Caracterização de linhas celulares de adenocarcinoma gástrico estabelecidas a partir de ratinhos transgénicos antigénio-CEA424 /T de SV40 com ou sem um CEAtransgene

Caracterização humano de linhas celulares de adenocarcinoma gástrico estabelecidas a partir de antigénio CEA424 /T de SV40
-transgenic ratos com ou sem um CEA humano
transgene da arte abstracta
Fundo
carcinoma gástrico é um dos cancros mais frequentes em todo o mundo. Pacientes com câncer gástrico em estágio doença avançada têm um mau prognóstico, devido à limitada eficácia das terapias disponíveis. Por conseguinte, o desenvolvimento de novas terapias, como imunoterapia para o tratamento do cancro gástrico é de extrema importância. Desde a usabilidade de modelos pré-clínicos existentes para a avaliação de imunoterapias para adenocarcinomas gástricos é limitado, o objetivo do presente estudo foi estabelecer murino in vivo
modelos que permitem a melhoria gradual de imunoterapias para o câncer gástrico.
Métodos
Uma vez que não há linhas de células de adenocarcinoma gástrico murino estão disponíveis estabelecemos quatro linhas celulares (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) a partir espontaneamente desenvolver tumores do antígeno CEA424 /SV40 T camundongos (CEA424 /Tag) e três linhas celulares derivadas de double-transgênica prole de camundongos CEA424 /Tag acasalaram com antígeno carcinoembrionário humano (CEA) ratos -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag é uma transgénicos C57BL /6 mouse estirpe que alberga o Tag sob o controlo de um promotor de gene de CEA -424 pb /-8 o que leva ao desenvolvimento de adenocarcinoma invasivo no estômago glandular. linhas celulares de tumores estabelecidos a partir de ratinhos CEA424 /Tag-CEA expressar o antigénio tumoral CEA bem definida sob o controlo dos seus elementos reguladores naturais.
resulta of the origem epitelial das células do tumor foi comprovada por critérios morfológicos, incluindo a presença de mucina no interior das células e a expressão das moléculas de adesão celular e de EpCAM CEACAM1. Todas as linhas celulares expressam de forma consistente a CEA transgenes e /ou Tag e moléculas MHC classe I conduz à sua susceptibilidade à lise por CTL específicos de Tag in vitro
. Apesar da apresentação de CTL epitopos derivados a partir dos produtos do transgene as linhas celulares tumorais foram tumorigénicas quando enxertados em ratinhos C57BL /6, CEA424 /Tag ou CEA424 hospedeiros /Tag-ACE-transgénicos e não há diferenças significativas em tumores tomar e o crescimento do tumor foi observada em os diferentes hospedeiros. Embora tenha sido observada nenhuma rejeição de tumores espontâneos, a vacinação de camundongos C57BL /6 com lisados ​​de linhas celulares de carcinoma gástrico protegidas ratinhos C57BL /6 do desafio ao tumor, demonstrando a tumorigenicidade das linhas de células de tumor em ratinhos transgênicas do H-2 b haplótipo.
Conclusão
Estas linhas celulares de tumores enxertados em diferentes hospedeiros singeneicos deve provar ser muito útil para otimizar regimes de imunoterapia a ser finalmente testado em animais transgênicos em desenvolvimento carcinomas gástricos primários.
Fundo
O câncer gástrico é a segunda em todo o mundo câncer mais comum [1]. Muitas vezes não é detectado até um estágio avançado; consequentemente, as taxas de sobrevivência de 5 anos é baixa (10-20%). Devido à invasão local e metástases, a radioterapia ou quimioterapia não aumenta significativamente o comprimento ou a qualidade de vida de pacientes com câncer gástrico avançado. Portanto, são necessários o desenvolvimento de novas modalidades de tratamento neoadjuvante e adjuvante. A imunoterapia pode ser uma opção alternativa promissora. Um número de imunoterapia abordagens como a transferência adoptiva de células T específicas do tumor, e vacinação utilizando quer de antigénios tumorais indefinidos derivados a partir de lisados ​​de tumor e linhas de células tumorais ou antigénios tumorais definidas comummente apresentados por células dendriticas estão a ser avaliados para vários cancros [2, 3] . Para cancros gástricos, a imunoterapia não foi levado a sério em consideração devido ao conceito de que o câncer gástrico é pouco imunogênica. Portanto, apenas um pequeno número de ensaios clínicos de imunoterapia foram relatados [4-7]. Além disso, apenas um número limitado de antigénios associados a tumores com utilização potencial para a imunoterapia, foram identificados [8-11]. Por conseguinte, a capacidade do sistema imune para reconhecer e erradicar cancros gástricos é em grande parte desconhecida. Para obter conhecimento sobre a eficácia de vários imunoterapias para o tratamento do cancro gástrico e para elucidar o mecanismo subjacente das respostas imunes induzidas modelos animais de adenocarcinomas gástricos são indispensáveis.
Para este fim, vários grupos incluindo o nosso estabeleceram recentemente transgénico ou bater estirpes de murganhos que desenvolvem -out adenomas ou adenocarcinomas gástricos em várias partes do estômago após latências diferentes [12]. Nós desenvolvemos um carcinoma gástrico transgénico /6 modelo de ratinho C57BL com base em um grande antigénio T de SV40 (SV40 Tag) transgene controlada por um promotor do gene antigénio carcinoembrionário humano (CEA) (a partir de -424 a -8 do local de iniciação da tradução) [13 ]. Em 100% dos animais, a formação de cripta displásicas na mucosa do estômago é observado na região pilórica ratinhos transgénicos TAG-idade CEA424 /SV40 já no dia 30. Displasia progride para carcinomas invasivos e até ao dia 50 de toda a mucosa gástrica do piloro foi substituído por células de carcinoma. Entre a idade de 90 a 110 dias, os ratinhos transgénicos tornou moribunda e morrer, provavelmente, de subnutrição devido ao bloqueio do piloro [13]. O controle da expressão Tag por um promotor mínimo do gene CEA permite a expressão dirigida a tumores de CEA por cruzamento de ratinhos transgénicos-Tag /SV40 CEA424 com CEA humano
-transgenic ratinhos C57BL /6, as quais expressam o transgene CEA num espaço-temporal semelhante padrão de expressão como encontrado em seres humanos [13, 14]. O CEA marcador tumoral humana é expressa em muitos adenocarcinomas humanos, incluindo mais de 50% dos carcinomas gástricos [15, 16]. CEA é cada vez mais utilizado como antigénio alvo para uma variedade de abordagens de imunoterapia tumoral anticorpo-e mediadas por células [17-19]. CEA e antigénios alvo são Tag imunoterapia adequados uma vez que um número de epitopos de células T destes antigénios foram identificados em ratinhos C57BL /6 [20-22]. Embora estas estirpes transgénicas de ratinho espelhar o desenvolvimento de adenocarcinoma muito estreitamente gástrico em seres humanos, a experimentação com estes ratinhos é relativamente demorado e caro, devido às dificuldades para determinar o crescimento do tumor e o requisito de reprodução ratinhos transgénicos. Portanto, é desejável ter um sistema de tumor transplantáveis ​​singeneicos de adenocarcinomas gástricos em ratinhos imunocompetentes para optimização de um determinado protocolo de imunoterapia antes de ser avaliado nos ratinhos transgénicos. Aqui nós descrevemos linhas celulares de adenocarcinoma gástrico murino estabelecidas a partir espontaneamente desenvolver tumores de camundongos Tag-transgênica SV40 que são tumorigénico em ambos tipo selvagem singênica e camundongos transgênicos.
Métodos
linhagens de camundongos e linhas celulares
CEA424 /Tag- ratinhos transgénicos (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgênicos ratinhos (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) e F1 ratos de um cruzamento entre ratos CEA424 /Tag-transgênica e CEA-transgênica foram descritos anteriormente [13, 14]. Enquanto isso, as linhagens transgênicas foram retrocruzado de camundongos C57BL /6 (H-2 b) por mais de 15 gerações. As linhagens transgênicas, assim como camundongos C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram criados e mantidos em condições normais isentos de agentes patogénicos no biotério do Instituto de Pesquisa Cirúrgica, Ludwig-Maximilians-University of Munich. Os experimentos com animais foram realizados após aprovação pelo comité de bem-estar animal local. Para os ensaios de tumorigenicidade e de imunogenicidade em ratinhos foram usadas 8-12 semanas de idade. A linha verde africano Cos7L células de rim de macaco foi obtida a partir da American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). A /C derivado de fibrossarcoma BALB Meth-A foi gentilmente fornecida por W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburgo). As células Meth-A-CEA foram obtidos por transfecção de células Meth-A com os plasmídeos de expressão pRc /CMV-CEA ™ utilizando FuGENE 6 reagente de transfecção (Roche Molecular Biochemicals, Switzerland) de acordo com as instruções do fabricante. transfectantes Meth-A-CTAG e RBL5 /T foram previamente descritos [23].
Estabelecimento de linhagens celulares de carcinoma gástrico Tours A carcinomas gástricos usados ​​para estabelecer linhas de células tumorais foram obtidos a partir de 8 camundongos diferentes, 13 semanas de idade. Quatro derivado de ratos CEA424 /tag-transgênica e 4 de /Tag-CEA-double ratinhos transgénicos CEA424. Os nomes das linhas celulares derivadas a partir do último ratinhos são marcados por o expoente "CEA". Todas as culturas foram realizadas em RPMI1640 suplementado com 10% inactivado por calor soro fetal de vitela ( "Gold" FCS; PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha), 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, não-essencial aminoácidos e piruvato de sódio 1 mM (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), a seguir referido como meio de tumor (TM). Os tecidos tumorais foram extensivamente lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com 200 ug /ml de gentamicina e 2,5 jig /ml de anfotericina B (Gibco /Invitrogen), cortado em 1 mm 3 pedaços com um bisturi e plaqueadas em cultura de tecidos frascos contendo TM. O meio de cultura foi mudado a cada 3-4 dias. As células epiteliais e fibroblastos em crescimento fora dos fragmentos de tecido foram separadas por raspagem células, tripsinização selectiva e Passaging selectiva com 1000 U /ml de colagenase e 500 U /ml de hialuronidase (Biochrom, Berlim, Alemanha). Durante dissociação, os frascos foram monitorados sob um microscópio invertido e digestão foi interrompido quando os fibroblastos, mas não células epiteliais foram destacadas (tripsina) ou vice-versa (colagenase /hialuronidase). Este procedimento foi repetido semanalmente até que todos os fibroblastos foram eliminados a partir de culturas de células de tumor. Durante a geração da linha celular de 424GC, de uma cultura de fibroblastos foi estabelecida a partir de fibroblastos de contaminantes (424 fibroblastos). Esferóides formado dentro de 5-7 dias após a sementeira de 0,5 x 10 3 mGC8 células em ágar Noble (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) -Revestido placas de 96 poços (TPP-Biochrom, Berlim, Alemanha) em 200 ul TM quais foi substituído com meio fresco a cada dois dias. Para avaliar a viabilidade das células na superfície dos esferóides, esferóides foram incubadas com FITC anexina V (Anexina V FITC Apoptosis Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Alemanha) para a detecção de células apoptóticas ou com iodeto de propídio para identificar necrótica células de acordo com as recomendações do fabricante. a citometria de fluxo
analisa
para as células de coloração da superfície foram tripsinizadas, lavadas com PBS e suspensas em PBS /0,5% w /v de albumina de soro bovino (BSA) suplementado com 0.02% w /v de sódio azida. Para a indução de moléculas do MHC, as células foram incubadas com 20 ng /mL de interferão-γ (IFN-y; Peprotec, Londres, Reino Unido) durante 24 horas antes da colheita. A ligação não específica de anticorpos contra os receptores Fc foi bloqueada por pré-incubação das células com 1 jig /10 6 células de anticorpo anti-CD16 /CD32 monoclonal (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha) durante 15 min . Subsequentemente, as células foram incubadas com 0,5 ug /10 6 células do mAb de interesse durante 30 min a 4 ° C, lavadas duas vezes e, se necessário, subsequentemente feito reagir com um anticorpo de segundo passo, durante 15 min a 4 ° C . As células foram lavadas duas vezes e analisadas utilizando um FACScan (BD, Mountain View, CA). As células mortas foram excluídas por coloração com iodeto de propídio. Foram utilizados os seguintes reagentes e os mAbs contra antigénios murinos da BD Pharmingen: ficoeritrina (PE) -conjugated IgG de ratinho 2a anti-IA b, rato biotinilado IgG 2a anti-H-2D b , ratinho IgG conjugado com PE 2aanti-H-2K b, conjugado com PE anti-ratinho CD80 /B7-1, de rato conjugado com PE IgG 2a-CD40 anti-rato, conjugado com PE rato IgG 2a anti-ratinho CD86 /B7-2, isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated, hamster arménio IgG 2 anti-ratinho CD80 /B7-1. rato conjugado com FITC IgG 1 mAb R3-34, rato PE-conjugado IgG 1 mAb R3-34, rato PE-conjugado IgG 2a SIRP anti-rato, conjugado com FITC hamster Armenian IgG 2anti-KLH e rato PE-conjugado IgG 2amAb serviu como controlos isotípicos. De murganho anti-rato mAb CEACAM1 CC1, rato anti-ratinho CEACAM1 AgB10 [24] e de rato anti-E-caderina e anti-rato mAb EpCAM foram uma oferta amável de K. Holmes, Universidade do Colorado, BB Cantor, Charité Berlim, e P. Ruf, Trion Research, Munique, respectivamente. O rato com reactividade cruzada anti-humano de mAb CEACAM 4/3/17 (específico para o CEA humano /CEACAM5 no rato) foram adquiridos a GENOVAC (Freiburg, Alemanha). Os anticorpos de ratinho foram detectados com cabra conjugado com PE anti-IgG de ratinho, anticorpos de rato com burro conjugado com FITC anti-rato-IgG
(DAKO). Detecção de CEA e do SV40 Tag por Western blotting
em crescimento exponencial de células de carcinoma gástrico , células Cos7L, transfectantes Cos7L-CEA, células Meth-a e transfectantes Meth-a-CTAG que expressam um Tag SV40 citoplasma localizado truncado foram colhidas por tripsinização. As células foram lavadas três vezes em PBS e lisaram-se a uma densidade de 10 6 células /ml em tampão de lise. A concentração de proteína foi determinada utilizando o Kit de Ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, Illinois, EUA). Os extractos celulares correspondentes a 10 ug de proteína foram separados por electroforese através de géis de 10% poliacrilamida-SDS (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), transferidos para membranas de fluoreto polyvinyliden e incubadas com mAb CEACAM 10 ug /ml de anti-humano ou um 4/3/17 1: 100 hamster diluído anti-SV40 Tag anti-soro (um presente amável por K.-H. Scheidtmann, Universidade de Bonn). reagiram anticorpos ligados com anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano e visualizados usando um sistema de detecção baseado em quimiluminescência. (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemanha) | celular determinação tempo de duplicação
In vitro
tempos de duplicação de linhas celulares foram determinadas por plaqueamento das células de carcinoma gástrico em placas de 24 poços em MT com os números de células de partida indicados e contagem das amostras de células a partir de poços em triplicado, após tripsinização suave a cada 3 dias durante 21 dias. A in vivo
tempos de duplicação foram calculados a partir de medições do volume do tumor (ver abaixo) após a inoculação com três números de células de partida diferentes (três ratinhos por grupo). Os tempos de duplicação foram calculados a partir da fase logarítmica das curvas de crescimento.
tumorigenicidade e imunogenicidade da célula de linhas de Compra de células tumorais de avaliação da tumorigenicidade foram lavadas três vezes em PBS e 50 ul de suspensões de células com o número de células indicadas foram injectadas por via subcutânea no flanco direito raspado dos ratinhos. Para determinar a imunogenicidade, 10 7 células tumorais /ml foram lisadas por dois ciclos de congelamento e descongelamento consecutivos. Os ratinhos foram imunizados quatro vezes em intervalos semanais com 10 6 células tumorais lisadas no flanco direito. Três semanas mais tarde, os ratinhos foram desafiados por injecção subcutânea de 3 × 10 6 células tumorais viáveis ​​no flanco esquerdo. Os grupos experimentais consistiu de 4-6 ratos. O desenvolvimento do tumor foi seguido através de medições em série do tamanho do tumor e o volume do tumor foi calculado de acordo com a equação: volume do tumor (mm 3) = d 2 × D /2, onde d e D eram mais curtas e o diâmetro mais longo do tumor, respectivamente. Os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume de 300 mm 3.
Geração de linfócitos específicos do Tag T citotóxicos (CTL) e a estimulação por linhas celulares de carcinoma gástrico
CTL foram geradas como previamente descrito [23] . Resumidamente, os ratinhos foram inoculados por via intradérmica, com 1 uM partículas de ouro revestidas com um plasmídeo de expressão Tag (BMG /CT-Ag.1 [23]) na pele abdominal rapada usando uma pressão de hélio (200 psi) alimentado dispositivo biolístico (Helios pistola de genes; bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha). As células do baço obtidas de 14 dias pós-vacinação foram re-estimuladas em intervalos semanais com RBL5 irradiado /T transfectantes em meio RPMI-1640 /FCS a 10% suplementado com 30 UI /ml de IL-2. RBL5 /T é uma linha celular transformada Rauscher-vírus T-linfoma derivada de um (H-2b) do rato C57BL6 transfectadas com um plasmídeo SV40 Tag expressão. Para gerar CTL, células do baço feita 10 dias após a vacinação específico do epitopo foram re-estimuladas in vitro com células RBL5 pulsadas com péptido irradiado, Tag. O T1, T2 /3 e T4 especificidade de epitopo de CTL foi controlado por determinação do teor de IFN-y dos meios de comunicação com a estimulação com células alvo pulsadas com péptido utilizando ELISA. Detecção de citoquinas por ELISA
Compra de captura e de detecção de IFN-y em sobrenadantes por sanduíche convencional ELISA, utilizou-mAb R4-6A2 e biotinilado mAb XMG1.2, respectivamente (BD Pharmingen). A extinção foi analisada em 405/490 nm num leitor de ELISA TECAN microplacas (TECAN Crailsheim, Alemanha) com o software easywin (TECAN). O limite de detecção do ELISA para IFN-y foi de 20 pg /ml.
Resultados
Estabelecimento e fenótipo do carcinoma gástrico linhas celulares
De amostras de carcinoma gástrico 8 7 linhas celulares poderiam ser estabelecidos. Quatro linhas de células foram derivadas de CEA424 ratos /Tag-transgênica (424GC, de um rato macho; mGC3, do sexo feminino; mGC5, do sexo masculino, e mGC8, feminino) e três linhas de camundongos CEA424 /Tag-CEA-transgênica (mGC2 CEA, do sexo masculino; mGC4 CEA, do sexo masculino; mGC11 CEA, do sexo feminino). O tempo necessário para obter culturas de células epiteliais puros variou muito (média de 6 meses, faixa de 3-16 meses). Embora as células tumorais crescem como células aderentes em cultura, eles tendem a formar agregados em vez de espalhar ao longo do substrato de cultura (Fig. 1A). A origem epitelial das células do tumor foi comprovada por critérios morfológicos, incluindo a presença de mucina no interior das células (Fig. 1A) e a análise de expressão de proteína normalmente expressa em células epiteliais (EpCAM, E-caderina, CEACAM1) (Fig. 2A) . Um teor reduzido de mucina foi encontrada em todas as linhas de células em comparação com o conteúdo em células epiteliais gástricas normais mas semelhante à encontrada nas células tumorais no carcinoma gástrico em ratos transgénicos (Fig. 1A e [13]). Todas as linhas de células exibido CEACAM1 e EpCAM na sua superfície excepto mGC11 CEA, nenhum deles expressa a caderina-E (Fig. 2A e dados não mostrados). Todas as linhas celulares expressavam MHC de classe I H-2K e, e a um nível muito mais baixo, moléculas de H-2d (Fig. 2B). A expressão de ambas as proteínas foi fortemente realçada pela estimulação de IFN-y. Não foi detectada a expressão de moléculas de MHC de classe II (I-Ab) (Fig. 2B e dados não mostrados). CD54, CD80, CD86 ou CD95 não foram detectados em todas as linhas de células (dados não apresentados). A Figura 1 Morfologia de linhas celulares de carcinoma gástrico cultivadas como culturas em monocamada ou em três dimensões esferóides. (A) As linhas de células mostram uma morfologia epitelial ligeiramente diferente. A maioria das células de todas as linhas de células contêm um vacúolo intracelular característica (setas), que provavelmente contém material mucinoso manchado de vermelho pelo método PAS (última imagem da direita no painel inferior). (B) esferoidal formado por cultura de células tumorais mGC8 em agar mole: esquerda, contraste de fase; direita, coloração por fluorescência das células necróticas com iodeto de propídio (vermelho) e células apoptóticas com annexinV marcado com FITC (verde, marcadas por pontas de seta) tal como descrito em "Materiais e Métodos". Ampliação: barras correspondem a 10 um. MGC, carcinoma gástrico murino.
Figura expressão na superfície celular de dois marcadores epiteliais (A) e MHC de classe I e II, as moléculas (B). Fizeram-se reagir as linhas celulares do carcinoma gástrico, quer com marcado com PE (H-2Kb, H-2Db, a I-Ab) ou com mAb não marcado (CEACAM1, E-caderina, EpCAM), seguido por incubação com murganho anti-IgG marcado com PE ou FITC IgG anti-rato marcado com e analisadas por citometria de fluxo. Histogramas exibir os resultados obtidos com os anticorpos contra os antigénios relevantes com (cinza aberto) ou sem (preto aberto) antes de estimulação de IFN-y e antigénios irrelevantes (Gray curvas a cheio).
A fim de determinar o potencial das linhas celulares a utilizar para a geração de modelos de tumor tridimensional analisamos a formação de esferóides de células tumorais in vitro. Como ilustrado na Fig. 1B as linhas celulares de células de tumor formado esferóides compactos após 8 dias de cultura quando as células 103 foram semeadas em placas de 96 poços de agar-revestido macio. Apenas a variação intra-experimental menor foi observada sobre o tamanho dos esferóides. A coloração com iodeto de propídio e marcado com FITC anexina V demonstrou que, pelo menos, a camada de superfície dos esferóides consistia de células viáveis ​​de células mortas com muito poucas ligados a ele (Fig. 1B).
Expressão do transgene por as linhas celulares de carcinoma gástrico
CEA e Tag pode servir como antigénios específicos de tumores (TSA) ou antigénios associados a tumores (TAA) após o transplante das linhas celulares de tumor recentemente criadas em imunocompetentes C57BL singeneicos /6 e ratinhos CEA ou TAG-transgénico, respectivamente. Embora sejam de importância na formação de tumores, a expressão do transgene etiqueta não é sempre encontrado em linhas celulares tumorais derivadas de ratinhos transgénicos-Tag, assim como em linhas celulares tumorais TRAMP [25]. Isto levou-nos a analisar a expressão de MHC de classe e apresentação restrita-I do transgene Tag, assim como a expressão de CEA nas linhas celulares de carcinoma gástrico estabelecidos. expressão na superfície celular do CEA foi analisado em linhas celulares derivadas de tumores gástricos de ratinhos transgénicos duplos por citometria de fluxo e análise de Western blot. Embora a expressão do transgene de CEA é regulada pela região promotora completa do gene CEA humano a expressão da etiqueta é controlada por um mínimo -424 /-8 promotor CEA pb (Fig. 3A). Todas as três linhas de células duas vezes transgénicos expressa CEA na superfície da célula (Fig. 3B). Na linha celular de carcinoma gástrico mGC2 CEA CEA transgene expresso exibiram um peso molecular de 180 kDa, semelhante à encontrada em células de rim de macaco verde africano transformado com SV40 estavelmente transfectadas com um vector de expressão de CEA e a CEA encontrados em seres humanos. Como esperado, não CEA foi detectada em células 424GC, que foram estabelecidas a partir de um ratinho transgénico Tag-CEA-negativa (Fig. 3C). Tag foi encontrado para ser expressa por transferência de Western e análise de imunofluorescência em todas as linhas celulares derivadas a partir de murganhos simples e duplo-transgénicos (Fig. 3D e os dados não mostrados). Esta descoberta suporta também a origem das linhas celulares de carcinomas do estômago. Além disso, a linha celular de 424GC eficientemente apresentados péptidos derivados de Tag endogenamente transformados, especialmente o epítopo T1, numa MHC-I restrito maneira como determinado pela indução de IFN-y específica de secreção-byTag CTL (Fig. 4A). Além disso, as linhas celulares foram eficientemente mortas por CTL específico para Tag em ensaios citotóxicos (Fig. 4B). Figura 3 Expressão da CEA e Tag por linhas celulares de carcinoma gástrico derivados de CEA424 /Tag- ou CEA424 /Tag × ratos CEA-transgênica. (A) Estrutura do CEA e CEA424 transgenes /Tag. Os exons 1-10 do gene CEA humano contido dentro da inserção de cosCEA1 clone cosmídeo [14] são mostrados como caixas codificadas por cores (azul claro, líder, vermelho, IgV-como domínio; azul IgC como domínio; cinza, domínio transmembrana;.. brancos, 5 'e exões da região 3' não traduzida sequências flanqueadoras vetor estão indicados como caixas pretas a localização do CEA mínima promotor presente no transgene do gene do SV40 Tag é indicado por linhas pontilhadas, os nomes das linhas transgénicas são mostrados na margem esquerda. (B) a citometria de fluxo foi realizada por marcação das células indicadas ou com o Acm específico de CEA-26/3/13 (curvas a cheio) ou um anticorpo do mesmo isotipo (curvas abertas), seguido de cabra marcado com PE anticorpos IgG anti-rato. (C, D) Para a análise Ocidental, 10 ug de proteína total a partir de extratos de células 424GC ou mGC8 estabelecidas a partir de ratos CEA424 /tag-transgênicos e células mGC2CEA e mGC4CEA de CEA424 /Tag × ratos CEA-transgênica foram tamanho separadas por electroforese SDS em gel de poliacrilamida, transferidas para uma membrana e feita reagir com a CEA específicos de mAb 26/3/13 (C) ou anticorpos de hamster anti-marcador policlonais (D). Os extractos de células Meth-A Cos7L-CEA e estavelmente transfectadas com vectores de expressão codificando CEA ou uma etiqueta falta uma região com o sinal de localização nuclear (CTAG) serviu como um controlo positivo. Os tamanhos dos marcadores proteicos estão indicados nas margens esquerda.
Figura 4 apresentação de MHC de classe I-restringida de epítopos de TAG pela linhas de células de carcinoma gástrico murinos. (A) Epitopo-CTL específica gerada em ratinhos C57BL /6 por imunização com ADN com um vector de expressão Tag e posterior expansão por estimulação in vitro com células RBL5 carregadas com péptido TAG são incubadas com 424GC irradiado, 424 fibroblastos, RBL5 e Tag T1, T2 /3 ou células T4 RBL5 pulsadas com péptido, durante 24 h e a sua secreção de IFN-y no meio de cultura foi determinada por ELISA. A secreção de IFN-y por CTL estimuladas com células 424GC indica que estas células presentes péptidos específicos de SV40Tag de forma MHCI-restrito. (B) Coculture de 424GC e 424 fibroblastos foram tratados com CTL específicos de etiqueta 107 numa placa de petri, durante 48 h. Em seguida, as células não-aderentes (mortas) foram removidos. Esquerda, co-cultura antes do tratamento CTL; direita, co-cultura após o tratamento. As setas indicam a posição das células tumorais antes da adição de CTL
tumorigenicidade das linhas de células de carcinoma gástrico
Para determinar a tumorigenicidade das linhas de células, vários números (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) de células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos C57BL /6. Todas as linhas celulares eram capazes de formar tumores em 100% dos animais, se, pelo menos, 3 × 10 5 células de tumor foram injectados (Fig. 5A). Os tumores cresceram quase exponencialmente, sem qualquer atraso até que eles atingiram um volume de 300 mm 3. Sem metástases à distância pode ser detectado durante o tempo de observação. A análise Western blot realizado em tumores transplantados demonstraram que ambos os transgenes foram expressos pelas linhas celulares in vivo
(dados não mostrados). Os tempos de duplicação das células tumorais in vivo
a uma carga de tumor a partir de 10 6 células variou entre 7,2 (mGC8) e 13,8 dias (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
, todas as linhas celulares exibiram tempos de duplicação semelhantes, de cerca de 3 dias (Fig. 5B). Nós ainda comparado a formação do tumor subcutâneo das linhas celulares de tipo selvagem (C57BL /6) e ratinhos transgénicos. Não foram observadas diferenças significativas na tomada do tumor e o crescimento do tumor para a 424GC linha celular quando injetado subcutaneamente em tipo selvagem ou ratos CEA424 /Tag-transgênica (Fig. 6A) e para mGC11 células CEA após a injeção em tipo selvagem e CEA424 /Tag-CEA-transgênica camundongos (Fig. 6B). Figura 5 in vivo (A) e em características de crescimento in vitro (B) de linhas de células de carcinoma gástrico murinos. Três ratos cada foram injectados com células de tumor as doses indicadas. O crescimento do tumor foi quantificada por duas medições perpendiculares do diâmetro do tumor e do cálculo do volume, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Para determinar in vitro características de crescimento, as células foram cultivadas em placas de 24 poços a partir de células com os números indicados. Em diferentes pontos de tempo as células a partir de poços em triplicado foram colhidas e contadas. Os resultados são apresentados como média +/- desvio padrão (SD). As melhores curvas de ajuste, bem como tempos de duplicação em dias (indicados entre parêntesis) foram calculados utilizando o software GraphPad.
Figura 6 Crescimento de linhas celulares de carcinoma gástrico no tipo selvagem e ratinhos transgénicos. 3 × 105 células 424GC foram injectados subcutaneamente em ratinhos C57BL /6 e ratinhos CEA424 /Tag-transgénicos (A) ou de 3 × 105 células mGC11CEA foram injectadas em ratinhos C57BL /6 e CEA424 /Tag × ratinhos transgénicos CEA-dupla (B). O crescimento do tumor foi quantificada por duas medições perpendiculares do diâmetro do tumor e do cálculo do volume, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são apresentados como média +/- SD (n = 3).
Imunogenicidade do carcinoma gástrico linhas celulares
O crescimento semelhante das linhas de células de tumor no tipo selvagem e ratinhos transgénicos indica que não há resposta imune significativa para quer antigénio tumoral (Tag, CEA) ocorreu em ratinhos portadores de tumor. Na verdade, nenhum CTL específicos de etiqueta poderia ser identificada no baço de ratinhos portadores de tumores de tipo selvagem sobre o crescimento subcutâneo progressiva de células do carcinoma gástrico expressam Tag (dados não mostrados). No entanto, quando as linhas celulares transgénicas duplas cresceram em ratos, anticorpos específicos de CEA pode ser identificado no tipo selvagem C57BL /6, mas não em ratinhos transgénicos-CEA (Fig. 7A). Além disso, três imunizações de ratinhos C57BL /6 com 106 células tumorais mGC8 congelado-descongelado, em intervalos semanais, quer impediu o crescimento dos injectada subcutaneamente células mGC8 vivo completamente ou desenvolvimento de tumor foi retardada por cerca de três semanas, dependendo da dose de células de tumor injectado (Fig. 7B , C). Estas experiências demonstram que as linhas de células de tumor são imunogénicos em determinadas condições. No entanto, ratinhos C57BL /6 não montar espontaneamente um tumor eficiente resposta imunitária ao antigénio tumoral, quer durante o crescimento do tumor subcutâneo limitativo progressão. Figura 7 Imunogenicidade de células MGC. anticorpos (A) anti-CEA foram determinados no soro de ratinhos C57BL /6 e CEA-transgénicos utilizando citometria de fluxo. Todos os ratinhos tinham tumores de crescimento progressivo, sem necrose evidente após o transplante e o crescimento das linhas celulares indicadas, durante 35-40 dias. mGC4CEA células foram incubadas com o soro dos ratos indicados em diferentes diluições e os anticorpos primários ligados foram detectados com um anticorpo anti-ratinho conjugado com PE. (B, C) de três ratinhos C57BL /6 ratos cada foram injectados subcutaneamente três vezes em intervalos semanais com 1 × 106 células mGC8 mortos por dois ciclos de congelamento e descongelamento. Duas semanas após a última vacinação, os ratinhos foram desafiados por injecção com 1 x 106 (B) e 3 × 106 (C) células vivas mGC8, respectivamente (círculos preenchidos). Como um controlo, as células tumorais foram injectadas em ratinhos não imunizados (círculos abertos). Os volumes tumorais foram calculados como descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são apresentados como valores médios +/- SD.
Discussão
O objetivo principal do presente estudo foi estabelecer um modelo terapêutico do câncer gástrico em ratos imunocompetentes que iria fornecer um modelo animal para avaliar a imunidade anti-tumor e estratégias imunoterapêuticas.

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