La caractérisation des lignées cellulaires d'adénocarcinome gastrique établies à partir de /T de SV40 souris antigène transgénique CEA424 avec ou sans CEAtransgene

caractérisation humain de lignées cellulaires d'adénocarcinome gastrique établie à partir de l'antigène CEA424 /T de SV40
souris -transgenic avec ou sans CEA
humain transgène
carcinome gastrique de résumé de l'arrière-plan est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde entier. Les patients atteints de cancer de l'estomac à un stade avancé de la maladie ont un mauvais pronostic, en raison de l'efficacité limitée des traitements disponibles. Par conséquent, le développement de nouvelles thérapies, comme l'immunothérapie pour le traitement du cancer gastrique est de la plus haute importance. Étant donné que la facilité d'utilisation de modèles précliniques existantes pour l'évaluation des immunothérapies pour les adénocarcinomes gastriques est limité, l'objectif de la présente étude était d'établir murins in vivo
modèles qui permettent l'amélioration progressive des immunothérapies pour le cancer gastrique.
Méthodes
Comme aucune lignée de cellules d'adénocarcinome gastrique murins sont disponibles, nous avons établi quatre lignées cellulaires (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) de développer des tumeurs spontanément de l'antigène CEA424 /T de SV40 souris (CEA424 /Tag) et trois lignées cellulaires dérivées de la double-transgénique descendants de souris CEA424 /Tag accouplées avec l'antigène carcinoembryonnaire humain (CEA) des souris -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) (MGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag est une souche de souris transgénique C57BL /6 hébergeant le marqueur sous le contrôle d'un promoteur -424 pb du CEA /-8 gène qui conduit à la mise au point d'adénocarcinome invasif dans l'estomac glandulaire. des lignées de cellules tumorales établies à partir de souris CEA424 /Tag-CEA Résultats de exprimer le bien défini antigène tumoral CEA sous le contrôle de ses naturelles de régulation des éléments.
L'origine épithéliale des cellules tumorales a été prouvé par des critères morphologiques, y compris la présence de mucine dans les cellules et l'expression des molécules d'adhérence cellulaire EpCAM et CEACAM1. Toutes les lignées cellulaires expriment toujours la transgènes CEA et /ou des balises et des molécules du CMH de classe I qui conduit à leur sensibilité à la lyse par les CTL spécifiques de Tag in vitro
. En dépit de la présentation des CTL epitopes dérivés des produits transgéniques des lignées de cellules tumorales ont été tumorigène lorsqu'ils sont greffés sur des souris C57BL /6, CEA424 /Tag ou CEA424 hôtes /Tag-CEA transgéniques et aucune différence significative dans la tumeur prennent et la croissance tumorale ont été observées chez les différents hôtes. Bien qu'aucun rejet de tumeur spontanée a été observé, la vaccination des souris C57BL /6 avec des lysats de lignées cellulaires de carcinome gastrique protégées C57BL /6 de la provocation tumorale, ce qui démontre la tumorigénicité des lignées de cellules tumorales chez des souris non transgéniques de la H-2 b haplotype.
Conclusion
Ces lignées cellulaires de tumeurs greffées chez différents hôtes syngéniques devraient se révéler très utile pour optimiser les schémas d'immunothérapie pour être finalement testés dans des animaux transgéniques en développement carcinomes gastriques primaires.
Contexte
cancer gastrique est le second à l'échelle mondiale contre le cancer le plus commun [1]. Il est souvent non détectée jusqu'à un stade avancé; par conséquent, les taux de survie à 5 ans sont faibles (10 à 20%). En raison de l'invasion locale et les métastases, la radiothérapie ou la chimiothérapie ne pas augmenter de manière significative la durée et la qualité de vie des patients atteints d'un cancer gastrique avancé. Par conséquent, le développement de nouvelles modalités de traitement néoadjuvant et adjuvants sont nécessaires. Immunothérapie pourrait être une option alternative prometteuse. Un certain nombre d'approches d'immunothérapie, comme le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de la tumeur, et la vaccination en utilisant soit des antigènes tumoraux définis dérivés de lysats tumoraux et lignées de cellules tumorales ou d'antigènes tumoraux définis couramment présentés par les cellules dendritiques sont évaluées pour différents cancers [2, 3] . Pour les cancers gastriques, l'immunothérapie n'a pas été sérieusement pris en considération en raison de l'idée que le cancer gastrique est faiblement immunogène. Par conséquent, seul un petit nombre d'essais d'immunothérapie clinique ont été rapportés [4-7]. En outre, seul un nombre limité d'antigènes associés aux tumeurs avec une utilisation potentielle pour l'immunothérapie ont été identifiés [8-11]. Par conséquent, la capacité du système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cancers gastriques est largement inconnue. Pour mieux comprendre l'efficacité de diverses immunothérapies pour le traitement du cancer gastrique et d'élucider le mécanisme sous-jacent des réponses immunitaires induites modèles animaux de adénocarcinome gastrique sont indispensables.
A cette fin, plusieurs groupes, y compris la nôtre ont récemment créé transgénique ou frapper -out souches de souris qui développent des adénomes ou des adénocarcinomes gastriques dans diverses parties de l'estomac après différents temps d'attente [12]. Nous avons développé un carcinome gastrique transgénique C57BL /6 souris modèle basé sur un grand antigène T de SV40 (SV40 Tag) transgène commandé par un antigène carcinoembryonnaire humain (CEA), le promoteur du gène (-424 à -8 du site d'initiation de la traduction) [13 ]. Dans 100% des animaux, la formation crypte dysplasique dans la muqueuse de l'estomac est observée dans la région pylorique de souris Tag transgénique ancienne CEA424 /SV40 déjà en 30 jours. Dysplasies progresse vers cancers invasifs et par jour 50 l'ensemble de la muqueuse gastrique du pylore a été remplacé par des cellules de carcinome. Entre l'âge de 90 à 110 jours, les souris transgéniques deviennent moribonds et meurent probablement de la malnutrition due à l'obstruction du pylore [13]. Le contrôle de l'expression de Tag par un promoteur minimal du gène CEA permet l'expression de la tumeur dirigée du CEA en traversant /SV40 souris Tag transgénique CEA424 avec le CEA humain
-transgenic C57BL /6, qui expriment le transgène CEA dans un même spatiotemporelle motif d'expression que l'on trouve chez les humains [13, 14]. Le CEA de marqueur tumoral humain est exprimé dans de nombreux adénocarcinomes humains, y compris plus de 50% des cancers gastriques [15, 16]. Le CEA est de plus en plus utilisé comme antigène cible pour une variété d'approches d'immunothérapie tumorale à médiation cellulaire anticorps-et-[17-19]. CEA et Tag sont appropriés antigènes cibles d'immunothérapie depuis un certain nombre d'épitopes de cellules T de ces antigènes ont été identifiés dans C57BL /6 [20-22]. Bien que ces souches de souris transgéniques reflètent le développement de l'adénocarcinome gastrique très près chez les humains, l'expérimentation de ces souris est relativement longue et coûteuse en raison des difficultés pour déterminer la croissance tumorale et l'exigence de l'élevage des souris transgéniques. Par conséquent, il est souhaitable de disposer d'un système de tumeur transplantable syngéniques des adénocarcinomes gastriques chez les souris immunocompétentes pour l'optimisation d'un protocole d'immunothérapie donnée avant qu'elle ne soit évaluée chez les souris transgéniques. Nous décrivons ici les lignées de cellules d'adénocarcinome gastrique murins établies à partir de tumeurs en développement spontanément de souris Tag transgénique SV40 qui sont tumorigènes à la fois de type sauvage syngéniques et des souris transgéniques.
Méthodes
souches de souris et des lignées cellulaires
CEA424 /Tag- souris transgéniques (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), les souris CEA-transgénique (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) et F1 souris à partir d'un croisement entre souris CEA424 /Tag-transgénique et le CEA-transgénique ont été décrits précédemment [13, 14]. Pendant ce temps, les lignées transgéniques ont été rétrocroisées de souris C57BL /6 (H-2 b) pendant plus de 15 générations. Les lignées transgéniques ainsi que C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Allemagne) ont été élevés et maintenus dans des conditions exemptes d'agents pathogènes standards dans l'animalerie de l'Institut de recherche en chirurgie, Ludwig-Maximilians-Université de Munich. Les expériences sur les animaux ont été effectuées après l'approbation par le comité de bien-être animal local. Tumorigène et Immunogénicité des souris ont été utilisées à l'âge de 8-12 semaines. lignée cellulaire Cos7L singe vert africain du rein a été obtenu à partir de la American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Le BALB /c dérivé fibrosarcome Meth-A a été aimablement fourni par W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hambourg). des cellules Meth-A-CEA ont été obtenues par transfection de cellules Meth-A avec les plasmides d'expression pRc /CMV-CEA en utilisant le réactif FuGENE ™ 6 de transfection (Roche Molecular Biochemicals, Suisse) selon les instructions du fabricant. transfectants Meth-A-CTAG et RBL5 /T ont été décrites précédemment [23] de. L'établissement de lignées de cellules de carcinome gastrique
Les carcinomes gastriques utilisés pour établir des lignées cellulaires tumorales ont été obtenues à partir de 8 souris différentes, dont 13 semaines d'âge. Quatre dérivé de souris /Tag transgénique CEA424 et 4 de /TAG-CEA-doubles souris transgéniques CEA424. Les noms des lignées cellulaires dérivées de celle-ci souris sont marquées par l'indice supérieur «CEA». Toutes les cultures ont été réalisées dans du RPMI1640 additionné de inactivé sérum de veau foetal 10% de la chaleur (FCS "Gold", PAA Laboratories, Coelbe, Allemagne), 2 mM de L-glutamine, 100 U /ml de pénicilline, 100 pg /ml de streptomycine, non essentiel des acides aminés et du pyruvate de sodium 1 mM (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne), en outre appelé milieu de la tumeur (TM). les tissus tumoraux ont été abondamment lavées dans un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté avec 200 ug /ml de gentamicine et 2,5 pg /amphotéricine ml B (Gibco /Invitrogen) coupé en 1 mm 3 pièces avec un scalpel et plaquées dans une culture tissulaire flacons contenant TM. Le milieu de culture a été changé tous les 3-4 jours. les cellules épithéliales et les fibroblastes de culture de fragments de tissus ont été séparés par grattage des cellules, trypsinisation sélective et sélective avec des passages 1,000 U /ml de collagénase et de 500 U /ml de hyaluronidase (Biochrom, Berlin, Allemagne). Au cours de la dissociation, les flacons ont été contrôlés sous un microscope inversé et la digestion a été arrêtée lorsque les fibroblastes, mais pas les cellules épithéliales ont été détachés (trypsine) ou vice-versa (collagénase /hyaluronidase). Cette procédure a été répétée toutes les semaines jusqu'à ce que les fibroblastes ont été éliminés des cultures de cellules tumorales. Lors de la génération de la lignée cellulaire 424GC, une culture de fibroblastes a été établie à partir de fibroblastes contaminants (424 fibroblastes). Spheroids formés dans les 5-7 jours après le semis, 0,5 x 10 3 mGC8 cellules dans la gélose Noble (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne) revêtu de plaques à 96 puits (TPP-Biochrom, Berlin, Allemagne) dans 200 pi TM qui a été remplacé par un milieu frais tous les deux jours. Pour évaluer la viabilité des cellules sur la surface des sphéroïdes, des sphéroïdes ont été incubées avec du FITC-annexine V marquée (kit de détection de l'apoptose Annexine V FITC; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Allemagne) pour la détection de cellules apoptotiques ou de l'iodure de propidium pour identifier nécrotique les cellules selon les recommandations du fabricant.
cytométrie de flux
analyses pour les cellules de coloration de surface ont été trypsinisées, lavées avec du PBS et mises en suspension dans du PBS /0,5% p /v de sérum-albumine bovine (BSA) additionné de 0,02% p /v de sodium azide. Pour l'induction des molécules du CMH, les cellules ont été incubées avec 20 ng /ml d'interféron-γ (IFN-y; Peprotec, Londres, Royaume-Uni) pendant 24 heures avant la récolte. La liaison non spécifique des anticorps dirigés contre les récepteurs Fc a été bloquée par préincubation des cellules avec 1 ug /10 6 cellules CD16 anti-/anticorps monoclonal CD32 (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Allemagne) pendant 15 min . Ensuite, les cellules ont été mises en incubation avec 0,5 ug /10 6 cellules de l'anticorps monoclonal d'intérêt pendant 30 min à 4 ° C, lavées deux fois, et le cas échéant, par la suite mis à réagir avec un anticorps de deuxième étape pendant 15 min à 4 ° C . Les cellules ont été lavées deux fois et analysées en utilisant un FACScan (BD, Mountain View, CA). Les cellules mortes ont été exclues par coloration à l'iodure de propidium. Les réactifs et les mAb dirigés contre les antigènes suivants murins de BD Pharmingen ont été utilisées: la phycoérythrine (PE) IgG de souris conjugué à 2a anti IA b, souris IgG biotinylé 2a anti-H-2D b une souris IgG conjugué à PE 2aanti-H-2K b, PE-anti-souris conjugué CD80 /B7-1, de rat conjugué à PE IgG 2a anti- CD40 de souris, de rat conjugué à PE IgG 2a anti-souris CD86 /B7-2, isothiocyanate de fluorescéine (FITC), hamster arménien IgG 2 anti-souris CD80 /B7-1. rat FITC conjugué IgG 1 mAb R3-34, PE-conjugué IgG de rat 1 mAb R3-34, souris PE-conjugué IgG 2a SIRP anti-rat, conjugué au FITC hamster arménien IgG 2anti-KLH et PE-conjugué IgG de rat 2amAb ont servi de contrôles isotypiques. Souris anti-souris CEACAM1 mAb CC1, rat anti-souris CEACAM1 AgB10 [24] et de rat anti-souris E-cadhérine et anti-souris EpCAM mAb étaient une sorte don de K. Holmes, Université du Colorado, BB Chanteur, Charité Berlin, et P. Ruf, Trion Research, Munich, respectivement. La souris réaction croisée anti-humaine mAb CEACAM 03/04/17 (spécifique pour le CEA humain /CEACAM5 chez la souris) ont été achetés auprès GENOVAC (Freiburg, Allemagne). Les anticorps murins ont été détectés avec de chèvre conjugué à PE IgG anti-souris, des anticorps de rat avec des cellules de carcinome gastrique âne conjugué à FITC anti-rat IgG Détection de (DAKO). CEA et du SV40 Tag par Western Blot
croissance exponentielle , les cellules Cos7L, transfectants Cos7L-CEA, des cellules Meth-a et transfectants Meth-a-CTAG qui expriment un cytoplasme situé Tag SV40 tronqué ont été récoltées par trypsinisation. Les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS et lysées à une densité de 10 6 cellules /ml dans un tampon de lyse. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant le kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Des extraits cellulaires correspondant à 10 ug de protéine ont été séparés par électrophorèse à travers des gels à 10% de SDS Polyacrylamide (Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne), transférés sur des membranes de fluorure polyvinyliden et incubées avec CEACAM 10 pg /ml de mAb anti-humain ou une 03/04/17 1: 100 hamster dilué anti-SV40 Tag antisérum (une sorte cadeau par K.-H. Scheidtmann, Université de Bonn). Les anticorps liés ont été amenés à réagir avec des anticorps secondaires marqués à la peroxydase raifort et visualisés en utilisant un système de détection basé sur la chimioluminescence. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Allemagne)
cellulaire détermination du temps de doublement
In vitro
le temps de doublement des lignées cellulaires ont été déterminées en ensemençant les cellules de carcinome gastrique dans des plaques à 24 puits en MTR au nombre de cellules de départ indiquée et le comptage des échantillons de cellules provenant de puits en trois exemplaires après trypsinisation douce tous les 3 jours pendant 21 jours. In vivo
temps de doublement a été calculé à partir des mesures du volume de la tumeur (voir ci-dessous) après l'inoculation avec trois le nombre de cellules de départ différentes (trois souris par groupe). Les temps de doublement a été calculé à partir de la phase logarithmique de la courbe de croissance.
tumorigénicité et l'immunogénicité de la cellule lignées
pour les cellules tumorales d'évaluation de la tumorigénicité ont été lavées trois fois dans du PBS et 50 ul de suspension de cellules avec des nombres de cellules indiquées ont été injectées sous-cutanée dans le flanc droit rasé des souris. Pour déterminer l'immunogénicité, 10 7 cellules tumorales /ml ont été lysées par deux cycles de gel et de dégel consécutifs. Les souris ont été immunisées quatre fois à des intervalles hebdomadaires avec 10 6 cellules tumorales lysées dans le flanc droit. Trois semaines plus tard, les souris ont été provoquées par injection sous-cutanée de 3 x 10 6 cellules tumorales viables dans le flanc gauche. Les groupes expérimentaux étaient composés de 4-6 souris. le développement de la tumeur a été suivie par des mesures en série de la taille de la tumeur et le volume tumoral a été calculé selon l'équation: Volume de la tumeur (mm 3) = d 2 × D /2, où d et D ont la plus courte et le diamètre le plus long de la tumeur, respectivement. Les animaux ont été euthanasiés quand les tumeurs ont atteint un volume de 300 mm 3.
Génération de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques à des balises (CTL) et de la stimulation par les CTL des lignées cellulaires de carcinome gastrique ont été générées comme décrit précédemment [23] . En bref, les souris ont été intradermique inoculé avec 1 um de particules d'or revêtues d'un plasmide d'expression de Tag (BMG /TC-Ag.1 [23]) dans la peau abdominale rasée en utilisant une pression d'hélium (200 psi) dispositif biolistique (pistolet à gènes Helios alimenté; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Allemagne). Les cellules spléniques obtenues 14 jours après la vaccination ont été restimulées toutes les semaines avec RBL5 irradié T /transfectants dans du RPMI-1640 /FCS à 10% supplémenté avec 30 UI /ml d'IL-2. RBL5 /T est une ligne de Rauscher transformées par le virus du lymphome T-cellulaire dérivée d'une souris C57BL6 (H-2b) de la souris transfectées avec un plasmide d'expression de SV40 Tag. Pour générer des CTL, des cellules de rate prises 10 jours après la vaccination spécifique à l'épitope ont été restimulées in vitro avec des cellules RBL5 peptides pulsée irradiée, Tag. T1, T2 /T4 et 3 épitope de la spécificité des CTL a été contrôlée par détermination de la teneur IFNy lors d'une stimulation de support avec des cellules cibles puisées avec le peptide en utilisant un ELISA.
Détection de cytokines par ELISA
pour la capture et la détection d'IFN-y dans les surnageants par ELISA en sandwich classique, nous avons utilisé mAb R4-6A2 et biotinylé mAb XMG1.2, respectivement (BD Pharmingen). Extinction a été analysée à 405/490 nm sur un TECAN lecteur microplaque ELISA (TECAN Crailsheim, Allemagne) avec le logiciel easywin (TECAN). La limite de détection du test ELISA pour IFNy était de 20 pg /ml Establishment de. Résultats et phénotype du carcinome gastrique lignées cellulaires
A partir d'échantillons de carcinome 8 gastriques 7 lignées cellulaires pourraient être établies. Quatre lignées cellulaires ont été dérivées de CEA424 /Tag-souris transgéniques (424GC, d'une souris mâle; mGC3, femelle; mGC5, mâle et mGC8, femelle) et trois lignes de souris CEA424 /Tag-CEA-transgénique (MGC2 CEA, mâle; mGC4 CEA, mâle; mGC11 CEA, femelle). Le temps nécessaire pour obtenir des cultures de cellules épithéliales pures variait considérablement (moyenne 6 mois, extrêmes 3-16 mois). Bien que les cellules tumorales se développent en tant que cellules adhérentes de la culture, ils ont tendance à former des agrégats, plutôt que d'étalement sur le substrat de culture (Fig. 1A). L'origine épithéliale de cellules tumorales a été démontrée par des critères morphologiques, y compris la présence de mucine dans les cellules (Fig. 1A) et l'analyse de l'expression de la protéine habituellement exprimée dans les cellules épithéliales (EpCAM, E-cadhérine, CEACAM1) (Fig. 2A) . Une teneur réduite mucine a été trouvée dans toutes les lignées cellulaires par rapport à la teneur en cellules épithéliales gastriques normales, mais similaire à celle trouvée dans les cellules tumorales au sein du carcinome gastrique chez des souris transgéniques (fig. 1A et [13]). Toutes les lignées cellulaires affichées CEACAM1 et EpCAM sur leur surface sauf mGC11 CEA, aucun d'entre eux a exprimé la E-cadhérine (Fig. 2A et données non présentées). Toutes les lignées cellulaires expriment le CMH de classe I H-2Kb, et, et à un niveau beaucoup plus bas, les molécules H-2D (Fig. 2B). L'expression des deux protéines a été fortement renforcée par l'IFNy stimulation. Aucune expression des molécules du CMH de classe II (I-Ab) a été détectée (Fig. 2B et données non présentées). CD54, CD80, CD86 ou CD95 ne sont pas détectés sur une lignée cellulaire (données non présentées). La figure 1 Morphologie des lignées cellulaires de carcinome gastrique cultivées sous forme de cultures en monocouche ou en trois dimensions sphéroïdes. (A) Les lignées de cellules montrent une morphologie epitheliale légèrement différente. La plupart des cellules de toutes les lignées cellulaires contiennent une vacuole intracellulaire caractéristique (flèches) qui contient probablement matériau mucinous coloré en rouge par la méthode du PAS (dernière image de droite dans le panneau inférieur). (B) sphéroïde formé par des cellules tumorales en culture sur gélose molle mGC8: à gauche, le contraste de phase; à droite, la fluorescence coloration des cellules nécrotiques avec l'iodure de propidium (rouge) et les cellules apoptotiques avec FITC AnnexinV (vert, marqués par des flèches), comme décrit dans "Matériel et méthodes". Grossissement: barres correspondent à 10 um. MGC, carcinome gastrique murine.
Figure 2 Cellule expression de surface de marqueurs épithéliaux (A) et du CMH de classe I et II molécules (B). des lignées cellulaires de carcinome gastrique ont été mis à réagir soit avec marqué PE (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) ou avec des mAb non marqués (CEACAM1, E-cadhérine, EpCAM), suivie d'une incubation avec du PE-anticorps anti-IgG de souris ou FITC IgG anti-rat marqué au et analysées par cytométrie en flux. Les histogrammes affichent les résultats obtenus avec des anticorps contre les antigènes pertinents avec (gris ouvert) ou sans (ouvert noir) avant la stimulation IFNy et des antigènes non pertinents (gris courbes pleines).
Afin de déterminer le potentiel des lignées de cellules à utiliser pour la génération de modèles de tumeurs tridimensionnelles nous avons analysé des cellules tumorales in vitro, la formation sphéroïde. Comme cela est illustré sur la Fig. 1B lignées cellulaires formées sphéroïdes de cellules tumorales compact après 8 jours de culture, lorsque les cellules 103 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits revêtues d'agar-mous. Mineures variation intra-expérimental a été observée en ce qui concerne la taille des sphéroïdes. La coloration avec de l'iodure de propidium et FITC-annexine V marquée ont montré qu'au moins la couche superficielle des sphéroïdes est composée de cellules viables avec très peu de cellules mortes qui lui sont attachées (Fig. 1B). L'expression
Transgene par les lignées cellulaires de carcinome gastrique
CEA et Tag peuvent servir d'antigènes spécifiques de tumeurs (TSA) ou des antigènes associés aux tumeurs (TAA) après la transplantation des lignées de cellules tumorales nouvellement créées dans C57BL immunocompétent syngénique /6 et CEA- ou souris Tag-transgénique, respectivement. Même si un rôle déterminant dans la formation des tumeurs, l'expression du transgène étiquette ne sont pas toujours trouvées dans les lignées de cellules tumorales dérivées de souris transgéniques Tag, comme dans TRAMP lignées de cellules tumorales [25]. Ceci nous a conduit à analyser l'expression et CMH de classe I restreint présentation du transgène de balise ainsi que l'expression du CEA dans les lignées cellulaires de carcinome gastrique établies. CEA expression de la surface cellulaire a été analysé dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs gastriques des souris transgéniques doubles par cytométrie en flux et l'analyse par transfert de Western. Tandis que l'expression du transgène du CEA est régulé par la région promotrice complète du gène CEA humain de l'expression de la variable est commandée par un minimum de -424 /-8 pb promoteur du CEA (Fig. 3A). Toutes les trois lignées cellulaires double transgéniques expriment le CEA sur la surface des cellules (Fig. 3B). Dans la lignée de cellules de carcinome gastrique MGC2 CEA transgène exprimé CEA a présenté un poids moléculaire de 180 kDa similaire à celle trouvée dans les cellules de singe vert rein transformées par SV40 africains transfectées de façon stable avec un vecteur d'expression de CEA et de CEA chez les humains. Comme prévu, aucun CEA a été détectée dans les cellules 424GC, qui ont été établies à partir d'un Tag-souris transgénique CEA-négatif (Fig. 3C). Tag a été trouvé être exprimé par Western blot et une analyse par immunofluorescence dans toutes les lignées cellulaires dérivées de souris simples et doubles transgéniques (fig. 3D et les données non représentées). Cette constatation confirme également l'origine des lignées cellulaires de carcinomes de l'estomac. En outre, la lignée cellulaire présente 424GC efficacement des peptides de balises dérivé traitées de manière endogène, en particulier l'épitope T1, dans un CMH-I restreinte de manière telle que déterminée par l'induction de la sécrétion d'IFNy spécifique à byTag CTL (Fig. 4A). En outre, les lignées cellulaires ont été efficacement tuées par les CTL spécifiques à l'étiquette dans des essais cytotoxiques (Fig. 4B). Figure 3: Expression de l'ACE et Tag par des lignées cellulaires de carcinome gastrique dérivées de CEA424 /ou Tag- CEA424 /Tag × souris transgéniques CEA. (A) Structure du CEA et CEA424 transgènes /Tag. Les exons 1-10 du gène CEA humain contenu dans l'insert du cosmide clone cosCEA1 [14] sont présentés comme un code couleur des boîtes (bleu clair, leader, rouge, domaine IgV-like, le bleu domaine IgC-like, gris, domaine transmembranaire;.. blanc, 5 'et les exons de la région 3' non traduites en séquences flanquantes du vecteur sont indiquées comme des boîtes noires l'emplacement du CEA minimal promoteur présent dans le SV40 gène Tag transgène est indiquée par des traits pointillés, les noms des lignées transgéniques sont présentés dans la marge de gauche (B). la cytométrie en flux a été réalisée par marquage des cellules indiquées soit avec l'anticorps monoclonal spécifique du CEA 26/3/13 (courbes pleines) ou un anticorps de même isotype (courbes ouvertes) suivie d'une chèvre marqué PE des anticorps IgG anti-souris. (C, D) Pour une analyse Western, 10 ug de protéine totale à partir d'extraits de cellules 424GC ou mGC8 établies à partir de CEA424 /souris Tag-transgéniques et des cellules mGC2CEA et mGC4CEA de CEA424 /Tag × souris CEA-transgénique étaient taille séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, transférés sur une membrane et on fait réagir avec l'anticorps monoclonal spécifique du CEA 26/3/13 (C) ou de hamster anticorps polyclonaux anti-marqueur (D). Extraits de Cos7L-CEA et des cellules Meth-A transfectées de façon stable avec des vecteurs d'expression codant pour le CEA ou une marque dépourvue d'une région avec le signal de localisation nucléaire (CTAG) a servi de contrôle positif. Les tailles des marqueurs protéiques sont indiqués dans la marge de gauche.
Figure 4 présentation du CMH de classe I restreint d'épitopes de balise par des lignées cellulaires de carcinome gastrique murins. (A) Epitope CTL spécifiques générés chez des souris C57BL /6 souris par immunisation d'ADN avec un vecteur d'expression d'étiquette et de l'expansion subséquente par une stimulation in vitro avec des cellules RBL5 chargés de peptides Tag ont été incubées avec 424GC irradié, 424 fibroblastes, RBL5 Tag et T1, T2 3 /T4 ou des cellules RBL5 puisées avec le peptide pendant 24 h et de leur sécrétion de IFN-y dans le milieu de culture a été déterminée par ELISA. Sécrétion d'IFNy par CTL stimulées avec des cellules 424GC indique que ces cellules présentent des peptides SV40Tag spécifiques d'une manière MHCI restreinte. (B) coculture de 424GC et 424 fibroblastes ont été traités avec CTL 107 Tag-spécifique dans une boîte de Pétri pendant 48 h. Par la suite, (mort) des cellules non-adhérentes ont été retirées. Gauche, coculture avant le traitement CTL; droite, coculture après le traitement. Les flèches indiquent la position des cellules tumorales avant l'addition de LTC
tumorigénicité des lignées cellulaires de carcinome gastrique
Pour déterminer la tumorigénicité des lignées cellulaires différents nombres (1 x 10 5;. 3 × 10 5, 1 x 10 6) des cellules ont été injectées par voie sous-cutanée dans la souris C57BL /6. Toutes les lignées cellulaires ont été capables de former des tumeurs chez 100% des animaux, si au moins 3 × 10 5 cellules tumorales ont été injectées (Fig. 5A). Les tumeurs ont augmenté de près de façon exponentielle sans délai jusqu'à ce qu'ils atteignent un volume de 300 mm 3. Pas de métastases à distance ont pu être détectés au cours de la période d'observation. Analyse par Western blot réalisée sur les tumeurs greffées a démontré que les deux transgènes sont exprimés par les lignées cellulaires in vivo
(données non présentées). Les temps de doublement des cellules tumorales in vivo
à une charge de tumeur à partir de 10 6 cellules variait entre 7.2 (mGC8) et 13,8 jours (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
, toutes les lignées cellulaires présentaient des temps de doublement similaires d'environ 3 jours (Fig. 5B). En outre, nous avons comparé la formation de tumeur sous-cutanée des lignées cellulaires en sauvage (C57BL /6) et des souris transgéniques. Aucune différence significative n'a été observée dans la prise de la tumeur et la croissance tumorale pour la 424GC lignée cellulaire lorsqu'il est injecté sous-cutanée dans de type sauvage ou CEA424 /souris Tag-transgénique (Fig. 6A) et pour mGC11 cellules du CEA après l'injection dans de type sauvage et CEA424 /Tag-CEA-souris transgéniques (Fig. 6B). La figure 5 in vivo (A) et des caractéristiques de croissance in vitro (B) de lignées cellulaires de cancer de l'estomac de souris. Trois souris chacun ont reçu une injection avec les doses de cellules tumorales indiquées. La croissance tumorale a été mesurée par deux mesures perpendiculaires du diamètre de la tumeur et le calcul du volume tel que décrit dans la section Matériels et Méthodes. Pour déterminer les caractéristiques de croissance in vitro, les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits, en commençant par le nombre de cellules indiqués. A différents points dans le temps des cellules provenant de puits en trois exemplaires ont été récoltées et comptées. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne +/- écart-type (SD). courbes mieux ajustées, ainsi que des temps de doublement en jours (indiqués entre parenthèses) ont été calculées en utilisant le logiciel GraphPad.
Figure 6 Croissance des lignées de cellules de carcinome gastrique dans de type sauvage et des souris transgéniques. 3 x 105 cellules 424GC ont été injectées par voie sous-cutanée dans C57BL /6 et CEA424 /Tag-souris transgéniques (A) ou 3 x 105 cellules mGC11CEA ont été injectées dans C57BL /6 et CEA424 /Tag × souris transgéniques CEA-double (B). La croissance tumorale a été mesurée par deux mesures perpendiculaires du diamètre de la tumeur et le calcul du volume tel que décrit dans la section Matériels et Méthodes. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne +/- écart type (n = 3) Immunogénicité de. Du carcinome gastrique lignées cellulaires
La croissance similaire des lignées de cellules tumorales dans le type sauvage et des souris transgéniques indique qu'aucune réponse immunitaire significative à l'antigène soit de la tumeur (Tag, CEA) se sont produits chez des souris porteuses de tumeurs. En effet, aucun CTL spécifique de Tag n'a pu être identifié dans la rate des souris porteuses de tumeurs de type sauvage sur la croissance sous-cutanée progressive des cellules de carcinome gastrique Tag exprimant (données non présentées). Cependant, lorsque des lignées cellulaires doubles transgéniques ont augmenté chez les souris, des anticorps spécifiques de CEA ont pu être identifiées dans des souris C57BL /6 de type sauvage mais non chez les souris transgéniques CEA (Fig. 7A). En outre, trois immunisations de souris C57BL /6 avec 106 cellules tumorales mGC8 gel-dégel à des intervalles hebdomadaires soit empêché la croissance de la injection sous-cutanée des cellules mGC8 vivantes complètement ou croissance tumorale a été retardée pendant près de trois semaines en fonction de la dose de cellules tumorales injectées (Fig. 7B , C). Ces expériences démontrent que les lignées de cellules tumorales sont immunogènes sous certaines conditions. Cependant, les souris C57BL /6 spontanément ne montent pas une tumeur efficace de progression limitant la réponse immunitaire à un antigène tumoral, soit au cours de la croissance tumorale sous-cutanée. Figure 7 Immunogénicité des cellules MGC. des anticorps (A) anti-CEA ont été déterminés dans le sérum des souris C57BL /6 transgéniques et le CEA en utilisant la cytométrie de flux. Toutes les souris ont progressivement croissante sans nécrose des tumeurs manifeste après la transplantation et la croissance des lignées cellulaires indiquées pendant 35-40 jours. mGC4CEA cellules ont été incubées avec le sérum des souris indiquées à différentes dilutions et les anticorps primaires liés ont été détectés avec un anticorps anti-souris conjugué à PE. (B, C) Trois C57BL /6 souris chacun ont été injectés par voie sous-cutanée trois fois à des intervalles hebdomadaires avec 1 × 106 mGC8 cellules tuées par deux cycles de gel-dégel. Deux semaines après la dernière vaccination, les souris ont été provoquées par injection avec 1 x 106 (B) et 3 × 106 (C) cellules vivantes mGC8, respectivement (remplis dans les cercles). En tant que témoin, les cellules tumorales ont été injectées chez des souris non immunisées (cercles ouverts). Les volumes des tumeurs ont été calculés comme décrit dans la section Matériel et méthodes. Rapport de résultats sont présentés sous forme de valeurs moyennes +/- SD.
Le principal objectif de la présente étude était d'établir un modèle thérapeutique du cancer gastrique chez des souris immunocompétentes qui fournirait un modèle animal pour évaluer l'immunité anti-tumorale et stratégies immunothérapeutiques.

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