Charakterisierung von Magenlinien von CEA424 /SV40 T-Antigen-transgenen Mäusen etablierten Zell Adenokarzinom mit oder ohne menschliches CEAtransgene

Charakterisierung von Magen-Adenokarzinom-Zelllinien etabliert aus CEA424 /SV40 T Antigen
-transgene Mäuse mit oder ohne menschliches CEA
Transgen
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkarzinom ist eine der häufigsten Krebserkrankungen weltweit. Patienten mit Magenkrebs in einem fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung haben eine schlechte Prognose, aufgrund der begrenzten Wirksamkeit der verfügbaren Therapien. Daher ist die Entwicklung neuer Therapien, wie Immuntherapie für die Behandlung von Magenkrebs von größter Bedeutung. Da die Nutzbarkeit bestehender präklinischen Modellen für die Bewertung von Immuntherapien für Magen-Adenokarzinome begrenzt ist, war das Ziel der vorliegenden Studie murinen in vivo
Modelle zu schaffen, die die schrittweise Verbesserung von Immuntherapien für Magenkrebs ermöglichen.
Methoden
Da keine Maus-Adenokarzinom des Magens Zelllinien zur Verfügung stehen wir vier Zelllinien etabliert (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) aus spontan entwickelnden Tumoren von CEA424 /SV40 T-Antigen (CEA424 /Tag) Mäuse und drei Zelllinien aus doppelt transgenen Abkömmlinge von CEA424 /Tag Mäuse mit menschlichen carcinoembryonales Antigen (CEA) verpaart -transgene (CEA424 /Tag-CEA) Mäuse (MGC2 CEA, MGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag ist eine transgene C57BL /6-Mausstamm den Tag unter der Kontrolle eines Promotors -424 /-8 bp CEA-Gen beherbergen, das im Drüsenmagen zur Entwicklung von invasivem Adenokarzinom führt. Die Tumorzelllinien etabliert von CEA424 /Tag-CEA-Mäuse exprimieren das gut definierte Tumorantigen CEA unter der Kontrolle seiner natürlichen regulatorischen Elemente.
Ergebnisse | Die epithelialen Ursprungs der Tumorzellen wurde durch morphologische Kriterien erwiesen, einschließlich der Gegenwart Mucin innerhalb der Zellen und die Expression der Zelladhäsionsmoleküle EpCAM und CEACAM1. Alle Zelllinien exprimieren konsequent die Transgene CEA und /oder Tag und MHC-Klasse-I-Moleküle auf ihre Anfälligkeit für die Lyse durch Tag-spezifischen CTL führt in vitro
. Trotz der Präsentation von CTL-Epitope aus den Transgen abgeleiteten Produkten die Tumorzelllinien tumorigenen waren, wenn sie in C57BL gepfropft /6, CEA424 /Tag oder CEA424 /Tag-CEA-transgenen Wirte und keine signifikanten Unterschiede in der Tumor nehmen und das Tumorwachstum beobachtet in die verschiedenen Hosts. Obwohl keine spontane Tumorabstoßung wurde beobachtet, Impfung von C57BL /6 Mäusen, die mit Lysaten von Magenkarzinomzelllinien geschützt C57BL /6-Mäuse von Tumor-Challenge, die Tumorigenität der Tumorzelllinien in nicht-transgenen Mäusen des H-2 b demonstrieren Haplotyp.
Schlussfolgerung
Diese Tumorzelllinien in verschiedenen syngenen Wirten gepfropft sollte sich als sehr nützlich erwiesen Immuntherapie Regimen zu optimieren schließlich in transgenen Tieren entwickeln primären Magenkarzinomen getestet werden.
hintergrund und Magenkrebs ist die zweithäufigste Krebsart weltweit [1]. Es wird oft erst einem fortgeschrittenen Stadium erkannt wird; Folglich sind die 5-Jahres-Überlebensraten niedrig (10 bis 20%). Aufgrund lokaler Invasion und Metastasierung, Strahlentherapie oder Chemotherapie nicht wesentlich erhöht die Länge oder die Lebensqualität von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs. Daher sind die Entwicklung neuer neoadjuvante und adjuvante Behandlungsmethoden erforderlich. Immunotherapy könnte eine vielversprechende Alternative Option sein. Eine Anzahl von Immuntherapien wie adoptiven Transfer von tumorspezifischen T-Zellen, und die Impfung entweder undefiniert Tumorantigene von Tumorlysaten und Tumorzelllinien oder definierte Tumorantigene durch dendritische Zellen allgemein vorgestellt abgeleitet unter Verwendung werden für verschiedene Krebsarten evaluiert [2, 3] . Für Magenkrebs wurde die Immuntherapie nicht ernsthaft in Betracht wegen dem Konzept, dass Magenkrebs ist schlecht immunogen gemacht. Daher ist nur eine geringe Anzahl von klinischen Immuntherapie Studien haben berichtet [4-7]. Darüber hinaus haben nur eine begrenzte Anzahl von Tumor-assoziierten Antigenen mit potentiellem Nutzen für die Immuntherapie identifiziert worden [8-11]. Folglich kann die Fähigkeit des Immunsystems zu erkennen und Magenkarzinome auszurotten ist weitgehend unbekannt. Um einen Einblick in die Wirksamkeit verschiedener Immuntherapien zur Behandlung von Magenkrebs zu gewinnen und den zugrundeliegenden Mechanismus der induzierten Immunantworten Tiermodellen von Adenokarzinom des Magens zu erläutern unverzichtbar sind.
Zu diesem Zweck haben einige Gruppen einschließlich unsere kürzlich etablierten transgenen oder Knock -out Mausstämme, die Magen-Adenome oder Adenokarzinome in verschiedenen Teilen des Magens nach verschiedenen Latenzen [12] zu entwickeln. Wir haben ein transgenes Magenkarzinom C57BL /6-Maus-Modell von einem humanen karzinoembryonales Antigen (CEA) Genpromotor (von -424 bis -8 der Translationsstartstelle) [13 gesteuert auf der Basis eines SV40 große T-Antigen (SV40 Tag) entwickelt Transgen ]. In 100% der Tiere, dysplastische Kryptenbildung in der Magenschleimhaut wird in der Pylorusgegend bereits in 30 Tage alten CEA424 /SV40 Tag-transgenen Mäusen beobachtet. Dysplasien schreitet zu invasiven Karzinomen und von Tag 50 die ganze pyloric Magenschleimhaut durch Karzinomzellen ersetzt. Zwischen dem Alter von 90 bis 110 Tage werden die transgenen Mäuse moribund und sterben wahrscheinlich von undernourishment wegen einer Blockierung des Pylorus [13]. Die Steuerung des Tag-Expression durch einen minimal-Genpromotor CEA ermöglicht den Tumor gerichtete Expression von CEA durch CEA424 /SV40 Tag-transgener Mäuse mit humanem CEA Kreuzung
-transgene C57BL /6-Mäuse, die das Transgen CEA in einer ähnlichen Raum-Zeit auszudrücken Expressionsmuster wie beim Menschen [13, 14] zu finden. Der menschliche Tumormarker CEA wird in vielen menschlichen Adenokarzinomen, einschließlich mehr als 50% der Magenkarzinomen [15, 16] ausgedrückt. CEA wird zunehmend als Zielantigen für eine Vielzahl von Antikörper- und zellvermittelte Tumorimmuntherapie Ansätze [17-19]. CEA und Tag sind geeignet Immuntherapie Zielantigene, da eine Anzahl von T-Zell-Epitope dieser Antigene wurden in C57BL /6-Mäusen [20-22] identifiziert. Obwohl diese transgenen Mausstämme beim Menschen sehr eng Adenokarzinom des Magens Entwicklung spiegeln, das Experimentieren mit diesen Mäusen ist relativ zeitaufwendig und teuer wegen der Schwierigkeiten zu Tumorwachstum und die Anforderung der Zucht transgener Mäuse zu bestimmen. Daher ist es wünschenswert, eine syngene transplantierbare Tumorsystem Magen-Adenokarzinome in immunkompetenten Mäusen für die Optimierung eines gegebenen Immuntherapie Protokoll zu haben, bevor es in den transgenen Mäusen bewertet. Hier beschreiben wir Magen-Adenokarzinom-Zelllinien sind Maus etabliert aus spontan entwickeln Tumoren von SV40 Tag-transgenen Mäusen, die sowohl in syngenen Typ Wild tumorigenen und transgenen Mäusen.
Methoden
Mausstämme und Zelllinien
CEA424 /Tag- transgene Mäuse (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgenen Mäusen (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) und F1-Mäusen aus einer Kreuzung zwischen CEA424 /Tag-transgenen und CEA-transgenen Mäusen vorher beschrieben wurden [13, 14]. Inzwischen sind die transgenen Linien wurden C57BL /6-Mäuse (H-2 b) für mehr als 15 Generationen rückgekreuzt. Die transgenen Linien sowie C57BL /6-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden gezüchtet und gehalten unter Standarderregerfreien Bedingungen in der Tieranlage des Instituts für Chirurgische Forschung, Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Tierversuche wurden nach Genehmigung durch die lokalen Tierschutzkomitee durchgeführt. Für tumorigenicity und Immunogenität Assays Mäuse wurden bei 8-12 Wochen alt verwendet. African green monkey Niere Cos7L Zelllinie wurde von der American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten. Die Balb /c-abgeleiteten Fibrosarkom Meth-A wurde freundlicherweise von W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg) zur Verfügung gestellt. Meth-A-CEA-Zellen wurden durch Transfektion von Meth-A-Zellen mit den pRc /CMV-CEA-Expression unter Verwendung von Plasmiden FuGENE ™ 6 Transfektionsreagenz (Roche Molecular Biochemicals, Schweiz), die nach den Anweisungen des Herstellers. Meth-A-CTAG und RBL5 /T Transfektanten wurden zuvor beschrieben [23].
Etablierung von Magenkarzinomzelllinien
Die Magenkarzinomen verwendet Tumorzelllinien zu etablieren aus 8 verschiedenen, 13 Wochen alten Mäusen erhalten wurden. Vier abgeleitet von CEA424 /Tag-transgenen Mäusen und 4 von CEA424 /TAg-CEA-doppelt-transgenen Mäusen. Die Namen der Zelllinien von diesen Mäusen abgeleitet werden durch das hochgestellte "CEA" gekennzeichnet. (; PAA Laboratories, Coelbe, Deutschland FCS "Gold"), 2 mM L-Glutamin, 100 U /ml Penicillin, 100 ug /ml Streptomycin, nicht-essentielle Alle Kulturen wurden in RPMI1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum durchgeführt Aminosäuren und 1 mM Natriumpyruvat (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), bezeichnet weiter als Tumormedium (TM). Tumorgewebe wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit 200 ug /ml Gentamycin und 2,5 ug /ml Amphotericin B (GIBCO /Invitrogen), geschnitten in 1 mm 3 Stück mit einem Skalpell und plattiert in Gewebekultur ausgiebig gewaschen Kolben, die TM. Das Kulturmedium wurde alle 3-4 Tage gewechselt. Epithelzellen und Fibroblasten aus den Gewebefragmente wurden durch wachsende Zell scraping selektive Trypsinierung und selektive Passagierung mit 1.000 U /ml Kollagenase und 500 U /ml Hyaluronidase (Biochrom, Berlin, Deutschland) abgetrennt. Während Dissoziation wurden die Kolben unter einem Umkehrmikroskop beobachtet und die Verdauung wurde gestoppt, wenn Fibroblasten aber nicht Epithelzellen wurden abgelöst (Trypsin) oder umgekehrt (Kollagenase /Hyaluronidase). Dieses Verfahren wurde wöchentlich wiederholt, bis alle Fibroblasten aus den Tumorzellkulturen eliminiert wurden. Bei der Generierung der 424GC-Zelllinie wurde eine Fibroblastenkultur von verunreinigenden Fibroblasten etabliert (424 Fibroblasten). Sphäroide innerhalb von 5-7 Tagen gebildet nach dem Aussäen 0,5 x 10 3 mGC8 Zellen in Edel-Agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) -beschichteten 96-Well-Platten (TPP-Biochrom, Berlin, Deutschland) in 200 &mgr; l TM die alle zwei Tage durch frisches Medium ersetzt. (; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Deutschland Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit) zum Nachweis apoptotischer Zellen oder mit Propidiumiodid zu nekrotischen identifizieren Lebensfähigkeit der Zellen auf der Oberfläche der Sphäroide beurteilen, wurden Sphäroide mit FITC-markiertem Annexin V, inkubiert Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
Durchflusszytometrie analysiert
zur Oberflächenfärbung wurden Zellen trypsinisiert, mit PBS gewaschen und suspendiert in PBS /0,5% w /v Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,02% w /v Natrium supplementiert Azid. (; Peprotec, London, UK IFNy) für 24 Stunden vor der Ernte für die Induktion von MHC-Molekülen wurden die Zellen mit 20 ng /ml Interferon-γ inkubiert. Nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren wurde mit 1 durch Vorinkubation der Zellen blockiert ug /10 6 Zellen von Anti-CD16 /CD32 monoklonaler Antikörper (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) für 15 min . Anschließend wurden die Zellen mit 0,5 &mgr; g /10 6 Zellen des mAb von Interesse für 30 min bei 4 ° C, zweimal gewaschen und gegebenenfalls anschließend mit einem zweiten Schritt Antikörper für 15 min bei 4 ° C . Die Zellen wurden zweimal gewaschen und analysiert, um eine FACScan (BD, Mountain View, CA) verwendet wird. Tote Zellen wurden durch Propidiumiodid-Färbung ausgeschlossen. Die folgenden Reagenzien und monoklonaler Antikörper gegen Maus-Antigene von BD Pharmingen wurden verwendet: Phycoerythrin (PE) konjugiertem Maus-IgG 2a anti-IA b, b biotinylierten Maus-IgG 2a anti-H-2D , PE-konjugierten Maus-IgG 2aanti-H-2K b, PE-konjugierten anti-Maus-CD80 /B7-1, PE-konjugierten Ratten-IgG 2a anti-Maus-CD40, PE-konjugierten Ratten-IgG 2a anti-Maus-CD86 /B7-2, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugierte, armenisch Hamster-IgG 2 Anti-Maus-CD80 /B7-1. FITC-konjugierten Ratten-IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugierten Ratten-IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugierten Maus-IgG 2a anti-Ratte SIRP, FITC-konjugierten Armenian Hamster-IgG 2anti-KLH und PE-konjugierten Ratten-IgG 2amAb diente als Isotypkontrollen. Maus anti-Maus-CEACAM1 mAb CC1, Ratte anti-Maus-CEACAM1 AgB10 [24] und Ratten-Anti-Maus-E-Cadherin und anti-Maus-EpCAM mAbs waren eine Art Geschenk von K. Holmes, University of Colorado, BB Sänger, Charité Berlin, und P. Ruf, Trion Forschung, München, respectively. Die kreuzreaktive Maus anti-human CEACAM mAb 4/3/17 (spezifisch für Human-CEA /CEACAM5 in der Maus) wurden aus GENOVAC (Freiburg, Deutschland) erworben. Murine Antikörper wurden mit PE-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG, Ratten-Antikörper mit FITC-konjugiertem Esel-anti-Ratte-IgG (DAKO) detektiert.
Nachweis von CEA und SV40 Tag durch Western-Blotting
Exponentiell wachsende Magenkarzinomzellen , Cos7L Zellen, Cos7L-CEA-Transfektanten, Meth-A-Zellen und Meth-A-CTAG-Transfektanten, die ein verkürztes cytoplasmatisch befindet SV40 Tag wurden durch Trypsinisierung geerntet exprimieren. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und bei einer Dichte von 10 6 Zellen /ml in Lysepuffer lysiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA) bestimmt. Zellextrakte auf 10 ug Protein entsprachen, wurden mittels Elektrophorese durch 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) abgetrennt, Fluorid Membranen polyvinyliden transferiert und inkubiert mit 10 &mgr; g /ml anti-human CEACAM mAb 4/3/17 oder 1: 100 verdünnt Hamster anti-SV40-Tag-Antiserum (ein freundliches Geschenk von K.-H. Scheidt, Universität Bonn). Gebundene Antikörper wurden mit Meerrettich-Peroxidase-markierten sekundären Antikörper reagierten und visualisiert eine Chemilumineszenz-basierten Detektionssystem verwendet wird. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland)
Zellverdopplungszeit Bestimmung
In vitro
alle 3 Tage für 21 Tage Verdopplungszeiten der Zellinien wurden durch Ausplattieren der Magenkarzinomzellen in 24-Well-Platten in TM bei den angegebenen Ausgangszellzahlen und Zählen der Zellproben von jeweils drei Wells nach vorsichtigem Trypsinisierung bestimmt. Die in vivo
Verdopplungszeiten wurden aus Tumorvolumenmessungen berechnet (siehe unten) nach Inokulation mit drei unterschiedlichen Ausgangszellzahlen (drei Mäuse pro Gruppe). Verdopplungszeiten wurden aus der log-Phase der Wachstumskurven berechnet.
Tumorigenität und Immunogenität der Zellinien
Für Tumorigenität Beurteilung Tumorzellen wurden dreimal in PBS gewaschen und 50 ul Zellsuspensionen mit den angegebenen Zellzahlen wurden injiziert subkutan in die rasierte rechte Flanke der Mäuse. Um zu bestimmen, wurden die Immunogenität, 10 7 Tumorzellen /ml nach zwei aufeinanderfolgenden Frost-Tau-Zyklen lysiert. Die Mäuse wurden viermal in wöchentlichen Abständen mit 10 6 lysierten Tumorzellen in die rechte Flanke immunisiert. Drei Wochen später wurden die Mäuse durch subkutane Injektion von 3 × 10 6 lebensfähige Tumorzellen in die linke Flanke in Frage gestellt. Versuchsgruppen bestand aus 4-6 Mäusen. Tumorentwicklung wurde, gefolgt von seriellen Messungen der Tumorgröße und das Tumorvolumen wurde berechnet nach der Formel: Tumorvolumen (mm 3) = d 2 × D /2, wobei d und D der kürzeste und die längste Tumordurchmesser, respectively. Tiere euthanasiert, wenn die Tumore ein Volumen von 300 mm erreicht 3.
Erzeugung von Tag-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und die Stimulation von Magenkarzinomzelllinien
CTLs wurden erzeugt, wie zuvor beschrieben [23] . Kurz gesagt, wurden Mäuse mit 1 &mgr; m Goldpartikeln mit einem Tag-Expressionsplasmid (BMG /cT-Ag.1 [23]) in die rasierte Bauchhaut mit einem Heliumdruck (200 psi) betrieben biolistischen Vorrichtung (Helios Genkanone beschichtet intradermal inokuliert; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland). Milzzellen, erhalten 14 Tage nach der Impfung wurden in wöchentlichen Intervallen mit bestrahlten RBL5 /T-Transfektanten in RPMI-1640/10% FCS, ergänzt mit 30 IU /ml IL-2 restimuliert. RBL5 /T ist ein Rauscher-Virus-transformierten T-Lymphom-Zelllinie, abgeleitet von einem C57BL6 (H-2b) Maus mit einem SV40 Tag Expressionsplasmid transfiziert. Zur Epitop-spezifischen CTL, die Milzzellen entnommen 10 Tage nach der Impfung erzeugt wurden in vitro mit bestrahlten, Tag-Peptid-gepulste RBL5 Zellen restimuliert. Die T1, T2 /3 und T4 Epitop Spezifität der CTL durch Bestimmung der IFN &ggr; Inhalt von Medien bei Stimulierung mit Peptid-gepulsten Zielzellen kontrolliert wurde unter Verwendung von ELISA.
Cytokine Nachweis durch ELISA
zum Einfangen und zum Nachweis von IFN &ggr; in Überständen durch konventionelle Sandwich-ELISA verwendeten wir mAb R4-6A2 und biotinyliertem mAb XMG1.2 bzw. (BD Pharmingen). Extinktion bei 405/490 nm auf einem TECAN Mikrotiter-ELISA-Reader (TECAN Crailsheim, Deutschland) mit der EasyWin Software (TECAN) analysiert. Die Nachweisgrenze des ELISA für IFNy betrug 20 pg /ml.
Ergebnisse | Einrichtung und Phänotyp der Magenkarzinomzelllinien
Von 8 Magenkarzinomproben 7 Zelllinien etabliert werden konnte. Vier Zelllinien wurden abgeleitet von CEA424 /Tag-transgenen Mäusen (424GC, von einer männlichen Maus; mGC3, weiblich; mGC5, männlich und mGC8, weiblich) und drei Linien von CEA424 /Tag-CEA-transgenen Mäusen (MGC2 CEA, männlich; MGC4 CEA, männlich; mGC11 CEA, weiblich). Die benötigte Zeit reine epithelialen Zellkulturen stark (Mittelwert 6 Monate, Bereich 3-16 Monate) variiert zu erhalten. Obwohl die Tumorzellen als adhärente Zellen in Kultur wachsen, neigen sie dazu, Aggregate zu bilden, anstatt über das Kultursubstrat ausbreitet (Fig. 1A). Die epithelialen Ursprungs der Tumorzellen wurde durch morphologische Kriterien erwiesen, einschließlich der Anwesenheit von Mucin in den Zellen (Fig. 1A) und dem Expressionsanalyse von Protein häufig in Epithelzellen exprimiert (EpCAM, E-Cadherin, CEACAM1) (Fig. 2A) . Einen verringerten Gehalt an Muzin wurde in allen Zelllinien im Vergleich mit dem Inhalt in normalen Magenepithelzellen aber ähnlich der in Tumorzellen innerhalb des Magenkarzinom in transgenen Mäusen (Fig. 1A und [13]) gefunden. Alle Zelllinien und CEACAM1 EpCAM auf ihrer Oberfläche mit Ausnahme mGC11 CEA angezeigt, keiner von ihnen exprimierten E-Cadherin (Fig. 2A und Daten nicht gezeigt). Alle Zelllinien exprimierten MHC Klasse I H-2K und und bei einem viel niedrigeren Niveau, H-2D-Molekülen (Fig. 2B). Expression der beiden Proteine ​​wurde stark von IFNy Stimulation verbessert. Keine Expression von MHC-Klasse-II-Moleküle (I-Ab) wurde nachgewiesen (Fig. 2B und Daten nicht gezeigt). CD54, CD80, CD86 oder CD95 wurden auf jeder Zellinie nicht nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Abbildung 1 Morphology von Magenkarzinomzelllinien als Monolayer-Kulturen oder als dreidimensionale Sphäroide gezüchtet. (A) Die Zelllinien zeigen eine etwas andere epitheliale Morphologie. Die meisten Zellen von allen Zelllinien enthalten eine charakteristische intrazelluläre Vakuole (Pfeile), die wahrscheinlich muzinöse Material rot gefärbt von der PAS-Verfahren (letztes Bild rechts in unteres Bild) enthält. (B) Sphäroid gebildet durch mGC8 Tumorzellen auf Weichagar Züchten: links, Phasenkontrast; rechts, Fluoreszenzfärbung von nekrotischen Zellen mit Propidiumiodid (rot) und apoptotischen Zellen mit FITC-markiertem AnnexinV (grün, durch Pfeilspitzen markiert), wie in "Material und Methoden" beschrieben. Vergrößerung: Balken entsprechen 10 &mgr; m. mGC, murine Magenkarzinom.
2 Zelloberflächenexpression von epithelialen Marker Abbildung (A) und MHC-Klasse-I und II-Moleküle (B). Magenkarzinom-Zelllinien wurden reagierten entweder mit PE-markiertem (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) oder mit nicht-markiertem mAb (CEACAM1, E-Cadherin, EpCAM), gefolgt von Inkubation mit PE-markiertem anti-Maus-IgG oder FITC -markierten anti-Ratte-IgG und durch Durchflusszytometrie analysiert. Histogramme zeigen die mit Antikörpern gegen relevante Antigene erzielten Ergebnisse mit (open grau) oder ohne (offene schwarz) vor IFNy Stimulation und irrelevante Antigene (gefüllte Kurven grau).
Um das Potential der Zelllinien zu bestimmen, verwendet werden für die Erzeugung von dreidimensionalen Tumormodellen wir Tumorzelle Sphäroid-Bildung in vitro analysiert. Wie in Fig. 1B die Zelllinien kompakte Tumorzelle Sphäroide gebildet nach 8 Tagen Kultur bei 103 Zellen in Weichagar-beschichteten 96-Well-Platten ausgesät. Nur geringe intra experimentelle Variation wurde in Bezug auf die Größe der Sphäroiden beobachtet. Färbung mit Propidiumiodid und FITC-markiertem Annexin V gezeigt, dass die Oberflächenschicht der Sphäroide mindestens der lebensfähigen Zellen bestand damit verbunden mit sehr wenigen toten Zellen (Fig. 1B).
Transgene Expression durch den Magenkarzinomzelllinien
CEA und Tag kann als tumorspezifische Antigene (TSA) oder tumorassoziierte Antigene (TAA) nach der Transplantation der neu etablierten Tumorzelllinien in immunokompetente syngene C57BL /6 und CEA- oder Tag-transgenen Mäusen, die jeweils dienen. Obwohl instrumental bei der Tumorbildung wird Tag Transgen-Expression nicht immer in Tumorzelllinien, abgeleitet von Tag-transgenen Mäusen, wie in Tumorzelllinien TRAMP [25]. Dies veranlasste uns, die Expression und MHC-Klasse-I-restringierten Präsentation des Tag-Transgen sowie die Expression von CEA in den etablierten Magenkarzinom-Zelllinien zu analysieren. CEA Zelloberflächenexpression wurde in Zelllinien aus Tumoren des Magens von doppelt transgenen Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Western-Blot-Analyse analysiert. Während die Expression des Transgen CEA wird durch die vollständige Promotorregion des humanen CEA-Gens die Expression des Tag geregelt durch einen minimal -424 /-8 bp CEA Promotor gesteuert wird (Fig. 3A). Alle drei doppelt transgenen Zelllinien exprimiert CEA auf der Zelloberfläche (Fig. 3B). In der Linie Magenkarzinomzell MGC2 CEA Transgen exprimierten CEA zeigte ein Molekulargewicht von 180 kDa, ähnlich dem in SV40-transformierten afrikanischen grünen Affen-Nierenzellen stabil mit einem CEA-Expressionsvektor transfiziert und auf CEA gefunden beim Menschen. Wie erwartet, wurde kein CEA in 424GC Zellen nachgewiesen, die aus einer CEA-negativen Tag-transgenen Maus (Fig. 3C) festgestellt wurden. Tag wurde festgestellt, durch Western-Blotting und Immunfluoreszenz-Analyse in allen Zelllinien aus Einzel- und Doppel-transgenen Mäusen (Fig. 3D und Daten nicht gezeigt) abgeleitet ist, ausgedrückt werden. Dieser Befund unterstützt auch den Ursprung der Zellinien, die von den Magenkarzinomen. Weiterhin ist die 424GC Zellinie endogen effizient verarbeitet Tag-abgeleitete Peptide präsentiert, vor allem die T1-Epitop in einem MHC-I Weise beschränkt, wie durch die Induktion der Sekretion IFNy bestimmt byTag-spezifischen CTL (Fig. 4A). Des Weiteren wurden die Zelllinien effizient von Tag-spezifischen CTL in zytotoxischen Assays (Abb. 4B) getötet. Abbildung 3: Expression von CEA und Tag durch Magenkarzinomzelllinien, abgeleitet von CEA424 /Tag- oder CEA424 /Tag × CEA-transgenen Mäusen. (A) Struktur des CEA und CEA424 /Tag Transgene. Die Exons 1-10 des humanen CEA-Gen innerhalb des Einsatzes von Cosmidklon cosCEA1 enthalten [14] als farbkodierte Boxen gezeigt (hellblau, der Führer, rot, IgV-ähnliche Domäne, blauer IGC-ähnliche Domäne, grau, Transmembran-Domäne;.. weiß, 5 'und 3'-untranslatierte Region Exons Vektorsequenzen Flankierende als schwarze Kästchen angezeigt werden, um die Position des CEA-Minimalpromotor in dem SV40-Tag-Gen Transgen durch gestrichelte Linien angedeutet ist, werden die Namen der transgenen Linien gezeigt am linken Rand. (B) die Durchflusszytometrie durch Markierung der genannten Zellen durchgeführt wurde, entweder mit der CEA-spezifischen mAb 26/3/13 (gefüllte Kurven) oder einer Isotyp-Antikörper (offene Kurven), gefolgt von PE-markiertem Ziege anti-Maus-IgG-Antikörper. (C, D) für die Western-Analyse wurden 10 ug Gesamtprotein aus Extrakten von 424GC oder mGC8 von CEA424 /Tag-transgenen Mäusen etablierten Zellen und mGC2CEA und mGC4CEA Zellen aus CEA424 /Tag × CEA-transgene Mäuse waren Größe durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Membran übertragen und reagierte mit dem CEA-spezifischen mAb 26/3/13 (C) oder Hamster-polyklonalen Anti-Tag-Antikörper (D). Auszüge aus Cos7L-CEA und Meth-A-Zellen stabil mit Expressionsvektoren, die CEA oder ein Tag einen Bereich mit dem Kernlokalisationssignal (CTAG) diente als positive Kontrolle fehlt. Die Grßen der Proteinmarker sind in den linken Rand angegeben.
Magenkarzinom Zelllinien durch murine 4 MHC-Klasse-I-restringierten Präsentation von Epitopen Tag Figur. (A) epitopspezifischen CTL generiert in C57BL /6-Mäuse durch DNA-Immunisierung mit einem Tag-Expressionsvektor und nachfolgende Expansion durch in vitro Stimulation mit Tag peptidbeladenen RBL5 Zellen wurden mit bestrahlten 424GC inkubiert, 424 Fibroblasten, RBL5 und Tag T1, T2 /3 oder T4 Peptid-gepulste RBL5 Zellen für 24 h und ihre IFNy-Sekretion in das Kulturmedium wurde durch ELISA bestimmt. Die Sekretion von IFNy durch CTL mit 424GC Zellen stimuliert zeigt an, dass diese Zellen vorhanden SV40Tag-spezifische Peptide in einer MHCI-beschränkten Weise. (B) Cokultur von 424GC und 424 Fibroblasten wurden für 48 h mit 107 Tag-spezifischen CTL in einer Petrischale behandelt. Danach nicht adhärenten (tote) Zellen wurden entfernt. Links, Co-Kultur vor CTL-Behandlung; Recht, Co-Kultur nach der Behandlung. Die Pfeile zeigen die Position der Tumorzellen vor der Zugabe von CTL
Tumorigenität der Magenkarzinomzelllinien
die Tumorigenität der Zelllinien, verschiedene Zahlen (1 x 10 5 zu bestimmen;. 3 x 10 5; 1 × 10 6) von Zellen wurden subkutan in C57BL /6-Mäuse injiziert. Alle Zelllinien konnten Tumoren in 100% der Tiere zu bilden, wenn mindestens 3 x 10 5 Tumorzellen injiziert wurden (Fig. 5A). Die Tumoren wuchsen fast exponentiell ohne Verzögerung, bis sie mit einem Volumen von 300 mm erreicht 3. konnte keine Fernmetastasen während der Beobachtungszeit ermittelt werden. Western-Blot-Analyse auf transplantierten Tumoren durchgeführt, zeigte, dass beide Transgene von den Zellinien exprimiert wurden in vivo
(Daten nicht gezeigt). Die Verdopplungszeiten der Tumorzellen in vivo
bei einer Starttumorlast von 10 6 Zellen variierte zwischen 7,2 (mGC8) und 13,8 Tage (mGC3) (Fig. 5A). In-vitro-
zeigten alle Zelllinien ähnlich Verdopplungszeiten von etwa 3 Tage (Fig. 5B). Wir weiteren subkutanen Tumorbildung der Zelllinien im Vergleich zu Wildtyp (C57BL /6) und transgenen Mäusen. Wurden keine signifikanten Unterschiede in der Tumor nehmen und das Tumorwachstum für die Zelllinie 424GC beobachtet, wenn subkutan in Wildtyp oder CEA424 /Tag-transgenen Mäusen (Abb. 6A) und für mGC11 CEA-Zellen nach der Injektion in Wildtyp injiziert und CEA424 /Tag-CEA-transgenen Mäusen (Abb. 6B). Figur 5 In vivo (A) und in vitro Wachstumseigenschaften (B) von murinen Magenkarzinom-Zelllinien. Drei Mäuse wurden jeweils mit den angegebenen Dosen von Tumorzellen injiziert. Das Tumorwachstum wurde durch zwei senkrechte Messungen der Tumordurchmesser und Berechnung des Volumens quantifiziert, wie in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Zur in vitro Wachstumseigenschaften zu bestimmen, wurden Zellen in 24-Well-Platten gezüchtet mit den angegebenen Zellzahlen beginnen. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten Zellen von jeweils drei Wells wurden geerntet und gezählt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) angegeben. Beste Passform Kurven sowie Verdopplungszeiten in Tagen (in Klammern) wurden berechnet, um die GraphPad Software.
6 Wachstum von Magenkarzinomzelllinien Abbildung in Wildtyp und transgenen Mäusen. 3 × 105 424GC Zellen wurden subkutan in C57BL /6 und CEA424 /Tag-transgenen Mäusen (A) oder 3 × 105 mGC11CEA Zellen wurden in C57BL /6 und CEA424 /Tag × CEA-doppelt transgenen Mäusen (B) eingespritzt. Das Tumorwachstum wurde durch zwei senkrechte Messungen der Tumordurchmesser und Berechnung des Volumens quantifiziert, wie in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Die Ergebnisse sind als Mittelwert +/- SD (n = 3).
Immunogenität des Magenkarzinomzelllinien die ein ähnliches Wachstum der Tumorzelllinien
in Wildtyp und transgenen Mäusen zeigt an, dass keine signifikante Immunantwort entweder Tumorantigen (Tag, CEA) trat bei tumortragenden Mäusen. In der Tat, keine Tag-spezifischen CTL in der Milz von Tumor-Wildtyp-Mäusen auf subkutanem progressive Wachstum von Tag-exprimierenden Magenkarzinomzellen tragenden identifiziert werden konnten (Daten nicht gezeigt). Wenn jedoch doppelt transgenen Zelllinien in Mäusen wuchsen, CEA-spezifische Antikörper könnten in Wildtyp-C57BL /6-Mäusen identifiziert werden, aber nicht in CEA-transgenen Mäusen (Fig. 7A). Weiterhin drei Immunisierungen von C57BL /6-Mäuse mit 106 gefrieraufgetaut mGC8 Tumorzellen in wöchentlichen Abständen entweder verhindert das Wachstum von subkutan injizierten lebenden mGC8 Zellen vollständig oder Tumor-Auswuchs wurde fast drei Wochen, je nach der injizierten Tumorzelldosis (Fig verzögert. 7B , C). Diese Experimente zeigen, dass die Tumorzelllinien sind immunogene unter bestimmten Bedingungen. Jedoch C57BL /6-Mäuse nicht spontan eine effiziente Tumorprogressions beschränkende Immunantwort auf Tumorantigen entweder während subkutane Tumorwachstum montieren. Abbildung 7 Immunogenität von mGC Zellen. (A) Anti-CEA-Antikörper wurden im Serum von C57BL /6 und CEA-transgenen Mäusen bestimmt mittels Durchflusszytometrie. Alle Mäuse waren progressiv wachsende Tumoren ohne offenkundige Nekrose nach Transplantation und das Wachstum der angegebenen Zellinien für 35-40 Tage. mGC4CEA Zellen wurden mit dem Serum der Mäuse angegeben bei verschiedenen Verdünnungen und gebundenen primären Antikörper inkubiert wurden mit einem PE-konjugierten Anti-Maus-Antikörpers nachgewiesen. (B, C) Drei C57BL /6-Mäuse wurden jeweils mit 1 × 106 mGC8 Zellen durch zwei Gefrier-Auftau-Zyklen getötet subkutan dreimal in wöchentlichen Abständen injiziert. Zwei Wochen nach der letzten Impfung wurden die Mäuse durch Injektion herausgefordert mit 1 x 106 (B) und 3 × 106 (C) leben mGC8 Zellen, bzw. (gefüllte Kreise). Als Kontrolle wurden Tumorzellen in nicht-immunisierten Mäusen (offene Kreise) injiziert. Tumorvolumina wurde wie in Material und Methoden beschrieben berechnet. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte dargestellt +/- SD.
Diskussion
Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, ein therapeutisches Modell von Magenkrebs bei immunkompetenten Mäusen zu etablieren, die ein Tiermodell zur Verfügung stellen würde, Antitumor-Immunität zu bewerten und immunotherapeutic Strategien.

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