Karakterisering van maag vastgesteld van CEA424 /SV40 T antigen transgene muizen met of zonder menselijke CEAtransgene adenocarcinoom cellijnen

Karakterisering van de maag vastgesteld op basis van CEA424 /SV40 T-antigeen adenocarcinoom cellijnen
-transgenic muizen met of zonder humaan CEA
transgene
Abstracte achtergrond
Maagcarcinoom is één van de meest voorkomende vormen van kanker wereldwijd . Patiënten met maagkanker in een vergevorderd stadium van de ziekte hebben een slechte prognose, vanwege de beperkte werkzaamheid van beschikbare therapieën. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapieën, zoals immunotherapie voor de behandeling van maagkanker is van het grootste belang. Aangezien de bruikbaarheid van bestaande preklinische modellen voor de evaluatie van immuuntherapie voor gastrische adenocarcinomen beperkt, was het doel van de onderhavige studie muizen in vivo
voorbeelden worden stapsgewijze verbetering van immuuntherapie voor maagkanker, kan worden gecontroleerd.
Methods
Omdat er geen muizen adenocarcinoom cellijnen zijn we opgericht vier cellijnen (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) vanaf spontaan ontwikkelen van tumoren van CEA424 /SV40 T-antigeen (CEA424 /Tag) muizen en drie cellijnen afgeleid van dubbel-transgene nakomelingen van CEA424 /Tag muizen gepaard met menselijke carcino-antigeen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) muizen (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /TAG een transgeen C57BL /6 muis stam die het label onder de controle van een -424 /-8 bp CEA genpromotor die leidt tot de ontwikkeling van invasieve adenocarcinoom in de glandulaire maag. vastgesteld van CEA424 /Tag-CEA muizen tumorcellijnen drukken de goed gedefinieerde tumor-antigeen CEA onder controle van zijn natuurlijke regulerende elementen.
Resultaten
De epitheliale oorsprong van de tumorcellen bewees morfologische criteria waaronder de aanwezigheid van mucine in de cellen en de expressie van celadhesiemoleculen EpCAM en CEACAM1. Alle cellijnen consistent expressie transgenen CEA en /of label en MHC klasse I moleculen die tot hun gevoeligheid voor lyse door Tag-specifieke CTL in vitro
. Ondanks de presentatie van CTL-epitopen afgeleid van de transgene producten de tumorcellijnen waren tumorigene toen geënt C57BL /6, CEA424 /dag of CEA424 /Tag-CEA-transgene gastheren en geen significante verschillen in tumor nemen en tumorgroei waargenomen in de verschillende hosts. Hoewel er geen spontane tumor afstoting werd waargenomen, vaccinatie van C57BL /6 muizen met lysaten van maagcarcinoom cellijnen beschermd C57BL /6 muizen uit tumoruitdaging, waaruit de tumorigeniteit van de tumorcellijnen in niet-transgene muizen van het H-2 b haplotype.
Conclusie
Deze tumor cellijnen geënt in verschillende syngene hosts moeten blijken zeer nuttig te zijn voor het optimaliseren van immunotherapie regimes die uiteindelijk zal worden getest in transgene dieren ontwikkelen primaire maagcarcinomen. achtergrond
Maagkanker is de tweede meest voorkomende kanker wereldwijd [1]. Het wordt vaak pas ontdekt als een vergevorderd stadium; bijgevolg, de 5-jaars overleving tarieven zijn laag (10-20%). Vanwege lokale invasie en metastase, radiotherapie of chemotherapie niet significant de duur of de kwaliteit van leven van patiënten met gevorderde maagkanker. Derhalve ontwikkeling van nieuwe neoadjuvante en adjuvante behandelingsmodaliteiten nodig. Immunotherapie kan een veelbelovend alternatief optie. Een aantal immunotherapie zal als adoptieve overdracht van tumor-specifieke T-cellen, en vaccinatie met behulp van ongedefinieerde tumorantigenen afkomstig van tumor lysaten en tumorcellijnen of gedefinieerde tumorantigenen gewoonlijk door dendritische cellen worden geëvalueerd voor diverse kankers [2, 3] . Voor maagkankers, immunotherapie niet ernstig rekening gehouden door het concept dat maagkanker slecht immunogeen. Daarom slechts een klein aantal klinische immunotherapie studies gerapporteerd [4-7]. Bovendien, slechts een beperkt aantal tumor- geassocieerde antigenen met potentieel nut voor immunotherapie zijn geïdentificeerd [8-11]. Derhalve het vermogen van het immuunsysteem te herkennen en uit te roeien maagkankers is grotendeels onbekend. Om inzicht te krijgen in de werkzaamheid van verschillende immuuntherapie voor de behandeling van maagkanker en het onderliggende mechanisme van geïnduceerde immuunresponsen diermodellen maagdarmkanker onontbeerlijk helderen.
Daarom hebben verschillende groepen waaronder ons onlangs transgene of knock uitchecken muizenstammen die maag adenomen en adenocarcinomen ontwikkelen in verschillende delen van de maag na verschillende vertragingen [12]. We hebben een transgene maagcarcinoom ontwikkeld C57BL /6 muismodel basis van een SV40 grote T-antigeen (SV40 Tag) transgen gecontroleerd door een menselijke carcino-antigeen (CEA) gen promoter (van -424 tot -8 van de translationele startplaats) [13 ]. In 100% van de dieren wordt dysplastische crypte formatie in het maagslijmvlies waargenomen in de pylorus regio reeds in 30 dagen oude CEA424 /SV40 Tag-transgene muizen. Dysplasie ontwikkelt tot invasieve carcinomen en dag 50 geheel pylorus maagslijmvlies is vervangen door carcinoomcellen. Tussen de leeftijd van 90 à 110 dagen de transgene muizen worden stervende en sterven waarschijnlijk van ondervoeding als gevolg van verstopping van de pylorus [13]. De controle van Tag expressie door een minimale CEA genpromotor kan de tumor gerichte expressie van CEA door het kruisen CEA424 /SV40 Tag-transgene muizen met humaan CEA
-transgenic C57BL /6 muizen, die het CEA transgen expressie in dezelfde spatiotemporele expressiepatroon zoals gevonden bij de mens [13, 14]. De humane tumor marker CEA tot expressie wordt gebracht in vele menselijke adenocarcinomen waaronder meer dan 50% van maagcarcinomen [15, 16]. CEA wordt steeds meer gebruikt als doelantigeen voor verschillende antilichaam en cel-gemedieerde immunotherapie benaderingen [17-19]. CEA en Tag geschikt immunotherapie doelantigenen omdat een aantal van T cel epitopen van deze antigenen zijn geïdentificeerd in C57BL /6 muizen [20-22]. Hoewel deze transgene muizenstammen spiegel voet maagdarmkanker ontwikkeling bij mensen, experimenten met deze muizen is relatief tijdrovend en kostbaar vanwege moeilijkheden tumorgroei en de eis van transgene muizen fokken bepalen. Daarom is het wenselijk om een ​​syngene tumor transplanteerbare stelsel van maag adenocarcinomen hebben immunocompetente muizen voor optimalisatie van een bepaalde immunotherapie protocol voordat het wordt geëvalueerd in de transgene muizen. Hier beschrijven we muizen vastgesteld op basis van spontane ontwikkeling van tumoren van SV40 Tag-transgene muizen die tumorigene in beide syngene wild type en transgene muizen zijn adenocarcinoom van de maag cellijnen.
Methods
Muis stammen en cellijnen
CEA424 /Dag- transgene muizen (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgene muizen (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) en F1 muizen uit een kruising tussen CEA424 /Tag-transgene en CEA-transgene muizen zijn eerder beschreven [13, 14]. Ondertussen de transgene lijnen werden teruggekruist met C57BL /6 muizen (H-2 b) meer dan 15 generaties. De transgene lijnen en C57BL /6 muizen (Charles River, Sulzfeld, Duitsland) werden gekweekt onder standaard en pathogeenvrije omstandigheden gehouden in het dierenverblijf van het Institute for Surgical Research, Ludwig Maximilians-Universität München. Het dier experimenten werden uitgevoerd na goedkeuring door de lokale dierenwelzijn commissie. Carcinogeen en immunogeniciteit testen werden muizen gebruikt 8-12 weken. Afrikaanse groene apenniercellijn Cos7L cellijn werd verkregen van de American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). De BALB /c-afgeleide fibrosarcoom Meth-A werd vriendelijk verschaft door W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA-cellen werden verkregen door transfectie van Meth-A cellen met het pRc /CMV-CEA expressieplasmiden gebruikt FuGENE ™ 6 transfectiereagens (Roche Molecular Biochemicals, Zwitserland) volgens de instructies van de fabrikant. Meth-A-CTAG en RBL5 /T transfectanten werden eerder beschreven [23].
Vaststelling van maagcarcinoom cellijnen Ondernemingen De maagcarcinomen gebruikt tumorcellijnen stellen werden verkregen uit verschillende 8, 13 weken oude muizen. Vier afgeleid van CEA424 /Tag-transgene muizen en 4 vanaf CEA424 /tag-CEA-double transgene muizen. De namen van de cellijnen afgeleid van deze muizen worden gekenmerkt door de superscript "CEA". Alle kweken werden in RPMI1640 gesupplementeerd met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS "Gold", PAA Laboratories, Coelbe, Duitsland), 2 mM L-glutamine, 100 U /ml penicilline, 100 ug /ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren en 1 mM natriumpyruvaat (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland), verder aangeduid als tumor medium (TM). Tumorweefsels werden uitvoerig gewassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 200 ug /ml gentamicine en 2,5 ug /ml amfotericine B (GIBCO /Invitrogen), in 1 mm gesneden 3 stukken met een scalpel en uitgeplaat in weefselkweek kolven met TM. Het kweekmedium werd elke 3-4 dagen vervangen. Epitheelcellen en fibroblasten groeien uit het weefsel fragmenten werden gescheiden door cel schrapen, selectieve trypsine en selectieve passage met 1000 U /ml collagenase en 500 U /ml hyaluronidase (Biochrom, Berlijn, Duitsland). Tijdens dissociatie, werden de kolven gecontroleerd in het kader van een omgekeerde microscoop en de spijsvertering werd gestopt toen fibroblasten maar niet epitheelcellen werden losgemaakt (trypsine) of vice versa (collagenase /hyaluronidase). Deze werkwijze werd wekelijks herhaald totdat alle fibroblasten werden uit de tumor celkweken. Tijdens het genereren van de 424GC-cellijn, werd een fibroblast cultuur vastgesteld op basis van verontreinigende fibroblasten (424 fibroblasten). Sferoïden gevormd binnen 5-7 dagen na het zaaien 0,5 x 10 3 mGC8 cellen in Noble agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland) gecoate 96-well platen (TPP-Biochrom, Berlijn, Duitsland) in 200 gl TM die vervangen door vers medium elke twee dagen. Levensvatbaarheid van cellen op het oppervlak van de sferoïden te evalueren werden sferoïden geïncubeerd met FITC-gelabeld annexine V (Annexine V FITC Apoptose Detectie Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Duitsland) voor de detectie van apoptotische cellen of met propidiumjodide om necrotische identificeren cellen volgens aanbevelingen van de fabrikant.
Flow cytometry analyses
te oppervlak kleurende cellen werden getrypsiniseerd, gewassen met PBS en gesuspendeerd in PBS /0,5% w /v runderserumalbumine (BSA), aangevuld met 0,02% w /v natrium azide. Voor inductie van MHC moleculen, werden de cellen geïncubeerd met 20 ng /ml interferon-γ (IFNy, Peprotec, Londen, UK) gedurende 24 uur voor oogsten. Niet-specifieke binding van antilichamen aan Fc receptoren werd geblokkeerd door voorincubatie van de cellen met 1 ug /10 6 cellen van anti-CD16 /CD32 monoklonaal antilichaam (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Duitsland) gedurende 15 min . Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met 0,5 ug /10 6 cellen van het mAb plaats gedurende 30 minuten bij 4 ° C, tweemaal gewassen en eventueel vervolgens reageren met een tweede fase antilichaam gedurende 15 minuten bij 4 ° C . De cellen werden tweemaal gewassen en geanalyseerd met een FACScan (BD, Mountain View, CA). Dode cellen werden uitgesloten door propidiumjodide kleuring. De volgende reagentia en mAb tegen muizen-antigenen van BD Pharmingen werden gebruikt: phycoerythrine (PE) geconjugeerd muis IgG 2a anti-IA b, gebiotinyleerde muis IgG 2a anti-H-2D b , PE-geconjugeerde muis IgG 2aanti-H-2K b, PE-geconjugeerd anti-muis CD80 /B7-1, PE-geconjugeerd rat IgG 2a anti-muis CD40, PE-geconjugeerd rat IgG 2a anti-muis CD86 /B7-2, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd, Armeens hamster IgG 2 anti-muis CD80 /B7-1. FITC-geconjugeerd rat IgG 1 mAb R3-34, PE-geconjugeerd rat IgG 1 mAb R3-34, PE-geconjugeerde muis IgG 2a anti-rat SIRP, FITC-geconjugeerd Armeense hamster IgG 2anti-KLH en PE-geconjugeerd rat IgG 2amAb diende als isotype controles. Mouse anti-muis CEACAM1 mAb CC1, rat anti-muis CEACAM1 AgB10 [24] en rat anti-muis E-cadherine en anti-muizen EpCAM mAb's waren een soort geschenk van K. Holmes, Universiteit van Colorado, BB Singer, Charité in Berlijn, en P. Ruf, Trion Research, München, respectievelijk. De kruisreactief muis-anti-humaan mAb CEACAM 4/3/17 (specifiek voor humaan CEA /CEACAM5 in de muis) werden gekocht bij GENOVAC (Freiburg, Duitsland). Muizenantilichamen werden gedetecteerd met PE-geconjugeerd geit anti-muis IgG, rat antilichamen met FITC-geconjugeerd ezel-anti-rat-IgG (DAKO).
Detectie van CEA en SV40 Tag door Western blotting
Exponentieel groeiende gastrische carcinoomcellen , Cos7L cellen, Cos7L-CEA transfectanten, Meth-a cellen en Meth-a-CTAG transfectanten die een afgeknotte cytoplasmatisch gelegen SV40 Tag uiten werden geoogst door behandeling met trypsine. De cellen werden driemaal gewassen in PBS en gelyseerd in een dichtheid van 10 6 cellen /ml in lysisbuffer. De eiwitconcentratie werd bepaald met de BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Celextracten overeenkomt met 10 ug eiwit werden gescheiden door elektroforese door 10% SDS-polyacrylamide gels (Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland), overgebracht naar membranen fluoride polyvinyliden en geïncubeerd met 10 ug /ml anti-humaan mAb CEACAM 4/3/17 of 1: 100 verdund hamster anti-SV40 Tag antiserum (een soort geschenk door K.-H. Scheidtmann, Universiteit van Bonn). Gebonden antilichamen werden gereageerd met mierikswortel-peroxidase gelabelde secundaire antilichamen en gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescentie gebaseerde detectiesysteem. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Duitsland)
Cell verdubbeling tijd bepalen
In vitro
verdubbelingstijden van de cellijnen werden bepaald door het uitplaten de gastrische carcinoomcellen in 24-well platen in TM met gebruik van de start aantal cellen en telling van de celmonsters van drie putjes na zachtjes trypsine elke 3 dagen gedurende 21 dagen. De in vivo
verdubbelingstijden werden berekend uit tumorvolume metingen (zie hieronder) na inoculatie met drie verschillende uitgangsposities aantal cellen (drie muizen per groep). Verdubbelingstijden werden berekend uit de log-fase van de groeicurven.
Tumorigeniciteit en immunogeniciteit van de cellijnen
carcinogeen beoordeling tumorcellen werden driemaal in PBS en 50 ui celsuspensie met het aangegeven aantal cellen gewassen werden geïnjecteerd subcutaan in de geschoren rechterflank van de muizen. Om de immunogeniciteit te bepalen, 10 7 tumorcellen /ml werden gelyseerd door twee opeenvolgende vries en dooicycli. De muizen werden viermaal geïmmuniseerd met tussenpozen van een week 10 6 gelyseerde tumorcellen in de rechterflank. Drie weken later werden de muizen uitgedaagd door subcutane injectie van 3 x 10 6 levensvatbare tumorcellen in de linker flank. Experimentele groep bestond uit 4-6 muizen. Tumorontwikkeling werd gevolgd door periodieke metingen van tumorgrootte en het tumorvolume werd berekend volgens de formule: tumorvolume (mm 3) = d 2 x D /2, waarbij d en D zijn de kortste en de langste tumordiameter respectievelijk. Dieren werden gedood wanneer de tumoren een volume van 300 mm bereikt 3.
Generatie Tag-specifieke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en stimulering van gastrische carcinoma cellijnen
CTL's werden gegenereerd zoals eerder is beschreven [23] . In het kort, muizen werden intradermaal ingeënt met 1 micrometer gouddeeltjes bekleed met een Tag expressieplasmide (BMG /CT-Ag.1 [23]) in de geschoren buikhuid met behulp van een helium druk (200 psi) aangedreven biolistische inrichting (Helios gen pistool; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland). Miltcellen verkregen 14 dagen na vaccinatie werden opnieuw gestimuleerd met wekelijkse intervallen met bestraalde RBL5 /T transfectanten in RPMI-1640/10% FCS aangevuld met 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T is een Rauscher-virus getransformeerde T-lymfoom-cellijn afgeleid van een C57BL6 (H-2b) muis getransfecteerd met een SV40 Tag expressieplasmide. Van epitoop-specifieke CTL miltcellen genomen 10 dagen na vaccinatie genereren werden opnieuw in vitro gestimuleerd met bestraalde, Tag peptide-gepulseerde RBL5-cellen. De T1, T2 /3 en T4 epitoop specificiteit van de CTL werd gecontroleerd door bepaling van de IFNy inhoud van de media na stimulatie met peptide-gepulseerde targetcellen via ELISA.
Cytokine detectie met ELISA
Voor vastlegging en detectie van IFNy in supernatanten door gebruikelijke sandwich ELISA, gebruikten we mAb R4-6A2 en gebiotinyleerd mAb XMG1.2 respectievelijk (BD Pharmingen). Uitsterven werd geanalyseerd bij 405/490 nm op een TECAN microplaat ELISA-lezer (TECAN Crailsheim, Duitsland) met de Easywin software (TECAN). De detectielimiet van de ELISA voor IFNy was 20 pg /ml.
Resultaten
Vaststelling en fenotype van de gastrische carcinoma cellijnen
Van 8 maagcarcinoom monsters 7 cellijnen kunnen worden vastgesteld. Vier cellijnen werden afgeleid van CEA424 /Tag-transgene muizen (424GC, van een mannelijke muis, mGC3, vrouwelijke, mGC5, man, en mGC8, vrouw) en drie lijnen van CEA424 /Tag-CEA-transgene muizen (mGC2 CEA, man; mGC4 CEA, man; mGC11 CEA, vrouwelijk). De tijd die nodig is om pure epitheliale celkweken varieerde sterk te verkrijgen (gemiddeld 6 maanden, range 3-16 maanden). Hoewel de tumorcellen groeien als hechtende cellen in kweek, ze de neiging om aggregaten te vormen in plaats van verspreiden via kweeksubstraat (fig. 1A). De epitheliale oorsprong van de tumorcellen bewees morfologische criteria waaronder de aanwezigheid van mucine in de cellen (Fig. 1A) en de expressie analyse van eiwitten gewoonlijk tot expressie gebracht in epitheliale cellen (EpCAM, E-cadherine, CEACAM1) (Fig. 2A) . Een verlaagd gehalte mucine werd in alle cellijnen in vergelijking met het gehalte in normale maagepitheelcellen maar vergelijkbaar met die in tumorcellen binnen de maagcarcinoom in transgene muizen (Fig. 1A en [13]). Alle cellijnen weergegeven CEACAM1 en EpCAM op hun oppervlakte behalve mGC11 CEA, geen daarvan tot expressie E-cadherine (Fig. 2A en gegevens niet getoond). Alle cellijnen tot expressie gebracht MHC klasse I H-2K en, en op een veel lager niveau, H-2D moleculen (fig. 2B). Expressie van beide eiwitten werd sterk bevorderd door IFNy stimulatie. Geen expressie van MHC klasse II moleculen (I-Ab) werd gedetecteerd (Fig. 2B en gegevens niet getoond). CD54, CD80, CD86 en CD95 werd niet gedetecteerd op een cellijn (gegevens niet getoond). Figuur 1 Morfologie van maagcarcinoom cellijnen gekweekt als monolaag culturen of als driedimensionale sferoïden. (A) De cellijnen vertonen een iets andere epitheliale morfologie. De meeste cellen van alle cellijnen bevatten een kenmerkende intracellulaire vacuole (pijlen) die waarschijnlijk mucinous materiaal rood gekleurd door de PAS-methode (laatste foto rechts in onderste paneel) bevat. (B) Sferoïde gevormd door het kweken van mGC8 tumorcellen op zachte agar: vertrokken, fase contrast; rechts, fluorescentie kleuring van necrotische cellen met propidiumjodide (rood) en apoptotische cellen met FITC-gelabelde annexinV (groen, gekenmerkt door pijlpunten) zoals beschreven in "Materialen en werkwijzen". Vergroting: corresponderen met 10 urn. mgc muizen maagcarcinoom.
Figuur 2 Celoppervlakexpressie van epitheliale merkers (A) en MHC klasse I en II moleculen (B). Maagcarcinoom cellijnen werden omgezet ofwel met PE gelabelde (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) of ongelabeld mAb (CEACAM1, E-cadherine, EpCAM), gevolgd door incubatie met PE gemerkt anti-muis IgG of FITC -gemerkte anti-rat IgG en geanalyseerd door flowcytometrie. Histogrammen tonen de resultaten verkregen met antilichamen tegen relevante antigenen (open grijs) en zonder (open zwarte) IFNy voorafgaande stimulatie en irrelevante antigenen (grijs gevuld curves).
Om het potentieel van de cellijnen moeten worden vastgesteld voor het genereren van driedimensionale tumormodellen analyseerden we tumorcel sferoïde vorming in vitro. Zoals in Fig. 1B de cellijnen gevormd compact tumorcel sferoïden na 8 dagen kweken bij 103 cellen werden in zachte agar-gecoate 96-well platen. Alleen kleine intra-experimentele variatie werd waargenomen over de omvang van de sferoïden. Kleuring met propidiumjodide en FITC-gelabeld annexine V blijkt dat tenminste de oppervlaktelaag van de sferoïden bestond levensvatbare cellen met zeer weinig dode cellen verbonden (fig. 1B).
Transgene expressie door de gastrische carcinoom cellijnen
CEA en tag kan dienen als tumor-specifieke antigenen (TSA) of tumor-geassocieerde antigenen (TAA) na transplantatie van de nieuw gevestigde tumorcellijnen in immunocompetente syngene C57BL /6 en CEA of Tag-transgene muizen, respectievelijk. Hoewel gespeeld bij tumorvorming wordt Tag transgenexpressie niet altijd in tumorcellijnen afkomstig van Tag-transgene muizen, zoals in TRAMP tumorcellijnen [25]. Dit leidde ons naar de expressie en MHC klasse-I beperkte voorstelling van de tag transgen en de expressie van CEA in de ingestelde maagcarcinoom cellijnen te analyseren. CEA celoppervlak expressie werd geanalyseerd cellijnen afgeleid van maagtumoren van dubbele transgene muizen door flowcytometrie en Western blotanalyse. Hoewel de expressie van het transgen CEA wordt gereguleerd door de volledige promotorregio van het humane CEA-gen de expressie van de tag wordt gestuurd door een minimale -424 /-8 bp CEA-promoter (Fig. 3A). Alle drie dubbel transgene cellijnen tot expressie CEA op het celoppervlak (fig. 3B). In de gastrische carcinoma cellijn vertoonde mGC2 CEA transgen-expressie CEA een molecuulgewicht van 180 kDa vergelijkbaar met die gevonden in de SV40 getransformeerde Afrikaanse groene aap niercellen stabiel getransfecteerd met een CEA expressievector en CEA gevonden bij de mens. Zoals verwacht, werd er geen CEA gedetecteerd in 424GC-cellen, die werden vastgesteld op basis van een CEA-negatieve Tag-transgene muizen (Fig. 3C). Tag werd gevonden door Western blot en immunofluorescentie analyse alle cellijnen afgeleid van enkele en dubbele transgene muizen (fig. 3D en gegevens niet getoond) tot expressie te brengen. Deze bevinding ondersteunt de oorsprong van de cellijnen van de maag carcinomen. Bovendien is de 424GC cellijn efficiënt gepresenteerd endogeen verwerkte Tag-afgeleide peptiden, in het bijzonder de epitoop T1, in een MHC-I beperkte wijze zoals bepaald door de inductie van IFNy-afscheiding byTag specifieke CTL (Fig. 4A). Bovendien werden de cellijnen doelmatig gedood Tag-specifieke CTL cytotoxische assays (Fig. 4B). Figuur 3 Expressie van CEA en Tag door maagcarcinoom cellijnen afgeleid van CEA424 /Dag- of CEA424 /Tag × CEA-transgene muizen. (A) Structuur van de CEA en CEA424 /Tag transgenen. De exons 1-10 van het humane CEA-gen vervat in de insert van cosmide kloon cosCEA1 [14] worden getoond als gekleurde vakjes (lichtblauw, leider, rood, IgV-achtige domein, blauwe IgG-achtige domein, grijs, transmembraandomein ,.. wit, 5 'en 3'-ongetranslateerde gebied exons flankeren vectorsequenties worden aangeduid als zwarte dozen de locatie van de CEA minimale promoter in de SV40 Tag gen transgen wordt aangegeven met stippellijnen, worden de namen van de transgene lijnen weergegeven in de linkermarge. (B) Flowcytometrie werd uitgevoerd door etikettering van de vermelde cellen of met de CEA-specifieke mAb 26/3/13 (gevulde curves) of een isotype-gematchte antilichaam (open curves), gevolgd door PE-gelabelde geit anti-muis IgG antilichamen. (C, D) Voor Western analyse 10 pg totaal eiwit uit extracten van 424GC of mGC8 cellen vastgesteld van CEA424 /Tag-transgene muizen en mGC2CEA en mGC4CEA cellen van CEA424 /dag x CEA-transgene muizen grootte gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese, overgebracht naar een membraan en omgezet met het CEA-specifieke mAb 26/3/13 (C) of hamster polyklonaal anti-tag antilichamen (D). Extracten van Cos7L-CEA en Meth-A cellen stabiel getransfecteerd met expressievectoren die coderen voor CEA of een tag ontbreekt een gebied met nucleair lokalisatiesignaal (CTAG) diende als een positieve controle. De afmetingen van eiwit markers zijn aangegeven in de linker marge.
Figuur 4 MHC klasse I-beperkte presentatie van epitopen door Tag muizen maagcarcinoom cellijnen. (A) Epitoop-specifieke CTL gegenereerd in C57BL /6 muizen door DNA-immunisatie met een Tag expressievector latere ontwikkeling van in vitro stimulatie met Tag-peptide beladen RBL5-cellen werden geïncubeerd met bestraalde 424GC, 424 fibroblasten, RBL5 en Tag T1, T2 /3 of T4 peptide-gepulseerde RBL5 cellen gedurende 24 uur en hun IFNy uitscheiding in het kweekmedium werd bepaald met ELISA. Uitscheiding van IFNy door CTL gestimuleerd met 424GC cellen geeft aan dat deze cellen aanwezig SV40Tag-specifieke peptiden in een MHCI-beperkte wijze. (B) Coculture van 424GC en 424 fibroblasten werden behandeld met 107 Tag-specifieke CTL in een petrischaal gedurende 48 uur. Daarna werden niet-hechtende (dode) cellen verwijderd. Links, co-cultuur vóór CTL behandeling; rechts, co-cultuur na de behandeling. Pijlen geven de positie van de tumorcellen voor toevoeging van CTL
tumorigeniciteit van de gastrische carcinoma cellijnen Belgique Om de tumorigeniciteit van de cellijnen, diverse nummers (1 x 10 5 bepaalt;. 3 x 10 5; 1 x 10 6) cellen werden subcutaan geïnjecteerd in C57BL /6 muizen. Alle cellijnen konden tumoren in 100% van de dieren te vormen, indien ten minste 3 x 10 5 tumorcellen werden geïnjecteerd (Fig. 5A). De tumoren groeiden bijna exponentieel zonder enige vertraging totdat ze een volume van 300 mm 3 bereikt. Geen metastasen op afstand kan worden gedetecteerd tijdens de observatieperiode aanhouden. Western blotanalyse uitgevoerd op getransplanteerde tumoren aangetoond dat beide transgenen door de cellijnen in vivo
(gegevens niet getoond) hadden. De verdubbelingstijd van de tumorcellen in vivo
uitgangsmateriaal tumorload van 10 6 cellen varieerde van 7,2 (mGC8) en 13,8 dagen (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
alle cellijnen vertoonden vergelijkbare verdubbelingstijden van ongeveer 3 dagen (Fig. 5B). Verder hebben we vergeleken subcutane tumorvorming cellijnen in wild-type (C57BL /6) en transgene muizen. Geen significante verschillen waargenomen in tumor take en tumorgroei voor de cellijn 424GC bij injectie subcutaan in wild-type of CEA424 /Tag-transgene muizen (fig. 6A) en mGC11 CEA cellen na injectie in wildtype en CEA424 /Tag-CEA-transgene muizen (Fig. 6B). Figuur 5 In vivo (A) en in vitro groeikenmerken (B) van muizen gastrische carcinoma cellijnen. Drie muizen werden elk geïnjecteerd met de aangegeven doseringen tumorcel. Tumor groei werd gekwantificeerd door twee loodrechte metingen van de tumor diameter en berekening van het volume beschreven in de paragraaf Materialen en Werkwijzen. De in vitro groeikenmerken te bepalen, werden cellen gekweekt in 24-wells platen beginnend met de aangegeven celaantallen. Op verschillende tijdstippen werden cellen van drie putjes geoogst en geteld. Resultaten worden getoond als gemiddelde +/- standaarddeviatie (SD). Best passende krommen en verdubbelingstijden in dagen (tussen haakjes) werden berekend met de GraphPad software.
Figuur 6 Groei van maagcarcinoom cellijnen in wild-type en transgene muizen. 3 x 105 424GC cellen werden subcutaan geïnjecteerd in C57BL /6 en CEA424 /Tag-transgene muizen (A) of 3 x 105 mGC11CEA cellen werden geïnjecteerd in C57BL /6 en CEA424 /dag x CEA-dubbel transgene muizen (B). Tumor groei werd gekwantificeerd door twee loodrechte metingen van de tumor diameter en berekening van het volume beschreven in de paragraaf Materialen en Werkwijzen. Resultaten worden getoond als gemiddelde +/- SD (n = 3).
Immunogeniciteit van de gastrische carcinoma cellijnen Ondernemingen De vergelijkbare groei van de tumor cellijnen in wildtype en transgene muizen blijkt dat er geen significante immuunrespons op ofwel tumor antigeen (Tag, CEA) trad op bij tumor dragende muizen. Het was onmogelijk Tag-specifieke CTL worden geïdentificeerd in de milt van tumordragende wildtype muizen op subcutane progressieve groei van Tag-expressie gastrische carcinoomcellen (gegevens niet getoond). Wanneer echter dubbel transgene cellijnen gegroeid in muizen, CEA-specifieke antilichamen kunnen worden geïdentificeerd in wild-type C57BL /6-muizen maar niet in CEA-transgene muizen (fig. 7A). Verder drie immunisaties van C57BL /6 muizen met 106-freeze ontdooid mGC8 tumorcellen wekelijks beide voorkwam groei van subcutaan geïnjecteerde levende mGC8 cellen geheel of tumor uitgroei werd uitgesteld bijna drie weken afhankelijk van de dosis geïnjecteerde tumorcel (Fig. 7B , C). Deze experimenten tonen dat de tumorcellijnen immunogeen zijn onder bepaalde omstandigheden. Echter, C57BL /6-muizen niet spontaan monteren efficiënte tumor-progressie beperkend immuunrespons ofwel tumorantigeen tijdens subcutane tumorgroei. Figuur 7 Immunogeniciteit MGC cellen. (A) Anti-CEA antilichamen werden bepaald in het serum van C57BL /6 en CEA-transgene muizen met flowcytometrie. Alle muizen waren progressief groeiende tumoren zonder duidelijke necrose na transplantatie en groei van de aangegeven cellijnen 35-40 dagen. mGC4CEA cellen werden geïncubeerd met het serum van de muizen aangegeven bij verschillende verdunningen en gebonden primaire antilichamen gedetecteerd met een PE-geconjugeerd anti-muizenantilichaam. (B, C) drie C57BL /6 muizen werden elk subcutaan driemaal geïnjecteerd wekelijks met 1 x 106 cellen mGC8 gedood door twee vries-dooicycli. Twee weken na de laatste vaccinatie werden de muizen uitgedaagd door injectie met 1 x 106 (B) en 3 x 106 (C) levende cellen mGC8 respectievelijk (ingevulde cirkels). Als controle werden tumorcellen geïnjecteerd in niet-geïmmuniseerde muizen (open cirkels). Tumor volumes werden berekend zoals beschreven in Materiaal en Methoden sectie. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde waarden +/- SD.
Discussie
Het belangrijkste doel van deze studie was om een ​​therapeutisch model van maagkanker in immunocompetente muizen die een diermodel zou bieden om anti-tumor immuniteit te evalueren en vast te stellen immunotherapeutische strategieën.

• Primaire maag non-Hodgkin-lymfoom in het Chinees patiënten: klinische kenmerken en prognostische factors
• GASTRICHIP: D2 resectie en hypertherme intraperitoneale chemotherapie bij lokaal gevorderde maagcarcinoom: een gerandomiseerde en multicenter fase III studie