Karakterizacija želodčnih celičnih linij adenokarcinom sedežem od CEA424 /SV40 T antigen Transgenska miši z ali brez človeškega CEAtransgene

Karakterizacija želodčnih celičnih linij adenokarcinom sedežem od CEA424 /SV40 antigena T
-transgenic miši z ali brez človeškega CEA
transgena
Abstract
Ozadje
želodca raka je ena izmed najpogostejših rakov po svetu . Bolniki z rakom želodca na odru napredno bolezni imajo slabo prognozo, zaradi omejene učinkovitosti razpoložljivih terapij. Zato je razvoj novih terapij, kot imunoterapiji za zdravljenje raka želodca je izrednega pomena. Ker je uporabnost obstoječih predkliničnih modelih za vrednotenje imunoterapije za zdravljenje želodčnih adenokarcinome omejen, je bil cilj te študije za vzpostavitev mišje vivo
modele, ki omogočajo postopno izboljšanje imunoterapije za raka želodca.
Metode
Ker so na voljo smo ustanovili štiri celičnih linij (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) iz spontano razvoju tumorjev antigena CEA424 /SV40 T (CEA424 /Tag), miših in treh celičnih linij, pridobljenih iz double-transgene ni glodavcev želodčni adenokarcinom celične linije potomci iz CEA424 /Tag miših parili s človeško karcinoembrionski antigen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) miši (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag je transgena C57BL /6 miško sev zatočišča Tag pod nadzorom -424 /-8 bp CEA promotor gena, ki vodi k razvoju invazivne adenokarcinoma v žleznega želodca. Tumor celične linije, določene z CEA424 /Tag-CEA miši izražajo dobro opredeljeno CEA tumor antigen pod nadzorom svojih naravnih regulatornih elementov.
Rezultati
epitelnega izvora tumorskih celic je bilo dokazano z morfološko meril, vključno s prisotnostjo mucin v celicah in ekspresijo adhezije celic molekule EpCAM in CEACAM1. Vse celične linije dosledno izražajo transgeni CEA in /ali oznake in MHC razreda I molekule, ki bo omogočil njihovo občutljivost za razpad jih Tag specifične CTL in vitro
. Kljub predstavitev CTL-epitopov, ki izhajajo iz transgena izdelkov so celične linije Tumorske tumorogen če so cepljeni v C57BL /6, CEA424 /Tag ali CEA424 /Tag-CEA-transgene gostitelji in ni bistvenih razlik v tumor sprejeti in rast tumorja so v opazili različni gostitelji. Čeprav niso opazili spontano zavrnitev tumorja, cepljenje C57BL /6 miših z lizatov iz želodca karcinom celičnih linijah zaščitenih C57BL /6 miši iz izzivu tumorja, ki dokazujejo tumorogenosti vrstic na tumorskih celic v netransgenih miših v H-2 b haplotip.
Zaključek
Te tumorske celične linije cepljene na različnih singenskih gostiteljev morala izkaže za zelo koristno za optimizacijo imunoterapijo režime, ki se končno testirali v transgenih živali razvoju primarne želodčne karcinomov.
Ozadje
rak želodca je drugi najpogostejši rak v svetu [1]. To se pogosto ne zazna, dokler zaključni fazi; posledično stopnja preživetja v 5-letne so nizka (10-20%). Zaradi lokalne invazije in metastaz, obsevanjem ali kemoterapijo bistveno ne poveča dolžine in kakovosti življenja bolnikov z napredovalim rakom želodca. Zato so potrebni za razvoj novih neoadjuvantni in adjuvansa načinih zdravljenja. Imunoterapija lahko obetavna druga možnost. Številni imunoterapije pristopov kot posvojitelj prenos celic T tumorskih specifične, in cepljenje z uporabo bodisi nedefinirane antigene tumorja, ki izhajajo iz tumorskih lizatov in tumorskih celic ali opredeljenih tumorske antigene, ki jih dendritične celice običajno predstavljene se ovrednoten za različnimi vrstami raka [2, 3] . Pri želodčnih raka, imunoterapija niso jemali resno upoštevati zaradi koncepta, da je rak želodca slabo imunogena. Zato so poročali le majhno število kliničnih imunoterapije poskusov [4-7]. Poleg tega so bile ugotovljene le omejeno število antigenov tumor, povezanih z morebitno uporabo za imunoterapijo [8-11]. Zato je sposobnost imunskega sistema za prepoznavanje in izkoreninjenje želodčni rak, je v veliki meri neznan. Da bi dobili vpogled v učinkovitost različnih imunoterapije za zdravljenje raka želodca in za pojasnitev mehanizma, induciranih imunskih odzivov živalski modeli adenokarcinomom želodca so nujno potrebni.
V ta namen so več skupin, vključno z našim kratkim ustanovljena transgenih ali knock -out sevi miške, ki razvijajo želodčne adenome ali adenokarcinomov v različnih delih želodcu po različnih latence [12]. Razvili smo transgenske karcinom želodca C57BL /6 miši modela temelji na SV40 veliki antigena T (SV40 Tag) transgena s človeško karcinoembrionski antigena (CEA) promotor gena pod nadzorom (od -424 do -8 od translacijskega začetnega kraju samem) [13 ]. V 100% živali, se displastičnega kripta formacija v želodčne sluznice opazili v pilorično regiji že 30 dni stara CEA424 /SV40 Tag-transgene miši. Displazija napreduje invazivnih karcinomov in do 50. dne celotna piloricne želodčne sluznice je nadomestil celic karcinoma. V starosti od 90 do 110 dni na transgenih miših postanejo umirale in umre verjetno podhranjenosti zaradi blokade na pilorus [13]. Nadzor Tag izražanja, ki ga minimalno CEA promotor gena omogoča tumorjem usmerjeno izražanje CEA s prečkanjem CEA424 /SV40 Tag-transgene miši s človeško CEA
-transgenic C57BL /6 miši, ki izražajo CEA transgena v podobno prostorsko in časovno izraz vzorec, kot je ugotovljeno pri ljudeh [13, 14]. Tumorski markerski CEA človeka je izražena v številnih človeških adenokarcinomov, vključno z več kot 50% želodčnega karcinoma [15, 16]. CEA je bolj uporablja kot ciljni antigen za različne antibody- in celicami posredovanega pristopov tumor imunoterapijo [17-19]. CEA in Tag so primerne ciljne imunoterapija antigeni, ker so bile ugotovljene številne T epitopov celičnih antigenov v C57BL /6 miših [20-22]. Čeprav te transgene sevi miške zrcali razvoj tesno adenokarcinomom želodca pri ljudeh, eksperimentiranje s temi miših je dokaj zamudno in drago zaradi težav ugotoviti rast tumorjev in zahtevo za vzrejo transgenih miši. Zato je zaželeno, da imajo singensko transplantacijske sistem tumorja želodčnih adenokarcinomov pri imunsko miših za optimizacijo danega imunoterapije protokola, preden se ovrednoti v transgenih miših. Tukaj bomo opisali mišje celičnih linij adenokarcinomom želodca, določene s spontano razvoju tumorjev SV40 Tag-transgene miši, ki so tumorogen tako singenskih divjega tipa in transgenih miših.
Metode
sevi miška in celičnih linij Poslovni
CEA424 /Tag- transgenih miših (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgenih miših (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) in F1 miši iz križanja CEA424 /Tag-transgene in CEA-transgenih miših so bile predhodno opisane [13, 14]. Medtem so bili transgene linije backcrossed da C57BL /6 miši (H-2 b) za več kot 15 generacij. V transgene linije ter C57BL /6 miši (Charles River, Sulzfeld, Nemčija) smo redijo pri standardnih pogojih brez patogenov v objektu živali Inštituta za kirurške raziskave, Ludwig-Maximilian-univerzi v Münchnu. Poskusi na živalih so bili izvedeni po potrditvi lokalnih odborov za dobro počutje živali. Za tumorogenosti in imunogenosti teste smo uporabili miši na 8-12 tednov. Afriške zelene opice ledvic Cos7L celično linijo smo dobili od ameriške tkivne kulture Collection (ATCC, Rockville, MD). BALB /-c izhaja fibrosarkoma Meth-A so sami pripravili W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Met-A-CEA celice so bili pridobljeni z transfekciji celic met-A z izrazom plazmidov PRC /CMV-CEA uporabo FuGENE ™ 6 transfekcijske reagenta (Roche Molecular Biochemicals, Švica) v skladu z navodili proizvajalca. Met-A-cTag in RBL5 /T transfektanti bilo prej opisano [23].
Vzpostavitev želodca karcinom celičnih linij
želodčni rak, ki se uporabljajo za določitev celičnih linij tumorja so bili pridobljeni iz 8 različnih, 13 tednov starih miših. Štiri izhaja iz CEA424 /Tag-transgene miši in 4 iz CEA424 /Tag-CEA-dvojno transgenih miših. Imena celičnih linij, ki izhajajo iz slednje miši so označeni z eksponenta "CEA". Vse kulture smo izvedli v RPMI1640 dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviranega seruma zarodka teleta (FCS "Gold"; PAA Laboratories, Coelbe, Nemčija), 2 mM L-glutamina, 100 E /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina, nebistveno aminokisline in 1 mM natrijev piruvat (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Nemčija), nadalje imenovan tumorja medij (TM). Tumor tkiva so bili v veliki meri sprali in-fosfatnim pufrom (PBS), dopolnjen z 200 g /ml gentamicin in 2,5 mg /ml amfotericin B (GIBCO /Invitrogen), narežemo na 1 mm 3 kosi s skalpelom in prevlečeni v tkivni kulturi bučke, ki vsebujejo TM. Medij kulture smo spremenili vsakih 3-4 dni. Epitelne celice in fibroblaste rastejo iz drobcev tkiva ločimo s celično strganjem selektivno trypsinization in selektivni pasažo s 1000 U /ml kolagenaze in 500 U /ml hialuronidaza (Biochrom, Berlin, Nemčija). Med disociacije, so bučke spremljati po obrnjenem mikroskopom in prebava se je ustavil, ko fibroblastov, vendar ni bila samostojna epitelnih celic (tripsin) ali obratno (kolagenaze /hialuronidazo). Ta postopek smo ponavljali enkrat tedensko, dokler se vse fibroblasti so bili izločeni iz tumorskih celic kulture. Med tvorbo celične linije 424GC je bila fibroblastov kultura določena z kvarnim fibroblastov (424 fibroblasti). Sferoidi oblikovana v 5-7 dneh po tem, ko sejanje 0,5 × 10 3 mGC8 celice v Noble agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Nemčija), obložena s 96 vdolbinami (TE-BIOCHROM, Berlin, Nemčija) v 200 ul TM, ki je bil nadomeščen s svežim medijem vsake dva dni. Oceniti sposobnost preživetja celic na površini sferoidov so sferoidi inkubirali s FITC označenega aneksina V (aneksin V. FITC apoptoza Detection Kit, Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Nemčija) za odkrivanje apoptotskih celic ali propidijevim jodidom za identifikacijo nekrotično celice po priporočilih proizvajalca.
Pretočna citometrija analize
za barvanje celic površinskih tripsiniziramo, sprali s PBS in suspendirali v PBS /0,5% m /v goveji serumski albumin (BSA), dopolnjenem z 0,02% m /v natrijevega azid. Za indukcijo MHC molekule, smo celice inkubirali z 20 ng /ml interferona-y (IFNy; Peprotec, London, Velika Britanija) za 24 ur pred žetvijo. Nespecifično vezavo protiteles na Fc receptorje bil blokiran predinkubacija celic z 1 mg /10 6 celic anti-CD16 /CD32 monoklonsko protitelo (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Nemčija) za 15 min . Nato so bile celice inkubiramo z 0,5 mg /10 6 celice mAb interesa za 30 minut pri 4 ° C, speremo dvakrat, in kjer je primerno, nato reagiramo z drugega koraka protitelesa za 15 minut pri 4 ° C . Celice smo dvakrat sprali in analizirali z FACSCAN (BD, Mountain View, CA). Mrtve celice so izključeni s propidijevim jodidom barvanjem. so bili uporabljeni naslednji reagenti in mAb proti mišje antigenov iz BD Pharmingen: fikoeritrin (PE), označenih s miške IgG 2a anti-IA b, biotiniliranega mouse IgG 2a anti-H-2D b PE-konjugiran mišji IgG 2aanti H-2K b PE-konjugiranim anti-miš CD80 /B7-1, PE-konjugiran podgana IgG 2a anti-miš CD40, PE-konjugiranim podgana IgG 2a anti-mouse CD86 /B7-2, fluorescein izotiocianat (FITC) označenih s, Armenian hrček IgG 2 anti-mouse CD80 /B7-1. FITC konjugiranih rat IgG 1 mAb R3-34, PE konjugiranih rat IgG 1 mAb R3-34, PE konjugiranih mouse IgG 2a anti-podgana SIRP, FITC konjugiranih Armenian hrčka IgG 2anti-KLH in PE konjugiranih rat IgG 2amAb služil kot kontrola testu. Mouse anti-mouse CEACAM1 mAb CC1, rat anti-mouse CEACAM1 AgB10 [24] in rat anti-mouse E-kadherina in anti-mouse EpCAM mAbs so neke vrste darilo K. Holmes, Univerza v Koloradu, BB Singer, Charité Berlin, in P. Ruf, Trion raziskave, München, oz. Navzkrižno reaktivno miško anti-človeški CEACAM mAb 4/3/17 (specifična za prehrano CEA /CEACAM5 pri miših) so bile kupljene od GENOVAC (Freiburg, Nemčija). Murine protitelesa so bila opažena s PE konjugirano kozje anti-miške IgG, podgan protiteles z FITC-konjugirana osel anti-rat-IgG (Dako).
Odkrivanje CEA in SV40 Tag ga metodo Western blot
eksponentno narašča želodčnih celic karcinoma so Cos7L celice, Cos7L-CEA transfektanti, celice Meth-a in Meth-a-cTag transfektanti ki izražajo skrajšani citoplazmično nahaja SV40 oznako obrani trypsinization. Celice smo sprali trikrat v PBS in lizirali z gostoto 10 6 celic /ml v liznega pufra. koncentracija proteinov je bila določena z BCA protein analiznega kompleta (Pierce, Rockford, Illinois, ZDA). Celične ekstrakte, ki ustrezajo 10 ig proteina ločimo z elektroforezo skozi 10% SDS poliakrilamidnih gelih (Invitrogen, Karlsruhe, Nemčija), prenesenih polyvinyliden fluoridnih membrane in inkubiramo pri 10 ug /ml anti-humanega CEACAM mAb 4/3/17 ali njene 1: 100 razredčena hrčka anti-SV40 Tag antiserum (neke vrste darilo, ki ga K.-H. Scheidtmann Univerze v Bonnu). Vezane protitelesa so se odzvali s hrenom peroksidazo označena sekundarnih protiteles in vizualizirali s pomočjo, ki temelji kemiluminescenco sistem detekcije. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Nemčija)
Cell določitev podvojitev časa
vitro
podvojitev časi celičnih linij smo določili z nasaditvijo želodčni karcinomske celice v 24-vdolbinami v TM na navedenih začetnih celic številke in štetje vzorcev celic iz trojnih vodnjakov po rahlem trypsinization vsakih 3 dni za 21 dni. In vivo
podvojitev časi so bili izračunani iz meritev volumna tumorja (glej spodaj) po okužbi s tremi različnimi številkami izhodiščna celic (tri miši na skupino). Podvojitev časi so bili izračunani iz faze log rastnih krivulj.
Tumorogenosti in imunogenost celice linije
Za ugotavljanje tumorogenosti tumorskih celic speremo trikrat v PBS in 50 xl suspenzije celic z navedenimi številkami celic smo injicirali subkutano v obrit desnega boka miši. Določiti imunogenost, 10 7 tumorskih celic /ml smo lizirali z dvema zaporednima zamrzovanja in odtaljevanja ciklih. Miši so bili cepljeni štirikrat tedensko z 10 6 liziranih tumorskih celic v desni bok. Tri tedne kasneje so bile miši izpodbijala subkutani injekciji 3 x 10 6 sposobnih tumorskih celic v levi bok. Poskusne skupine sestavljalo 4-6 miši. Razvoj tumorja je sledilo serijskih merjenjem velikosti tumorjev in količino tumorjev smo izračunali po enačbi: Volumen tumorja (mm 3) = d 2 x D /2, kjer R in R sta najkrajši in najdaljši premer tumorja oz. Živali smo evtanazirali ko so tumorji dosegli prostornino 300 mm 3.
Generiranje limfocitov Tag specifične citotoksične T (CTL) in stimulacijo z želodčno karcinom progah
CTL so bili pridobljeni kot je opisano predhodno [23] . Na kratko, so miši intradermalno inokulirali z 1 um zlata, prevlečene s Tag izražanja plazmida (BMG /CT-Ag.1 [23]) v na obrito kožo trebuha uporabo helija tlak (200 psi) poganja biolistična naprava (Helios gen pištolo; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Nemčija). Vranične celice, pridobljene 14 dni po cepljenju so bile ponovno stimulirali v tedenskih intervalih z obsevanega RBL5 /T transfektanti v RPMI-1640/10% FCS dopolnjen z 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T Rauscher virusom transformirana T limfoma celična linija izvedena iz C57BL6 (H-2b) miši transfektirana z SV40 oznak ekspresijskim plazmidom. Ustvariti epitop specifične CTL, vranica celice sprejela 10 dni po cepljenju so bile ponovno stimulirali in vitro z obsevano, Tag RBL5 celic peptidom impulzni. T1, T2 /3 in T4 epitop specifičnost CTL je bil pod nadzorom določanje vsebnosti IFNy medijev ob stimulaciji s peptidom impulzni tarčne celice z uporabo ELISA.
Odkrivanje citokinov z ELISA
Za zajemanje in odkrivanje IFNy v supernatantih po konvencionalni sendvič ELISA, smo uporabili mAb R4-6A2 in biotinilirano mAb XMG1.2, oziroma (BD Pharmingen). Izumrtje je bil analiziran na 405/490 nm na TECAN mikroplošče ELISA bralcu (TECAN CRAILSHEIM, Nemčija) s programsko opremo EasyWin (TECAN). Meja odkrivanja ELISA za IFNy je 20 pg /ml.
Rezultati
Vzpostavitev in fenotip želodčne karcinoma celične linije
Iz vzorcev 8 želodčnega karcinoma lahko prišlo do oblikovanja 7 celične linije. Štiri celične linije so bile pridobljene od CEA424 /Tag-transgene miši (424GC, moškega miško, mGC3, ženski; mGC5, moški in mGC8, ženski) in tri vrstice iz CEA424 /Tag-CEA-transgenih miših (mGC2 CEA, moški; mGC4 CEA, moški; mGC11 CEA, ženske). Čas, potreben za pridobitev čistih epitelijskih celičnih kultur močno razlikovali (povprečno 6 mesecev, razpon 3-16 mesecev). Čeprav so tumorske celice rastejo kot prilepljenih celic v kulturi, se nagibajo k tvori agregate, namesto širi preko kulture substrata (sl. 1A). Na epitelijsko izvor tumorskih celic je bila dokazana s morfoloških merilih vključno s prisotnostjo mucin znotraj celic (sl. 1A) in analizo ekspresije proteina običajno izražena v epitelijskih celic (EpCAM, E-kadherina, CEACAM1) (sl. 2A) . Znižano vsebnost mucin bilo ugotovljeno v vseh celičnih linijah v primerjavi z vsebnostjo v normalnih želodčnih epitelnih celic pa podobno najdemo v tumorskih celicah v želodčni karcinom v transgenih miših (sl. 1A in [13]). Vse celične linije prikazane CEACAM1 in EpCAM na svoji površini, razen mGC11 CEA, nobena od njih ni izražen E-kadherina (sl. 2A in podatki niso prikazani). Vse celične linije izražene MHC razred H-2K in in pri mnogo nižjem nivoju, H-2D molekule (sl. 2B). Izražanja obeh proteinov je močno povečala s stimulacijo IFNy. bila odkrita nobena izražanje molekule MHC razreda II (I-Ab) (sl. 2B in podatki niso prikazani). CD54, CD80, CD86 ali CD95 niso bili odkriti nobeni od celične linije (podatki niso prikazani). Slika 1 Morfologija želodca linij karcinomom, ki rastejo kot enoslojne kulture ali tridimenzionalnih zrnc. (A) Celične linije kažejo nekoliko drugačno epitelne morfologijo. Večina celic vseh celičnih linijah vsebujejo značilno znotrajcelično vakuole (puščice), ki verjetno vsebuje mucinozni materiala z metodo PAS obarvana rdeče (zadnja slika desno v spodnjem delu). (B) Zrnce oblikovana z gojenjem mGC8 tumorske celice na mehki agar: levo, fazni kontrast; Dobro, fluorescence obarvanje odmrlih celic s propidijevim jodidom (rdeča) in apoptotskih celic s FITC-oznako annexinV (zelena, označene s simboloma), kot je opisano v "Material in metode". Povečava: palice ustrezajo 10 um. MGC, glodalski karcinom želodca.
Slika 2 Cell površinsko ekspresijo epitelijskih označevalcev (A) in MHC razreda I in molekul II (b). Želodčne celične linije karcinom presnovimo bodisi z PE-označenega (H-zavzemajo največ 2 kb, H-2 dB, I-Ab) ali z neoznačenimi mAbs (CEACAM1, E-kadherina, EpCAM) in nato z inkubacijo z PE-označenimi anti-miš IgG ali FITC označenega anti-podgana IgG in analizira citometrije toka. Histogrami prikaz rezultatov, pridobljenih s protitelesi proti ustreznih antigenov z (odprte siva) ali brez (odprta črna) pred IFNy stimulacija in nepomembne antigene (sivo napolnjene krivulje).
Da bi ugotovili potencial celičnih linij, ki se uporabljajo za ustvarjanje tridimenzionalnih modelov tumorskih smo analizirali tumorskih celic elipsoidne nastajanje in vitro. Kot je prikazano na sl. 1B celične linije tvorjena manjši zmc tumorske celice po 8 dneh kulture, ko so bili 103 celice zasejali v mehke agar obložena 96-vdolbinami. opazili le manjše znotraj eksperimentalni razlike glede velikosti zrnc. Obarvanjem s propidijevim jodidom in FITC označeni aneksina V dokazala, da je vsaj površinski sloj od sferoidov sestavljena iz živih celic z zelo malo mrtvih celic v zvezi z njo (sl. 1B).
Izražanje transgenov jih želodčni karcinom celičnih linij
CEA in Tag lahko služijo kot tumorske antigene specifične (TSA) ali antigene povezane s tumorjem (TAA) po presaditvi novoustanovljenih linij tumorskih celic pri imunokompetentnih singenskih C57BL /6 in CEA- ali Tag-transgene miši, oz. Čeprav instrumental z nastankom tumorjev, Tag izražanje transgenov ni vedno najdemo v celičnih linijah tumorskih izhajajo iz Tag-transgene miši, kot v prosti plovbi tumorskih celic [25]. To nas je spodbudilo, da analizira izraz in MHC razreda-I omejena predstavitev Tag transgena, kot tudi izražanje CEA v trajnih celičnih linij karcinoma želodca. CEA celična površinska ekspresijo smo analizirali v celičnih linijah, pridobljenih iz želodca tumorjev z dvojno transgenih miši s pretočno citometrijo in Western blot analizo. Medtem ko je izraz CEA transgena ureja popolno promotorski regiji človeškega CEA gena izraz Tag ga nadzoruje minimalnim -424 /-8 bp CEA promotorja (sl. 3A). Vsi trije dvojno transgenih celične linije, izraženo CEA na celični površini (sl. 3B). V karcinom celične linije želodca mGC2 CEA transgen-izražena CEA razstavljene molekulsko maso 180 kDa, podoben tistemu, ugotovljene v afriške zelene opice ledvičnih celic SV40 transformirana stabilno transficirane z CEA ekspresijskim vektorjem in CEA ugotovljeno pri ljudeh. Kot je bilo pričakovati, ni bilo CEA odkrita v 424GC celic, ki so bile ustanovljene iz CEA-negativno Tag-transgene miši (sl. 3C). Oznaka je bilo ugotovljeno, da se izrazi z Western blotting-om in analizo z imunofluorescenco v vseh celičnih linij, pridobljenih iz eno- in dvojno transgenih miših (sl. 3D in podatki niso prikazani). Ta ugotovitev podpira tudi izvor celične linije iz želodca karcinomov. Poleg tega 424GC celična linija učinkovito predstavljeni endogeno obdelane peptide-Tag izvira, zlasti T1 epitop v MHC-I omejen način, kot je določeno z indukcijo IFNy izločanja byTag specifične CTL (sl. 4A). Poleg tega so bili celične linije učinkovito ubili oznak specifičnega CTL v citotoksična testih (sl. 4B). Slika 3 Izražanje CEA in Tag jih želodca celičnih linijah karcinoma, ki izhajajo iz CEA424 /Tag- ali CEA424 /Tag × CEA-transgene miši. (A) Struktura CEA in CEA424 /Tag transgenov. V eksonov 1-10 človeške CEA gen, ki jih vsebuje vložek za kozmid klon cosCEA1 [14] so prikazani kot barvnih polj (svetlo modra, vodja; rdeče, IGV podobnih področjih; modro MVK-podobno domeno, siva, transmembranski domen ,.. bela, 5 'in 3' neprevedena regija eksonov spremljajoči vektorske sekvence so označene kot črne skrinjice lokacija CEA minimalno promotor trenutno v SV40 Tag genov transgena je označena s črtkano črto, so imena transgenih linij prikazano v levem robu. (B) Pretočna citometrija smo izvedli z označevanjem navedenih celic bodisi z CEA specifične mAb 26/3/13 (polnjeni krivulje) ali izotipno ustreznimi protitelesa (odprti krivulj), čemur sledi PE-označenimi koze anti-mouse IgG protitelesa. (C, D) za zahodne analize 10 mikrogramov celotnega proteina iz izvlečkov celic 424GC ali mGC8 sedežem iz CEA424 /Tag-transgene miši in mGC2CEA in mGC4CEA celic CEA424 /Tag × CEA-transgene miši so bile velikost ločen s SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo, prenese na membrano in reagira s CEA specifično mAb 26/3/13 (C) ali hrčka poliklonska anti-Tag protitelesa (D). Izvlečki iz Cos7L-CEA in celic Meth-A stabilno transfekciji s izražanje vektorji kodiranje CEA ali Tag manjka regijo z jedrsko lokalizacijo signala (cTag) je služila kot pozitivno kontrolo. Velikosti proteinskih označevalcev so navedene v levem robu.
Slika 4 MHC razreda I-omejeno predstavitev Tag epitopov s mišje želodčnega raka celičnih linijah. (A) epitop specifično CTL ustvarjena v C57BL /6 miši z imunizacijo DNA z oznak za izražanje vektorja in kasnejše širitve, ki ga vitro stimulaciji z Tag RBL5 celic peptidnih naložen inkubiramo z obsevanega 424GC, 424 fibroblastov, RBL5 in oznak T1, T2 /3 ali T4 peptida-impulzni RBL5 celic za 24 h in njihovo izločanje IFNy v mediju kulture smo določili z ELISA. Izločanje IFNy s CTL spodbujena z 424GC celic kaže, da te celice predstavljajo SV40Tag specifične peptidi v MHCI-omejen način kot. (B) Coculture od 424GC in 424 fibroblastov smo obdelali z 107 Tag-specifičnega CTL v petrijevki 48 h. Zatem smo odstranili ne-adherentne (mrtve) celice. Levo, coculture pred zdravljenjem CTL; desno, coculture po zdravljenju. Puščice kažejo položaj tumorskih celic pred dodatkom CTL
tumorjev želodca karcinom celičnih linij PODJETJA
Za določitev tumorogenosti o celičnih linij, različne številke (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 x 10 6) celic smo podkožno injicirali v C57BL /6 miših. Vse celične linije so bile sposobne tvoriti tumorjev pri 100% živali, če vsaj 3 x 10 smo injicirali 5 tumorske celice (sl. 5A). Tumorji povečalo skoraj eksponentno brez odlašanja, dokler ne doseže obseg 300 mm 3. Ni oddaljenih zasevkov bilo mogoče zaznati v času opazovanja. Western blot analizo izvedli na presajenih tumorjev so pokazale, da sta bili obe transgeni izrazili celičnih linij vivo
(podatki niso prikazani). Za podvojitev časi tumorskih celic in vivo
na začetni tumorsko obremenitvijo 10 6 celic gibalo med 7,2 (mGC8) in 13,8 dni (mGC3) (sl. 5A). In vitro
, vse celične linije razstavljal podobne podvojitev čase približno 3 dni (sl. 5b). Dodatno smo v primerjavi podkožno nastanek tumorskih celičnih linij v divjem tipu (C57BL /6) in transgenih miših. tumorja prevzemu in rasti tumorja za 424GC celične linije niso opazili bistvenih razlik pri injiciramo subkutano v divjem tipu ali CEA424 /Tag-transgene miši (sl. 6a) in mGC11 CEA celice po injiciranju v divjem tipu in CEA424 /Tag-CEA-transgenih miših (sl. 6B). Slika 5 vivo (A) in vitro značilnosti rasti (b) mišje želodčnega karcinoma celičnih linij. vsake tri miši smo injicirali z označenimi odmerkih tumorskih celic. Rast tumorja je količinsko dveh pravokotnih meritev premera tumorja in izračun količine, kot je opisano v poglavju Materiali in metode. Določiti in vitro lastnosti rasti smo celice gojili v 24-vdolbinami začenši z označenimi številkami celic. V različnih časovnih točkah so bile pridelane in prešteti celice iz trojnih vodnjakov. Rezultati so podani kot povprečje +/- standardna deviacija (SD). Best fit krivulje, kot tudi podvojitev krat dni (prikazane v oklepajih) so bile izračunane z uporabo programske opreme GraphPad.
Slika 6 Rast želodčnih linij karcinom celic v divjem tipu in transgenih miših. 3 x 105 424GC Celice smo podkožno injicirali v C57BL /6 in CEA424 /Tag-transgenih miših (A) ali 3 x 105 mGC11CEA celic smo injicirali v C57BL /6 in CEA424 /Tag x transgenih miših CEA-dvojna (B). Rast tumorja je količinsko dveh pravokotnih meritev premera tumorja in izračun količine, kot je opisano v poglavju Materiali in metode. Rezultati so podani kot povprečne +/- SD (n = 3).
Imunogenost želodčne karcinoma celične linije
podobno rast linij tumorskih celic iz divjega tipa in transgenske miši kaže, da ni pomembno imunski odziv bodisi tumor antigen (Tag, CEA) se je pojavila pri miših tumorskih smer. Dejansko ni bilo Tag-specifičnih CTL treba identificirati v vranici tumorja nosi divjega tipa miši na postopne subkutani rast-Tag izražanje želodčnih celic karcinoma (podatki niso prikazani). Vendar, kadar dvojna transgene celične linije povečal pri miših, CEA-specifična protitelesa mogoče identificirati v divjega tipa C57BL /6 miših, vendar ne CEA-transgenih miših (sl. 7A). Poleg tega so tri cepljenja iz C57BL /6 miši z 106 zmrzovanju odmrznjeni mGC8 tumorskih celic v tedenskih razmikih ali prepreči rast subkutano injiciramo v živo mGC8 celice v celoti ali tumor izrastek je bila odložena za skoraj tri tedne, odvisno od odmerka vbrizga tumorskih celic (sl. 7B , C). Ti poskusi kažejo, da so tumorske celične linije Imunogenski pod določenimi pogoji. Vendar C57BL /6 miši ne spontano gori učinkovito tumor-napredovanja omejuje imunski odziv na obeh antigen tumorski med podkožnega rasti tumorja. Slika 7 imunogenost MGC celic. (A) Anti-CEA protitelesa smo določili v serumu C57BL /6 in CEA-transgenih miših, ki uporabljajo pretočna citometrija. Vse miši se je postopoma rastoče tumorje brez očitnega nekroze po presaditvi in ​​rast navedenih celičnih linij za 35-40 dni. mGC4CEA celice inkubiramo z serumu navedenih miši pri različnih razredčitev in vezanih primarnih protiteles je bilo odkritih s protitelesom PE konjugiranih anti-mouse. (B, C) Tri C57BL /6 miši vsaka smo injicirali subkutano trikrat tedensko z 1 x 106 celicami mGC8 z dvema zmrzovanja-odtaljevanja ciklih pobitih. Dva tedna po zadnjem cepljenju so bile miši izpodbijala injekcijo z 1 x 106 (B) in 3 x 106 (C) žive mGC8 celice, oziroma (polnjeni, v krogih). Kot kontrolo smo tumorske celice vbrizgali pri nekadilcih imuniziran miši (prazni krogi). obseg tumorja smo izračunali kot je opisano v poglavju Material in metode. Rezultati so podani kot povprečne vrednosti +/- SD.
Razprava
Glavni cilj te raziskave je bil ugotoviti terapevtski model raka želodca pri imunokompetentnih miših, ki bi zagotovila živalskega modela za ocenjevanje protitumorsko imunost imunoterapevtski strategije.

• Primarna želodca ne-Hodgkinov limfom pri kitajskih bolnikih: klinične značilnosti in prognostičnega factors
• GASTRICHIP: D2 resekcijo in hipertermični intraperitonealno kemoterapijo v lokalno napredovalega raka želodca: randomizirana in multicentrična faze III study