Caracterización de las líneas celulares de adenocarcinoma gástrico establecidos desde /SV40 T antígeno ratones transgénicos CEA424 con o sin un CEAtransgene humano

Caracterización de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico establecidas a partir de antígeno T /SV40 CEA424
ratones -transgenic con o sin un
CEA transgén
humano abstracto
Antecedentes
carcinoma gástrico es uno de los cánceres más frecuentes en todo el mundo . Los pacientes con cáncer gástrico en una fase enfermedad avanzada tienen un mal pronóstico, debido a la limitada eficacia de las terapias disponibles. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas terapias, como inmunoterapia para el tratamiento del cáncer gástrico es de suma importancia. Dado que la capacidad de uso de los modelos preclínicos existentes para la evaluación de inmunoterapias para adenocarcinomas gástricos es limitado, el objetivo del presente estudio fue establecer murinos in vivo y modelos que permiten la mejora gradual de inmunoterapias para el cáncer gástrico.
Métodos
Como no hay líneas celulares de adenocarcinoma gástrico murinas están disponibles establecimos cuatro líneas celulares (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) de los tumores en desarrollo de forma espontánea de antígeno CEA424 /T de SV40 ratones (CEA424 /Tag) y tres líneas celulares derivadas de doble transgénico crías de ratones CEA424 /Tag aparearon con el antígeno carcinoembrionario humano (CEA) (CEA424 /Tag-CEA) ratones -transgenic (mgc2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag es un C57BL /6 cepa de ratón transgénico que alberga la etiqueta bajo el control de un promotor del gen CEA pb -424 /-8 que conduce al desarrollo de adenocarcinoma invasivo en el estómago glandular. líneas celulares de tumores establecidos a partir de ratones CEA424 /Tag-CEA expresar el antígeno tumoral CEA bien definido bajo el control de sus elementos reguladores naturales.
Resultados
El origen epitelial de las células tumorales siendo en ambos casos por criterios morfológicos incluyendo la presencia de mucina dentro de las células y la expresión de la adhesión celular moléculas de EpCAM y CEACAM1. Todas las líneas celulares expresan consistentemente el CEA transgenes y /o Tag y moléculas MHC de clase I que conduce a su susceptibilidad a la lisis por CTL-Tag específica in vitro
. A pesar de la presentación de CTL epítopos derivados de los productos transgénicos las líneas celulares tumorales fueron tumorigénicas cuando injertado en ratones C57BL /6, CEA424 /Tag o CEA424 hosts /Tag-CEA-transgénicos y no hay diferencias significativas en el tumor toman y el crecimiento tumoral se observaron en los diferentes huéspedes. Aunque no se observó rechazo de tumores espontáneos, la vacunación de ratones C57BL /6 con lisados ​​de líneas celulares de carcinoma gástrico protegidas C57BL /6 ratones de la exposición al tumor, lo que demuestra la tumorigenicidad de las líneas de células tumorales en ratones no transgénicos de la H-2 b haplotipo.
Conclusión
Estas líneas de células tumorales injertadas en diferentes huéspedes singénicos deben llegar a ser muy útil para optimizar los regímenes de inmunoterapia para ser finalmente probados en animales transgénicos en desarrollo carcinomas gástricos primarios.
Antecedentes El cáncer gástrico es
el segundo en todo el mundo el cáncer más común [1]. A menudo no se detecta hasta una fase avanzada; en consecuencia, las tasas de supervivencia a 5 años son bajos (10 a 20%). Debido a la invasión local y la metástasis, la radioterapia o la quimioterapia no aumenta significativamente la duración o la calidad de vida de los pacientes con cáncer gástrico avanzado. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento neoadyuvante y adyuvante. La inmunoterapia podría ser una opción alternativa prometedora. Un número de la inmunoterapia se acerca como transferencia adoptiva de células T específicas de tumor, y la vacunación utilizando ya sea antígenos tumorales definidos derivados de lisados ​​tumorales y líneas de células tumorales o antígenos tumorales definidos comúnmente presentados por las células dendríticas están siendo evaluados para varios tipos de cáncer [2, 3] . Para los cánceres gástricos, la inmunoterapia no fue tomado seriamente en consideración debido al concepto de que el cáncer gástrico es poco inmunogénica. Por lo tanto, se han reportado sólo un pequeño número de ensayos clínicos de inmunoterapia [4-7]. Además, se han identificado sólo un número limitado de antígenos asociados a tumores con uso potencial para la inmunoterapia [8-11]. En consecuencia, la capacidad del sistema inmunitario para reconocer y erradicar el cáncer gástrico es en gran parte desconocida. Para obtener una perspectiva de la eficacia de varias inmunoterapias para el tratamiento de cáncer gástrico y para elucidar el mecanismo subyacente de la respuesta inmune inducida modelos animales de adenocarcinoma gástrico son indispensables.
A este fin, varios grupos incluyendo el nuestro han establecido recientemente transgénicos o knock cepas de ratón salida privado que se desarrollan adenomas gástricos o adenocarcinomas en varias partes del estómago después de diferentes latencias [12]. Hemos desarrollado un carcinoma gástrico transgénicos C57BL /6 modelo de ratón basada en un gran antígeno T de SV40 (Tag de SV40) transgén controlado por un promotor del gen de antígeno carcinoembrionario humano (CEA) (-424--8 del sitio de inicio de la traducción) [13 ]. En 100% de los animales, la formación de criptas displásicas en la mucosa del estómago se observa en la región pilórica viejo CEA424 /SV40 ratones-Tag transgénica que ya están en 30 días. Displasia progresa a carcinomas invasivos y por día 50 toda la mucosa gástrica pilórica ha sido sustituido por las células de carcinoma. Entre las edades de 90 a 110 días los ratones transgénicos que están moribundos y mueren, probablemente, de la desnutrición debido a la obstrucción del píloro [13]. El control de la expresión Tag por un promotor del gen de CEA mínimo permite la expresión dirigida por el tumor de CEA por el cruce CEA424 /SV40 ratones-Tag transgénicos con CEA humano
6 ratones C57BL /-transgenic, que expresan el transgén CEA en un espacio-temporal similares patrón de expresión como se encuentra en los seres humanos [13, 14]. El CEA marcador de tumor humano se expresa en muchos adenocarcinomas humanos incluyendo más de 50% de los carcinomas gástricos [15, 16]. CEA se utiliza cada vez más como antígeno diana para una variedad de enfoques de inmunoterapia tumoral por anticuerpos y mediada por células [17-19]. CEA y la etiqueta son antígenos diana inmunoterapia adecuados, ya que varios de los epítopos de células T de estos antígenos se han identificado en ratones C57BL /6 [20-22]. Aunque estas cepas de ratones transgénicos reflejan el desarrollo de adenocarcinoma gástrico muy de cerca en los seres humanos, la experimentación con estos ratones es relativamente lento y caro debido a las dificultades para determinar el crecimiento del tumor y el requisito de la cría de ratones transgénicos. Por lo tanto, es deseable tener un sistema de tumor transplantable singénico de los adenocarcinomas gástricos en ratones inmunocompetentes para la optimización de un protocolo de inmunoterapia dado antes de que se evalúa en los ratones transgénicos. Aquí describimos líneas celulares de adenocarcinoma gástrico murinos establecidos a partir de los tumores en desarrollo espontáneo de SV40 ratones transgénicos que son Tag tumorigénico en tanto de tipo salvaje y ratones transgénicos singénicos.
Métodos
cepas de ratón y líneas celulares
CEA424 /TAG- Los ratones transgénicos (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), los ratones de CEA transgénico (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) y F1 ratones de un cruce entre ratones CEA424 /Tag-transgénicos y CEA transgénico se han descrito anteriormente [13, 14]. Mientras tanto las líneas transgénicas han sido backcrossed a ratones C57BL /6 (H-2 b) durante más de 15 generaciones. Las líneas transgénicas, así como los ratones C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Alemania) fueron criados y mantenidos en condiciones estándar libres de patógenos en el animalario del Instituto de Investigación Quirúrgica, Ludwig-Maximilians-Universidad de Munich. Los experimentos con animales se realizaron después de la aprobación por el comité local de bienestar de los animales. Para los ensayos de tumorigenicidad e inmunogenicidad se utilizaron ratones a las 8-12 semanas de edad. línea verde africano células de riñón de mono Cos7L se obtuvo de la American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). El /c-derivados de fibrosarcoma Meth-A BALB fue proporcionado amablemente por W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburgo). células Meth-A-CEA se obtuvieron por transfección de células Meth-A con los plásmidos de expresión pRc /CMV-CEA utilizando FuGENE ™ reactivo 6 de transfección (Roche Molecular Biochemicals, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Meth-A-CTAG y RBL5 /T transfectantes fueron descritas anteriormente [23].
Establecimiento de líneas celulares de carcinoma gástrico Francia El carcinomas gástricos utilizados para establecer las líneas de células tumorales se obtuvieron de 8 13 semanas de edad, los ratones, diferentes. Cuatro derivadas de ratones CEA424 /Tag-transgénico y 4 desde /Tag-CEA-ratones transgénicos dobles CEA424. Los nombres de las líneas celulares derivadas de estos últimos ratones están marcados por el superíndice "CEA". Todos los cultivos se realizaron en RPMI1640 suplementado con inactivada suero de ternera fetal 10% de calor (FCS "Gold"; PAA Laboratories, Cölbe, Alemania), 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, no esencial aminoácidos y piruvato de sodio 1 mM (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se hace referencia en adelante como medio tumor (TM). Los tejidos tumorales se lavaron exhaustivamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con 200 mg /ml de gentamicina y 2,5 mg /ml de anfotericina B (GIBCO /Invitrogen), cortado en 1 mm 3 piezas con un bisturí y se colocaron en cultivo de tejidos matraces que contienen TM. El medio de cultivo se cambió cada 3-4 días. Las células epiteliales y fibroblastos que crecen fuera de los fragmentos de tejido se separaron por raspado celular, tripsinización selectiva y pases selectivo con 1000 U de colagenasa /ml y 500 U /ml de hialuronidasa (Biochrom, Berlín, Alemania). Durante la disociación, los matraces se controlaron en un microscopio invertido y la digestión se detuvo cuando los fibroblastos, pero no se separaron las células epiteliales (tripsina) o viceversa (colagenasa /hialuronidasa). Este procedimiento se repitió semanalmente hasta que todos los fibroblastos fueron eliminados de los cultivos de células tumorales. Durante la generación de la línea celular 424GC, un cultivo de fibroblastos se estableció a partir de fibroblastos contaminantes (424 fibroblastos). Esferoides formados dentro de 5-7 días después de la siembra de 0,5 × 10 3 mGC8 células en agar Noble (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) recubiertas con placas de 96 pocillos (TPP-Biochrom, Berlín, Alemania) en 200 l TM cuales fue reemplazado con medio fresco cada dos días. Para evaluar la viabilidad de las células en la superficie de los esferoides, esferoides se incubaron con marcado con FITC anexina V (Kit de detección de apoptosis con anexina V FITC; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Alemania) para la detección de células apoptóticas o con yoduro de propidio para identificar necrótico células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
citometría de flujo
análisis para células de tinción de superficie se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se suspendieron en PBS /0,5% w /v albúmina de suero bovino (BSA) suplementado con 0,02% w /v de sodio azida. Para la inducción de moléculas del MHC, las células se incubaron con 20 ng /ml de interferón-γ (IFN; Peprotec, Londres, Reino Unido) durante 24 horas antes de la cosecha. La unión no específica de los anticuerpos a los receptores Fc fue bloqueada por la preincubación de las células con 1 g /10 6 células de anti-CD16 anticuerpo /CD32 monoclonal (Mab) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania) durante 15 minutos . Posteriormente, las células se incubaron con 0,5 g /10 6 células del mAb de interés durante 30 min a 4 ° C, se lavaron dos veces, y en su caso, hace reaccionar posteriormente con un anticuerpo de segunda etapa durante 15 min a 4 ° C . Las células se lavaron dos veces y se analizaron usando un FACScan (BD, Mountain View, CA). Las células muertas se excluyeron por tinción con yoduro de propidio. Se utilizaron los siguientes reactivos y mAbs contra antígenos murinos de BD Pharmingen: ficoeritrina (PE) conjugado con IgG de ratón 2a anti-IA b, ratón biotinilado IgG 2a anti-H-2D b , ratón IgG conjugado con PE 2aanti-H-2K b, conjugado con PE anti-ratón CD80 /B7-1, rata conjugado con PE IgG 2 bis anti-ratón CD40, conjugado con PE IgG de rata 2a anti-ratón CD86 /B7-2, isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con, hámster armenio IgG 2 anti-ratón CD80 /B7-1. rata conjugado con FITC IgG 1 mAb R3-34, rata conjugado con PE IgG 1 mAb R3-34, ratón IgG conjugado con PE 2 bis SIRP anti-rata, conjugado con FITC IgG de hámster armenio 2anti-KLH y de rata conjugado con PE IgG 2amAb sirvieron como controles de isotipo. Mouse anti-ratón CEACAM1 mAb CC1, rata anti-ratón CEACAM1 AgB10 [24] y de rata anti-ratón de E-cadherina y anti-ratón EpCAM mAb fueron una especie de regalo de K. Holmes, Universidad de Colorado, BB Singer, Charité de Berlín, y P. Ruf, Trion Investigación, Munich, respectivamente. El CEACAM mAb de ratón con reactividad cruzada anti-humana 4.3.17 (específicos para el humano CEA /CEACAM5 en el ratón) fueron adquiridos de GENOVAC (Freiburg, Alemania). anticuerpos murinos se detectaron con anticuerpo de cabra conjugado con PE anti-IgG de ratón, anticuerpos de rata con burro conjugado con FITC anti-rata-IgG
(DAKO). La detección de CEA y SV40 Tag por transferencia Western
crecimiento exponencial de células de carcinoma gástrico , las células transfectantes Cos7L, Cos7L-CEA, células Meth-a y transfectantes Meth-a-CTAG que expresan un truncado Tag de SV40 citoplasma situada fueron recogidas por tripsinización. Las células se lavaron tres veces en PBS y se lisaron a una densidad de 10 6 células /ml en tampón de lisis. La concentración de proteína se determinó utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, Illinois, EE.UU.). Los extractos celulares correspondientes a 10 g de proteína se separaron por electroforesis a través de 10% en geles de SDS poliacrilamida (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se transfirió a membranas de fluoruro polyvinyliden y se incubaron con mAb CEACAM 10 mg /ml anti-humana 4.3.17 o una 1: 100 hámster diluido anti-SV40 Tag antisuero (una especie de regalo por K.-H. Scheidtmann, Universidad de Bonn). Los anticuerpos unidos se hicieron reaccionar con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa rábano picante y se visualizaron usando un sistema de detección basada en la quimioluminiscencia. (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania)

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