Karakterisering af gastrisk adenocarcinom cellelinjer etableret fra CEA424 /SV40 T-antigen-transgene mus med eller uden en menneskelig CEAtransgene

Karakterisering af gastrisk adenocarcinom cellelinjer etableret fra CEA424 /SV40 T-antigen
-transgenic mus med eller uden en menneskelig CEA
transgen
Abstrakt
Baggrund
gastrisk karcinom er en af ​​de hyppigste kræftformer i verden . Patienter med gastrisk cancer på et avanceret sygdom stadium har en dårlig prognose, som følge af den begrænsede effektivitet af tilgængelige behandlinger. Derfor er udviklingen af ​​nye terapier, som immunterapi til behandling af gastrisk cancer er af største betydning. Da anvendeligheden af ​​igangværende prækliniske modeller til vurdering af immunterapier til gastriske adenokarcinomer er begrænset målet af den foreliggende undersøgelse var at etablere murine in vivo Salg modeller, som tillader trinvis forbedring af immunterapier til gastrisk cancer. Salg Methods
Da der ikke murine gastrisk adenocarcinom cellelinjer er tilgængelige vi etableret fire cellelinjer (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) fra spontant udvikler tumorer i CEA424 /SV40 T-antigen (CEA424 /Tag) mus og tre cellelinjer afledt dobbelt transgene afkom af CEA424 /Tag mus parret med humant carcinoembryonisk antigen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) mus (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag er en transgen C57BL /6 mus stamme, der huser Tag under kontrol af en -424 /-8 bp CEA gen promotor, som fører til udvikling af invasiv adenokarcinom i kirtelmaven. Tumorcellelinier etableret fra CEA424 /Tag-CEA mus udtrykker den veldefinerede tumorantigen CEA under kontrol af dets naturlige regulatoriske elementer.
Resultater
epiteloprindelse af tumorcellerne blev bevist ved morfologisk kriterier, herunder tilstedeværelsen af mucin i cellerne og ekspressionen af ​​celleadhæsionsmolekyler EpCAM og CEACAM1. Alle cellelinier konsekvent udtrykke transgener CEA og /eller Tag og MHC klasse I molekyler fører til deres følsomhed over for lyse ved Tag-specifik CTL in vitro
. Trods præsentationen af ​​CTL-epitoper afledt fra transgene produkter de tumorcellelinier var tumorigene når de er podet ind i C57BL /6, CEA424 /Tag eller CEA424 /Tag-CEA-transgene værter og ingen signifikante forskelle i tumor tage og blev observeret tumorvækst i de forskellige værter. Selvom der ikke blev observeret nogen spontan tumor afvisning, vaccination af C57BL /6-mus med lysater fra gastriske carcinoma cellelinier beskyttede C57BL /6-mus fra tumorprovokation, hvilket viser tumorigeniciteten af ​​tumorcellelinier in ikke-transgen mus af H-2 B haplotype.
Konklusion
Disse tumorcellelinjer podet i forskellige syngene værter skulle vise sig at være meget nyttigt at optimere immunterapi regimer endeligt afprøvet i transgene dyr udvikler primære gastriske carcinomer.
Baggrund
mavekræft er den næsthyppigste cancer verdensplan [1]. Det er ofte ikke opdaget, før et fremskredent stadium; følgelig finder 5-årige overlevelsesrater er lave (10 til 20%). På grund af lokal invasion og metastase, strålebehandling eller kemoterapi ikke væsentligt øge længden eller livskvalitet hos patienter med fremskreden mavekræft. Derfor er der behov udvikling af nye neoadjuvant og adjuvans behandlingsmodaliteter. Immunterapi kan være et lovende alternativ mulighed. En række immunoterapifremgangsmåder som adoptiv overførsel af tumorspecifikke T-celler, og vaccination under anvendelse af enten udefinerede tumorantigener afledt fra tumorlysater og tumorcellelinier eller definerede tumorantigener almindeligvis præsenteret af dendritiske celler er under evaluering for forskellige cancerformer [2, 3] . For gastrisk kræft, var immunterapi ikke taget alvorligt i betragtning på grund af det koncept, at mavekræft er dårligt immunogen. Derfor er der rapporteret kun et lille antal kliniske immunterapi forsøg [4-7]. Derudover er der blevet identificeret et begrænset antal tumorassocierede antigener med potentiel anvendelse til immunterapi [8-11]. Følgelig evnen af ​​immunsystemet til at genkende og udrydde gastriske cancere er stort set ukendt. For at få indsigt i effekten af ​​forskellige immunterapier til behandling af gastrisk kræft og at belyse den underliggende mekanisme af inducerede immunrespons dyremodeller for gastrisk adenocarcinom er uundværlige.
Til dette formål har flere grupper, herunder vores nyligt etablerede transgene eller banke udtjekning musestammer, som udvikler gastriske adenomer eller adenocarcinomer i forskellige dele af maven efter forskellige latenstider [12]. Vi har udviklet en transgen gastrisk carcinom C57BL /6 mus model baseret på en SV40 stort T-antigen (SV40 Tag) transgen kontrolleres af et humant carcinoembryonisk antigen (CEA) genpromotor (fra -424 til -8 af det translationelle startsted) [13 ]. I 100% af dyrene, er dysplastiske krypt dannelse i maveslimhinden observeret i pylorus region allerede 30 dag gammel CEA424 /SV40 Tag-transgene mus. Dysplasi udvikler sig til invasive carcinomer og ved dag 50 hele pyloric maveslimhinden er blevet erstattet af carcinomceller. Mellem en alder af 90 til 110 dage transgene mus bliver døende og dø sandsynligvis af underernæring som følge af blokering af pylorus [13]. Styringen af ​​Tag ekspression med en minimal CEA genpromotor tillader tumor-rettet ekspression af CEA ved at krydse CEA424 /SV40 Tag-transgene mus med human CEA
-transgenic C57BL /6-mus, der udtrykker CEA transgen i en lignende spatiotemporale ekspressionsmønster som fundet i mennesker [13, 14]. Den humane tumor markør CEA udtrykkes i mange humane adenokarcinomer, herunder mere end 50% af gastriske carcinomer [15, 16]. CEA stigende grad anvendes som målantigen for en række antistof- og cellemedierede tumor immunoterapifremgangsmåder [17-19]. CEA og tag er egnede immunterapi målantigener da en række af T-celle epitoper af disse antigener er blevet identificeret i C57BL /6-mus [20-22]. Selv om disse transgene musestammer spejl meget nøje gastrisk adenocarcinom udvikling hos mennesker, eksperimenter med disse mus er relativt tidskrævende og dyre som følge af vanskelighederne med at bestemme tumorvækst og kravet om avl transgene mus. Derfor er det ønskeligt at have en syngen transplanterbar tumor system med gastriske adenokarcinomer i immunkompetente mus til optimering af en given immunterapi protokol før den evalueres i de transgene mus. Her beskriver vi murine gastrisk adenocarcinom cellelinjer etableret fra spontant udvikler tumorer i SV40 Tag-transgene mus, der er tumorigent i både syngen vildtype og transgene mus.
Metoder
Mouse stammer og cellelinjer
CEA424 /Tag- transgene mus (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgene mus (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm, CEA2682) og F1 mus fra en krydsning mellem CEA424 /Tag-transgene og CEA-transgene mus er tidligere blevet beskrevet [13, 14]. Imens de transgene linjer er blevet tilbagekrydset til C57BL /6 mus (H-2 b) i mere end 15 generationer. De transgene linjer samt C57BL /6 mus (Charles River, Sulzfeld, Tyskland) blev avlet og holdt under standard patogenfrie betingelser i dyret facilitet for Institut for Surgical Research, Ludwig-Maximilians-Universitetet i München. Forsøgene dyr blev udført efter godkendelse af den lokale dyrevelfærd udvalg. For tumorigenisitetsforsøg og immunogenicitet assays mus blev anvendt ved 8-12 ugers alderen. Afrikansk grøn abenyre Cos7L cellelinje blev opnået fra American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). BALB /c-afledt fibrosarkom Meth-A blev venligst stillet til rådighed af W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA-celler blev opnået ved transfektion af Meth-A-celler med pRc /CMV-CEA ekspressionsplasmider ved hjælp FuGENE ™ 6 transfektionsreagens (Roche Molecular Biochemicals, Schweiz) ifølge producentens anvisninger. Meth-A-CTAG og RBL5 /T-transfektanter blev beskrevet tidligere [23].
Etablering af gastrisk karcinom cellelinjer
Den gastriske carcinomer bruges til at etablere tumorcellelinjer blev opnået fra 8 forskellige, 13 uger gamle mus. Fire stammer fra CEA424 /Tag-transgene mus og 4 fra CEA424 /Tag-CEA-dobbelt transgene mus. Navnene på cellelinjer afledt fra sidstnævnte mus er markeret med hævet "CEA". Alle kulturer blev udført i RPMI1640 tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS "Gold", PAA Laboratories, Coelbe, Tyskland), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, ikke-essentielle aminosyrer og 1 mM natriumpyruvat (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), og yderligere omtalt som tumor-medium (TM). Tumorvæv blev vasket grundigt i phosphatbufret saltvand (PBS) suppleret med 200 ug /ml gentamicin og 2,5 ug /ml amphotericin B (GIBCO /Invitrogen), skåret i 1 mm 3 stykker med en skalpel og udpladet i vævskultur kolber indeholdende TM. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 3-4 dage. Epitelceller og fibroblaster vokser ud af vævet fragmenter blev separeret ved celle skrabning, selektiv trypsinisering og selektiv passage med 1.000 U /ml collagenase og 500 U /ml hyaluronidase (Biochrom, Berlin, Tyskland). Under dissociation, blev kolberne overvåget under et omvendt mikroskop og fordøjelse blev standset, da fibroblaster, men ikke epitelceller blev frigjort (trypsin) eller omvendt (collagenase /hyaluronidase). Denne procedure blev gentaget ugentligt, indtil alle fibroblaster blev slået fra tumoren cellekulturer. Under generering af 424GC cellelinien blev en fibroblast kultur etableret fra kontaminerende fibroblaster (424 fibroblaster). Sfæroider dannet inden for 5-7 dage efter podning 0,5 × 10 3 mGC8 celler i Noble agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) -belagt 96-brønds plader (TPP-Biochrom, Berlin, Tyskland) i 200 pi TM som blev erstattet med frisk medium hver anden dag. For at vurdere levedygtigheden af ​​celler på overfladen af ​​sfæroiderne, blev sfæroider inkuberet med FITC-mærket annexin V (Annexin V FITC Apoptose Detektion Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Tyskland) til påvisning af apoptotiske celler eller med propidiumiodid at identificere nekrotisk celler ifølge producentens anbefalinger.
Flowcytometri analyser Hus til overfladefarvning blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og suspenderet i PBS /0,5% vægt /volumen okseserumalbumin (BSA) suppleret med 0,02% vægt /volumen natrium- azid. Til induktion af MHC-molekyler, blev celler inkuberet med 20 ng /ml interferon-γ (IFNy; Peprotec, London, UK) i 24 timer før høst. Ikke-specifik binding af antistoffer mod Fc-receptorer blev blokeret ved præinkubation af cellerne med 1 ug /10 6 celler af anti-CD16 /CD32 monoklonalt antistof (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland) i 15 min . Efterfølgende blev cellerne inkuberet med 0,5 ug /10 6 celler af mAb'et af interesse i 30 minutter ved 4 ° C, vasket to gange, og eventuelt efterfølgende omsættes med et andet-trins antistof i 15 minutter ved 4 ° C . Celler blev vasket to gange og analyseret ved hjælp af en FACScan (BD, Mountain View, CA). Døde celler blev udelukket ved propidiumiodid-farvning. Følgende reagenser og mAb'er mod murine antigener fra BD Pharmingen blev anvendt: phycoerythrin (PE) -konjugeret muse-IgG 2a anti-IA b, biotinyleret muse IgG 2a anti-H-2D B , mus PE-konjugeret IgG 2aanti-H-2K b, PE-konjugeret anti-mus CD80 /B7-1, PE-konjugeret rotte IgG 2a anti-mus CD40, PE-konjugeret rotte IgG 2a anti-muse CD86 /B7-2, fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret, armensk hamster IgG 2 anti-mus CD80 /B7-1. FITC-konjugeret rotte IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugeret rotte IgG 1 mAb R3-34, mus PE-konjugeret IgG 2a anti-rotte SIRP, FITC-konjugeret armenske hamster IgG 2anti-KLH og PE-konjugeret rotte IgG 2amAb tjente som isotypekontroller. Muse-anti-muse CEACAM1 mAb CC1, rotte-anti-muse CEACAM1 AgB10 [24] og rotte-anti-muse E-cadherin og anti-muse EpCAM mAb'er var en venlig gave fra K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité Berlin, og P. Ruf, Trion Research, München, hhv. Den krydsreaktive muse-anti-humant CEACAM mAb 4/3/17 (specifikt for human CEA /CEACAM5 i mus) blev indkøbt fra GENOVAC (Freiburg, Tyskland). Murine antistoffer blev detekteret med PE-konjugeret gede anti-mus IgG, rotte antistoffer med FITC-konjugeret æsel-anti-rotte-IgG (DAKO).
Påvisning af CEA og SV40 Tag ved Western blotting
Eksponentielt voksende gastriske carcinomceller , Cos7L celler, Cos7L-CEA transfektanter, Meth-a celler og Meth-a-CTAG transfektanter, der udtrykker en afkortet cytoplasmatisk beliggende SV40 Tag blev høstet ved trypsinisering. Celler blev vasket tre gange i PBS og lyseret ved en densitet på 10 6 celler /ml i lysispuffer. Proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Celleekstrakter svarende til 10 ug protein blev separeret ved elektroforese gennem 10% SDS polyacrylamidgeler (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), overført til polyvinyliden fluorid membraner og inkuberet med 10 ug /ml anti-humant CEACAM mAb 4/3/17 eller en 1: 100 fortyndet hamster anti-SV40 Tag antiserum (en slags gave fra K.-H. Scheidtmann, University of Bonn). Bundne antistoffer blev omsat med peberrodsperoxidase-mærkede sekundære antistoffer og visualiseret under anvendelse af en chemiluminescens-baseret påvisningssystem. (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland)
Cell fordoblingstid bestemmelse Salg In vitro
fordoblingstider af cellelinierne blev bestemt ved udpladning af gastriske carcinomceller i plader med 24 brønde i TM ved de angivne udgangsmaterialer celleantal og tælling af celleprøver fra tredobbelte brønde efter forsigtig trypsinering hver 3. dag i 21 dage. In vivo
fordoblingstider blev beregnet ud fra tumorvolumen målinger (se nedenfor) efter inokulering med tre forskellige udgangspunkter celleantal (tre mus per gruppe). Fordoblingstider blev beregnet ud fra log-fase af vækstkurver.
Tumorigenicitet og immunogenicitet af cellelinierne Hus Til tumorigenicitet vurdering tumorceller blev vasket tre gange i PBS og 50 pi cellesuspensioner med de angivne celleantal blev injiceret subkutant i det barberede højre flanke af musene. For at bestemme immunogenicitet, 10 7 tumor celler /ml blev lyseret ved to på hinanden følgende fryse og tø-cykler. Mus blev immuniseret fire gange med ugentlige intervaller med 10 6 lyserede tumorceller i den højre flanke. Tre uger senere blev musene udfordret ved subkutan injektion på 3 × 10 6 levedygtige tumorceller i venstre flanke. Forsøgsgrupper bestod af 4-6 mus. Tumorudvikling blev efterfulgt af serielle målinger af tumorstørrelse og tumorvolumenet blev beregnet ifølge ligningen: tumorvolumen (mm 3) = d 2 × D /2, hvor d og D var den korteste og den længste tumor diameter hhv. Dyr blev aflivet, når tumorerne nåede et volumen på 300 mm 3.
Frembringelse af Tag-specifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og stimulering ved gastrisk carcinom-cellelinier
CTL'er blev dannet som beskrevet tidligere [23] . Kort beskrevet blev mus intradermalt inokuleret med 1 um guldpartikler overtrukket med en Tag ekspressionsplasmid (BMG /CT-Ag.1 [23]) i den barberede abdominale hud ved anvendelse af en helium tryk (200 psi) powered biolistisk indretning (Helios genkanon; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland). Miltceller opnået 14 dage efter vaccination blev restimuleret med ugentlige intervaller med bestrålede RBL5 /T transfektanter i RPMI-1640/10% FCS suppleret med 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T er en Rauscher virus-transformerede T-lymfom cellelinie afledt fra en C57BL6 (H-2b) mus transficeret med en SV40 Tag ekspressionsplasmid. For at generere epitop-specifik CTL, miltceller taget 10 dage efter vaccination blev restimuleret in vitro med bestrålede, Tag peptidpulserede RBL5 celler. T1, T2 /3 og T4 epitop specificitet CTL blev kontrolleret ved bestemmelse af IFNy medieindhold ved stimulering med peptid-pulserede målceller anvendelse af ELISA.
Cytokine detektion ved ELISA Hus Til indfangning og påvisning af IFNy i supernatanter ved konventionel sandwich-ELISA, vi anvendte mAb R4-6A2 og biotinyleret mAb XMG1.2 henholdsvis (BD Pharmingen). Extinction blev analyseret ved 405/490 nm på en TECAN mikroplade ELISA-læser (TECAN Crailsheim, Tyskland) med EasyWin software (TECAN). Detektionsgrænsen for ELISA for IFNy var 20 pg /ml.
Resultater
Etablering og fænotype af mavens karcinom cellelinjer
Fra 8 gastrisk karcinom prøver kunne etableres 7 cellelinjer. Fire cellelinjer blev afledt fra CEA424 /Tag-transgene mus (424GC, fra en mandlig mus, mGC3, kvinde; mGC5, mandlige, og mGC8, hun) og tre linjer fra CEA424 /Tag-CEA-transgene mus (mGC2 CEA, mand; mGC4 CEA, mandlige, mGC11 CEA, kvinde). Den nødvendige til opnåelse af rene epitelcellekulturer varierede meget tid (gennemsnitlig 6 måneder, interval 3-16 måneder). Selv tumorcellerne vokse som adhærente celler i kultur, har de tendens til at danne aggregater stedet for at sprede over kultur substrat (fig. 1A). Epitel oprindelse af tumorcellerne blev bevist ved morfologiske kriterier, herunder tilstedeværelsen af ​​mucin i cellerne (fig. 1A) og ekspressionen analyse af protein almindeligvis udtrykkes i epithelceller (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (fig. 2A) . En reduceret indhold af mucin blev fundet i alle cellelinjer sammenlignet med indholdet i normale gastriske epitelceller, men svarende til den, der findes i tumorceller i den gastriske carcinoma i transgene mus (fig. 1A og [13]). Alle cellelinier viste CEACAM1 og EpCAM på deres overflade undtagen mGC11 CEA, ingen af ​​dem udtrykte E-cadherin (fig. 2A og data ikke vist). Alle cellelinier udtrykte MHC klasse I H-2K og, og på et meget lavere niveau, H-2D-molekyler (fig. 2B). Ekspression af begge proteiner blev kraftigt af IFNy stimulation. blev detekteret nogen ekspression af MHC klasse II-molekyler (I-Ab) (fig. 2B og data ikke vist). CD54, CD80, CD86 eller CD95 blev ikke fundet på nogen cellelinie (data ikke vist). Figur 1 Morfologi af gastriske carcinoma cellelinier dyrket som monolagskulturer eller som tredimensionelle sfæroider. (A) Cellelinjerne viser en lidt anden epitelial morfologi. De fleste celler i alle cellelinjer indeholder en karakteristisk intracellulær vakuole (pile), der sandsynligvis indeholder mucinøs materiale farves røde af PAS-metoden (sidste billede til højre i nederste panel). (B) Sfæroide dannet ved dyrkning mGC8 tumorceller på blød agar: venstre, fasekontrast; højre, fluorescens farvning af nekrotiske celler med propidiumiodid (rød) og apoptotiske celler med FITC-mærket annexinV (grøn, markeret med pilespidser) som beskrevet i "Materialer og metoder". Forstørrelse: barer svarer til 10 um. MGC, murine gastrisk karcinom.
figur 2 celleoverfladeekspression af epiteliale markører (A) og MHC klasse I og II-molekyler (B). Gastric carcinoma cellelinier blev omsat enten med PE-mærket (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) eller med umærkede mAbs (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM) efterfulgt af inkubering med PE-mærket anti-muse IgG eller FITC -mærket anti-rotte IgG og analyseres ved flowcytometri. Histogrammer viser de opnåede resultater med antistoffer mod relevante antigener med (åben grå) eller uden (åben sort) før IFNy stimulering og irrelevante antigener (grå fyldte kurver).
For at bestemme potentialet i cellelinjer, der skal bruges til generering af tredimensionale tumormodeller analyserede vi tumorcelle sfæroide dannelse in vitro. Som illustreret i fig. 1B cellelinierne dannet kompakte tumorcellelinier sfæroider efter 8 dages dyrkning, når 103-celler blev podet i blød agar-coatede plader med 96 brønde. Kun mindre intra-eksperimentel variation blev observeret vedrørende størrelsen af ​​sfæroiderne. Farvning med propidiumiodid og FITC-mærket annexin V viste, at i det mindste overfladen lag af sfæroiderne bestod af levedygtige celler med meget få døde celler knyttet til det (fig. 1B).
Transgenekspression af de gastriske carcinoma cellelinier
CEA og tagget kan tjene som tumorspecifikke antigener (TSA) eller tumorassocierede antigener (TAA) efter transplantation af de nyligt etablerede tumorcellelinier hos immunkompetente syngeniske C57BL /6 og CEA eller Tag-transgene mus hhv. Selv medvirkende til tumordannelse, er Tag transgenekspression ikke altid findes i tumorcellelinjer afledt af Tag-transgene mus, som i TRAMP tumorcellelinier [25]. Dette fik os til at analysere ekspressionen og MHC klasse I-begrænsede præsentation af Tag transgen samt ekspressionen af ​​CEA i de etablerede gastrisk carcinom-cellelinier. CEA celleoverfladeekspression blev analyseret i cellelinjer afledt fra gastriske tumorer fra dobbelt transgene mus ved flowcytometri og Western blot analyse. Mens ekspressionen af ​​CEA transgen reguleres af den komplette promotorregionen af ​​det humane CEA-gen ekspressionen af ​​Tag styres af en minimal -424 /-8 bp CEA promotoren (fig. 3A). Alle tre dobbelt-transgene cellelinier udtrykte CEA på celleoverfladen (fig. 3B). I det gastriske carcinomcellelinie udviste mGC2 CEA transgen-udtrykte CEA en molekylvægt på 180 kDa svarende til den, der findes i SV40-transformerede afrikanske grøn abenyreceller stabilt transficeret med en CEA-ekspressionsvektor og til CEA findes hos mennesker. Som forventet blev ingen CEA detekteret i 424GC celler, som blev etableret fra en CEA-negativ Tag-transgene mus (fig. 3C). Tag blev fundet at blive udtrykt ved Western blotting og immunofluorescens-analyse i alle cellelinjer afledt fra enkelt og dobbelt-transgene mus (fig. 3D og data ikke vist). Dette fund understøtter også oprindelsen af ​​cellelinier fra maven karcinomer. Endvidere 424GC cellelinien effektivt præsenteret endogent forarbejdede Tag-afledte peptider, især T1 epitop, i en MHC-I begrænset vis som bestemt ved induktion af IFNy sekretion byTag-specifik CTL (fig. 4A). Endvidere blev cellelinier effektivt dræbt af Tag-specifik CTL i cytotoksiske assays (fig. 4B). Figur 3 Ekspression af CEA og Tag af gastrisk karcinom cellelinjer afledt CEA424 /Tag- eller CEA424 /Tag × CEA-transgene mus. (A) Struktur af CEA og CEA424 /Tag transgener. Exonerne 1-10 af det humane CEA-gen indeholdt inden i indsatsen af ​​cosmid klon cosCEA1 [14] er vist som farvekodede bokse (lyseblå, leder, rød, IgV-lignende domæne; blå IgC-lignende domæne, grå, transmembrane domæne;.. hvide, 5 'og 3'-utranslaterede region exoner Flankerende vektorsekvenser er angivet som sorte bokse placeringen af ​​CEA minimale promotor til stede i SV40 Tag genet transgen er angivet med punkterede linier, er navnene på de transgene linjer vist i venstre margin. (B) Flowcytometri blev udført ved mærkning af de angivne celler enten med CEA-specifikke mAb 26/3/13 (udfyldte kurver) eller et isotype-matchet antistof (åbne kurver) efterfulgt af PE-mærket gede anti-muse IgG-antistoffer. (C, D) til Western-analyse, 10 ug totalt protein fra ekstrakter af 424GC eller mGC8 celler etableret fra CEA424 /Tag-transgene mus og mGC2CEA og mGC4CEA celler fra CEA424 /Tag × CEA-transgene mus var størrelse separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese, overført til en membran og omsættes med CEA-specifikke mAb 26/3/13 (C) eller hamster polyklonale anti-tag-antistoffer (D). Uddrag fra Cos7L-CEA og Meth-A-celler stabilt transficeret med ekspressionsvektorer der koder CEA eller et tag mangler en region med kernelokaliseringssignalet (CTAG) fungerede som en positiv kontrol. Størrelserne af protein markører er angivet i venstre margen.
Figur 4 MHC klasse I-begrænset præsentation af Tag epitoper af murine gastrisk karcinom cellelinjer. (A) Epitop-specifik CTL genereret i C57BL /6-mus ved DNA immunisering med et Tag ekspressionsvektor og efterfølgende ekspansion ved in vitro stimulering med mærkepeptid-loaded RBL5 celler blev inkuberet med bestrålede 424GC, 424 fibroblaster, RBL5 og Tag T1, T2 /3 eller T4 peptidpulserede RBL5 celler i 24 timer og deres IFNy sekretion i dyrkningsmediet blev bestemt ved ELISA. Sekretion af IFNy ved hjælp af CTL stimuleret med 424GC celler indikerer, at disse celler til stede SV40Tag-specifikke peptider i en MHCI-begrænset vis. (B) co-dyrkning af 424GC og 424 fibroblaster blev behandlet med 107 Tag-specifik CTL i en petriskål i 48 timer. Derefter blev ikke-adhærente (døde) celler fjernet. Venstre, cokultur før CTL behandling; højre, cokultur efter behandling. Pile viser positionen af ​​tumorcellerne før tilsætning af CTL
Tumorigenicitet af de gastriske carcinoma cellelinier
For at bestemme tumorigeniciteten af ​​cellelinierne, forskellige antal (1 x 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) af celler blev injiceret subkutant i C57BL /6-mus. Alle cellelinier var i stand til at danne tumorer i 100% af dyrene, hvis mindst 3 × 10 5 tumorceller blev injiceret (fig. 5A). Tumorerne voksede næsten eksponentielt uden forsinkelse, indtil de nåede et volumen på 300 mm 3. Ingen fjernmetastaser kunne påvises i observationsperioden tid. Western blot-analyse udført på transplanterede tumorer viste, at begge transgener blev udtrykt af cellelinierne in vivo
(data ikke vist). De fordobling tider af tumorcellerne in vivo
på en begyndende tumor belastning på 10 6 celler varierede mellem 7,2 (mGC8) og 13,8 dage (mGC3) (fig. 5A). In vitro
, alle cellelinjer udviste lignende fordoblingstider af ca. 3 dage (fig. 5B). Vi yderligere i forhold subkutan tumordannelse af cellelinier i vildtype (C57BL /6) og transgene mus. Ingen signifikante forskelle blev observeret i tumor take og tumorvækst for cellelinjen 424GC når det injiceres subkutant i vildtype eller CEA424 /Tag-transgene mus (fig. 6A) og for mGC11 CEA celler efter injektion i vildtype og CEA424 /Tag-CEA-transgene mus (fig. 6B). Figur 5 In vivo (A) og in vitro-vækstkarakteristika (B) af murine gastriske carcinoma cellelinier. Tre mus blev hver injiceret med de angivne tumorceller doser. Tumorvækst blev kvantificeret ved to vinkelrette målinger af tumoren diameter og beregning af volumenet som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. For at bestemme in vitro vækstegenskaber blev celler dyrket i 24-brønds plader starter med de angivne celleantal. På forskellige tidspunkter celler fra tredobbelte brønde blev høstet og talt. Resultaterne er vist som middelværdi +/- standardafvigelse (SD). Bedst tilpassede kurver samt fordoblingstider i dage (vist i parentes) blev beregnet ved anvendelse af GraphPad software.
Figur 6 Vækst af gastriske carcinoma cellelinier i vildtype- og transgene mus. 3 × 105 424GC celler blev injiceret subkutant i C57BL /6 og CEA424 /Tag-transgene mus (A) eller 3 × 105 mGC11CEA celler blev injiceret i C57BL /6 og CEA424 /Tag × CEA-dobbelt transgene mus (B). Tumorvækst blev kvantificeret ved to vinkelrette målinger af tumoren diameter og beregning af volumenet som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. Resultaterne er vist som middelværdi +/- SD (n = 3).
Immunogenicitet af mavens carcinoma cellelinier
lignende vækst af tumor cellelinier i vildtype- og transgene mus indikerer, at ingen signifikant immunrespons på enten tumor antigen (Tag, CEA) forekom i tumor bærende mus. Faktisk kunne ingen Tag-specifik CTL identificeres i milten hos tumorbærende vildtypemus ved progressiv subkutan vækst af Tag-udtrykkende gastriske carcinomceller (data ikke vist). Men når dobbelt transgene cellelinier voksede i mus, kunne CEA-specifikke antistoffer identificeres, i vildtype C57BL /6-mus, men ikke i CEA-transgene mus (fig. 7A). Endvidere tre immuniseringer af C57BL /6-mus med 106 fryse-optøet mGC8 tumorceller med ugentlige intervaller enten hindres væksten af ​​subkutant injiceret levende mGC8 cellerne fuldstændigt eller tumorudvækst blev forsinket i næsten tre uger afhængig af injicerede tumorcellen dosis (fig. 7B , C). Disse eksperimenter viser, at tumor cellelinier er immunogene under visse betingelser. Men C57BL /6-mus ikke spontant montere en effektiv tumorprogression-begrænsende immunreaktion til enten tumorantigen under subkutan tumorvækst. Figur 7 Immunogenicitet af MGC celler. (A) Anti-CEA-antistoffer blev bestemt i serum fra C57BL /6 og CEA-transgene mus under anvendelse af flowcytometri. Alle mus havde progressivt voksende tumorer uden åbenlys nekrose efter transplantation og vækst af de angivne cellelinier til 35-40 dage. mGC4CEA celler blev inkuberet med serum fra de angivne mus ved forskellige fortyndinger og bundne primære antistoffer blev påvist med et PE-konjugeret anti-muse-antistof. (B, C) Tre C57BL /6 mus blev hver injiceret subkutant tre gange med ugentlige intervaller med 1 × 106 mGC8 celler dræbt af to fryse-tø cykler. To uger efter den sidste vaccination, blev musene udfordret ved injektion med 1 x 106 (B) og 3 x 106 (C) levende mGC8 celler, henholdsvis (udfyldte cirkler). Som kontrol blev tumorceller injiceret i ikke-immuniserede mus (åbne cirkler). Tumorvolumener blev beregnet som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Resultaterne er vist som middelværdier +/- SD.
Diskussion
Det vigtigste mål for den foreliggende undersøgelse var at etablere en terapeutisk model af mavekræft i immunkompetente mus, der ville give en dyremodel til at evaluere anti-tumor immunitet og immunterapeutiske strategier.

• Primær gastrisk non-Hodgkins lymfom i kinesiske patienter: kliniske karakteristika og prognostisk factors
• GASTRICHIP: D2 resektion og hypertermisk intraperitoneal kemoterapi i lokalt fremskreden gastrisk karcinom: et randomiseret og multicenter fase III-study