsøkene demonstrerer at tumorcellelinjene er immunogene under visse betingelser. Imidlertid, C57BL /6 mus ikke spontant montere en effektiv tumorprogresjon begrensende immunrespons til enten tumorantigenet i løpet av subkutan tumorvekst. Figur 7 Immunogenisitet av MGC celler. (A) Anti-CEA antistoffer ble bestemt i serumet til C57BL /6 og CEA-transgene mus ved hjelp av strømningscytometri. Alle mus hadde stadig voksende tumorer uten åpenbar nekrose etter transplantasjon, og veksten av de angitte cellelinjer for 35-40 dager. mGC4CEA celler ble inkubert med serum fra de angitte mus ved forskjellige fortynninger og bundne primære antistoffer ble detektert med et PE-konjugert anti-mus-antistoff. (B, C) tre C57BL /6 mus hver ble injisert subkutant tre ganger ved ukentlige intervaller med 1 x 106 mGC8 celler drept av to fryse-tine-sykluser. To uker etter siste vaksinering ble musene utfordret ved injeksjon med 1 x 106 (B) og 3 x 106 (C) bor mGC8 celler, henholdsvis (utfylte sirkler). Som en kontroll, ble tumorceller injisert i ikke-immuniserte mus (åpne sirkler). Tumorvolumer ble beregnet som beskrevet i Materiale og metode delen. Resultatene er vist som middelverdier +/- SD.
Diskusjon
Hovedmålet med denne studien var å etablere en terapeutisk modell av magekreft hos immunkompetente mus som ville gi en dyremodell for å evaluere anti-tumor immunitet og immunterapeutiske strategier.

• Primær mage non-Hodgkins lymfom hos kinesiske pasienter: kliniske egenskaper og prognostisk factors
• GASTRICHIP: D2 reseksjon og hyper intraperitoneal kjemoterapi i lokalavansert magekreft: en randomisert og multisenter fase III study