Apibūdinimas skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijas nustatoma pagal CEA424 /SV40 T antigeno-transgeninių pelių su arba be žmogaus CEAtransgene

apibūdinimą skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijas nustatoma pagal CEA424 /SV40 T antigeno
-transgenic peles su arba be žmogaus CEA
transgeno
Anotacija
fone
Skrandžio vėžys yra viena iš dažniausių vėžio visame pasaulyje. Pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, progresavusia liga etape turi prastą prognozę, dėl riboto veiksmingumo galimų gydymo būdų. Todėl naujų gydymo plėtra, kaip imunoterapija už skrandžio vėžio gydymas yra labai svarbus. Kadangi esamų Ikiklinikinių modelių praktiškumo už imunoterapijos skrandžio adenokarcinomos vertinimo yra ribotas, šio tyrimo tikslas buvo nustatyti pelių in vivo
modelius, kurie leidžia nuoseklaus tobulinimo imunoterapijos skrandžio vėžio.
Metodai
nuo jokių pelių skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijos yra įsteigti keturi ląstelių linijas (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) iš spontaniškai besivystančių navikų CEA424 /SV40 T antigeno (CEA424 /TAG) pelėms ir tris ląstelių linijų, gautų iš dviejų transgeninių palikuonių CEA424 /Tag pelių poravosi su žmogaus karcinoembrioninį antigeno (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) pelės (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Markeris yra transgeninių C57BL /6 pelių kamieno padermių Tag prižiūrint -424 /-8 BP CEA geno promotoriaus, kuris veda į invazinių adenokarcinoma plėtros liaukų skrandžio kontrolę. nustatyti iš CEA424 /Tag-CEA pelių navikų ląstelių linijų rezultatai Viesbutis The epitelio kilmės vėžinių ląstelių išreikšti gerai apibrėžtą naviko antigenų CEA pagal savo gamtos reguliavimo elementų kontrolė.
buvo įrodyta morfologinės kriterijus, įskaitant buvimą mucino per ląstelių ir ląstelių sukibimą išraiška molekules EpCAM ir CEACAM1. Visi ląstelių linijas nuosekliai išreikšti transgenų CEA ir /ar žymą ir MHC I klasės molekules todėl jų imlumas lizė pagal žymę specifinio CTL in vitro
. Nepaisant to, CTL-epitopq gautų iš transgenui produktų pateikimo naviko ląstelių linijos buvo tumorogeniškas kai skiepijami į C57BL /6, CEA424 /Markeris ar CEA424 /Tag-CEA-transgeniniai šeimininkai ir jokių reikšmingų skirtumų naviko imtis ir naviko augimas buvo pastebėtas skirtingi šeimininkai. Nors buvo pastebėtas ne spontaniškas navikas atmetimas, vakcinacija linija C57BL /6 peles su lizatuose iš skrandžio karcinoma ląstelių linijų saugomų C57BL /6 peles nuo augliu, demonstruodama naviko ląstelių linijų nontransgenic peles, H-2 B tumorogeniš- haplotipas.
Išvada
Šie naviko ląstelių linijos skiepyti skirtingose ​​singeninės šeimininkai turėtų pasirodyti labai naudinga optimizuoti imunoterapija režimai bus galutinai patikrintas transgeninių gyvūnų besiplečianti pirminė skrandžio karcinomos.
Background
Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi vėžio visame pasaulyje [1]. Jis dažnai nėra aptikta iki vėlyvos stadijos; Vadinasi, 5 metų išgyvenamumas yra žemas (nuo 10 iki 20%). Dėl vietos invazija ir metastazių, spindulinis gydymas ar chemoterapija nėra žymiai padidinti ilgį arba gyvenimo kokybę pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu. Todėl reikia naujų neoadjuvantu ir pagalbiniam gydymui būdus. Imunoterapija gali būti perspektyvi alternatyva. Iš imunoterapija skaičius artėja kaip įvaikinti perdavimo naviko specifinis T ląstelių ir vakcinacijos naudojant vieną nenustatytų naviko antigenus, gautų iš naviko lizatuose ir naviko ląstelių linijas ar apibrėžtų naviko antigenų dažniausiai pateiktų dendritų ląstelės yra vertinami dėl įvairių vėžio [2, 3] , Skrandžio vėžio, imunoterapija nebuvo rimtai apsvarstyti, nes koncepcija, kad skrandžio vėžys yra blogai imunogeniška. Todėl buvo pranešta tik nedidelis skaičius klinikinių imunoterapija tyrimų [4-7]. Be to, tik ribotas skaičius naviko susijusius antigenus potencialiai gali būti naudojami dėl imunoterapijos buvo nustatyta [8-11]. Todėl imuninei sistemai atpažinti ir išnaikinti skrandžio vėžio funkcionalumas yra plačiai žinomas. Įgyti pažvelgti į įvairių imunoterapijos veiksmingumas dėl skrandžio vėžio gydymo ir išsiaiškinti, sukeliančiam mechanizmui šitai imuninio atsako gyvūnų modeliais skrandžio adenokarcinoma yra būtini.
Siekiant šio tikslo, keletas grupių, įskaitant mūsų neseniai įkurtas transgeninių ar besisiejančiais -out pelės veisles, kurios pasireiškia skrandžio adenomų ar adenokarcinoma įvairiose skrandyje po įvairių latencies [12]. Mes sukūrė transgeninio skrandžio karcinoma C57BL /6 pelės modelis grindžiamas SV40 didelio T antigeną (SV40 TAG) transgenų kontroliuoja žmogaus karcinoembrioninio antigeno (CEA) geno promotoriaus (nuo -424 iki -8 transliacijos pradžios vietoje) [13 ]. 100% visų gyvūnų, displazija kripta formavimas skrandžio gleivinės pastebima prievarčio regione jau 30 dienų amžiaus CEA424 /SV40 Tag-transgeninių pelių. Displazija progresuoja invazinės karcinomos ir 50 dieną visa prievarčio skrandžio gleivinės buvo pakeistas karcinoma ląsteles. Nuo 90 iki 110 dienų amžiaus transgeninių pelių tapti gaištančių ir mirti tikriausiai prasta mityba, nes užsikimšimas fazė prievartyje [13]. Iš Tag išraiškos minimaliu CEA geno promotoriaus valdymas leidžia naviko nukreiptas išraišką CEA kirtimo CEA424 /SV40 Tag-transgeninių pelių žmogaus CEA
-transgenic C57BL /6 peles, kurios išreikšti CEA transgeno panašus spatiotemporal išraiška modelis, kaip ir žmonėms [13, 14]. Žmogaus vėžio žymenį CEA yra išreikštas daugelyje žmogaus adenokarcinomų, įskaitant daugiau nei 50% skrandžio karcinoma [15, 16]. CEA vis dažniau naudojamas kaip tikslinės antigeno iš antikūniai ir ląstelinis navikas imunoterapija metodų [17-19] įvairovė. CEA ir Gairė yra tinkamos imunoterapija tikslinės antigenai kadangi T ląstelių epitopq šių antigenų skaičius buvo nustatyta C57BL /6 pelių [20-22]. Nors šie transgeninių pelių padermių veidrodis labai glaudžiai skrandžio adenokarcinoma vystymąsi žmogaus organizme, eksperimentavimas su šių pelių yra gana daug laiko ir brangi dėl sunkumų nustatyti naviko augimą ir veislinių transgeninių pelių reikalavimą. Todėl, ji yra pageidautina turėti singeninės transplantable naviko sistemą skrandžio adenokarcinomos atvejų imunitetą pelių, siekiant optimizuoti tam tikrą imunoterapija protokolo, kol ji bus vertinamas pagal transgeninių pelių. Čia mes aprašome pelių skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijas nustatoma pagal spontaniškai besivystančių navikų SV40 Tag-transgeninių pelių, kurios tumorogeniškas tiek singeninės laukinio tipo ir transgeninių pelių.
Metodai
Pelės atmainos ir ląstelių linijos
CEA424 /Tag- transgeninių pelių (C57BL /6-Tg (CEACAM5-TAG) L5496Wzm) CEA-transgeninių pelių (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) ir F1 pelės nuo a tarp CEA424 /Tag-transgeninių ir CEA-transgeninių pelių kryžiaus buvo aprašyta anksčiau [13, 14]. Tuo tarpu transgeninių linijų buvo backcrossed į linija C57BL /6 peles (H-2 b) daugiau nei 15 kartų. Transgeninių linijų, taip pat C57BL /6 pelių (Charles River Sulzfeld, Vokietija) buvo veisiami ir laikomi standartinėmis patogenais neužkrėstų sąlygomis gyvūnų galimybė, skirti chirurginiam tyrimų instituto, Ludwig-Maximilians-Miuncheno universiteto. Eksperimentai su gyvūnais buvo atliekami po patvirtinimo vietos gyvūnų gerovės komitetui. Dėl tumorogeniš- ir imunogeniškumo tyrimuose pelėms buvo naudojamas 8-12 savaičių amžiaus. Afrikos žalia beždžionė inkstų Cos7L ląstelių linija buvo gauta iš amerikiečių audinių kultūroje kolekcija (ATCC, Rokvilis, MD). Balb /c gautas fibrosarkoma Me-A buvo maloniai pateikė W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburgas). Me-A-CEA ląstelės buvo gautas transfekciją Me-A ląstelių su KLR /CMV-CEA plazmidės naudojant FuGENE ™ 6 transfekcijq reagento (Roche Molekulinė Biochemicals, Šveicarija), pagal gamintojo nurodymus. Me-A-cTag ir RBL5 /T transfectants anksčiau buvo aprašyta [23].
Steigimas skrandžio karcinoma ląstelių linijų Viesbutis The skrandžio karcinomos naudojami nustatyti naviko ląstelių linijas buvo gauti iš 8 skirtingų, 13 savaičių pelių. Keturi kilęs iš CEA424 /Tag-transgeninių pelių ir 4 iš CEA424 /Tag-CEA-dvigubų transgeninių pelių. Iš ląstelių linijų, gautų iš Pastaruoju pelių vardai pažymėta viršutinis indeksas "CEA". Visos kultūros buvo atlikti RPMI1640 papildyta 10% šilumos inaktyvuota serumas iš veršiuko embriono (FCS "Gold" Paa Laboratorijos, Coelbe, Vokietija), 2 mm L-glutamino, 100 V /ml penicilino, 100 mikrogramai /ml streptomicino, ne svarbu amino rūgštys ir 1 mM natrio piruvato (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Vokietija), toliau vadinamas naviko terpės (TM). Navikų audiniuose buvo plačiai plauti fosfato buferinis druskos tirpalu (PBS) papildytas 200 mikrogramų /ml, gentamicino ir 2,5 mikrogramai /ml amfotericino B (GIBCO /Invitrogen), supjaustyti 1 mm 3 vnt su skalpeliu ir padengtą audinių kultūroje kolbose su TM. Kultūrinė terpė buvo keičiama kas 3-4 dienas. Epitelio ląstelių ir fibroblastų augimo iš audinių fragmentų buvo atskirtos ląstelių grandymo, selektyvaus trypsinization ir pasirinktinio persėjant su 1000 U /ml kolagenazę ir 500 V /ml hialuronidazės (Biochrom, Berlynas, Vokietija). disociacijos metu kolbos buvo stebimi pagal apverstos mikroskopu ir virškinimas buvo sustabdytas, kai fibroblastai, bet ne epitelio ląstelės buvo atskirtas (tripsino) arba atvirkščiai (kolagenazę /hialuronidaze). Ši procedūra buvo pakartota per savaitę, kol visi fibroblastai buvo pašalintas iš naviko ląstelių kultūrose. kartos 424GC ląstelių linijos metu fibroblastų kultūra buvo įkurta nuo teršiančių fibroblastų (424 fibroblastus). Sferoidai susiformavo per 5-7 dienas po sėjos 0,5 × 10 3 mGC8 ląsteles į Noble agaro (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Vokietija) -coated 96 šulinėlių plokštelės (TPP-Biochrom, Berlynas, Vokietija) 200 iL TM, kuris buvo pakeistas su šviežia terpe kas dvi dienas. Įvertinti gyvybingumą ląstelių dėl sferoidai, paviršiaus, sferoidai buvo inkubuojamos su FITC žymėto aneksino V (ir prie aneksino V FITC Apoptozę aptikimo rinkinys; CalBiochem, Merck biomokslai, Darmstadt, Vokietija) aptikti apoptozinių ląstelių arba su propidiumo jodido į nustatyti Nekrotinio ląstelės pagal gamintojo rekomendacijas.
tėkmės citometrijos analizuoja
Paviršiniais dažymo ląstelių buvo tripsinizuojamos, išplautos su PBS ir suspenduotos PBS /0,5% m /v galvijų serumo albumino (BSA), papildytoje 0,02% m /t natrio azidas. Indukcijai MHC molekulių, ląstelių buvo inkubuojami su interferonu gama 20 ng /ml (IFNγ; Peprotec, Londonas, Jungtinė Karalystė) už 24 valandas iki derliaus nuėmimo. Nespecifinį antikūnų FC receptorių buvo užblokuotas išankstinės inkubacijos ląstelių su 1 g /10 6 ląstelės anti-CD16 /CD32 monokloninis antikūnas (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelbergas, Vokietija) 15 min , Vėliau ląstelės buvo inkubuojami su 0,5 mikrogramų /10 6 ląstelės dominančio 30 min mAb, esant 4 ° C, plautos du kartus, ir tam tikrais atvejais, vėliau reaguoja su antra-žingsnio antikūnų 15 min, esant 4 ° C , Ląstelės buvo išplauti du kartus ir analizuojami naudojant FACScan (BD, Mountain View, CA). Negyvosios ląstelės buvo neįtraukiamos propidiumo jodido dažymo. buvo naudojami šie reagentai ir MA prieš pelių antigenų iš BD Pharmingen: fikoeritrinas (PE), konjuguoto pelės IgG 2a kovos IA B, biotinilinto pelės IgG 2a Anti-O-2D B PE-konjuguoto pelės IgG 2aanti-O-2K b PE-konjuguoto anti-pelės CD80 /B7-1 PE-konjuguoto žiurkė IgG 2a anti-pelės CD40 PE-konjuguoto žiurkė IgG 2a anti-pelės CD86 /B7-2, fluoresceino izotiocianato (FITC) konjuguoto, armėnų žiurkėno IgG 2 anti-pelės CD80 /B7-1. FITC konjuguoto žiurkė IgG 1 mAb R3-34 PE-konjuguoto žiurkė IgG 1 mAb R3-34 PE-konjuguoto pelės IgG 2a Anti-žiurkė Sirp, FITC konjuguoto Armėnų žiurkėno IgG 2anti-KLH ir PE-konjuguoto žiurkė IgG 2amAb tarnavo kaip izomorfinės kontrolės. Pelės anti-pelės CEACAM1 mAb CC1, žiurkė kovos pelės CEACAM1 AgB10 [24] ir žiurkės kovos pelės El cad ir anti-pelės EpCAM mAb buvo natūra dovana K. Holmes universiteto Koloradas, BB dainininkas, Charite Berlyne ir P. Ruf, Trion tyrimų, Miunchenas, atitinkamai. Kryžius-reaktyvaus pelės anti-žmogaus CEACAM mAb 4/3/17 (specifiniai žmogaus CEA /CEACAM5 su pelėmis) buvo nupirkta iš GENOVAC (Freiburg, Vokietija). Pelių antikūnai buvo aptikta su PE-konjuguoto ožkos anti-pelės IgG, žiurkės antikūnų FITC konjuguoto asilas kovos su RAT-IgG (DaKo).
Aptikimas CEA ir SV40 Tag Imunoblotingo metodu
auga eksponentiškai skrandžio karcinoma ląstelių , Cos7L ląstelės, Cos7L-CEA transfectants, Me-a ląstelės ir Me-a-cTag transfectants išreiškiantys sutrumpintas cytoplasmically esančią SV40 Tag buvo surenkamos trypsinization. Ląstelės tris kartus buvo plaunamos PBS ir lizuojamos esant 10 6 ląstelių /ml lizės buferiniame tirpale, tankis. Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant BCA Baltymai Analizės rinkinį (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Mobilaus ryšio ekstraktai, atitinkantis 10 mikrogramų baltymo atskirti elektroforezės per 10% SDS poliakrilamido geliai (INVITROGEN, Karlsruhe, Vokietija), pervestų polyvinyliden fluorido membranas ir inkubuojami su 10 mikrogramai /ml anti-human CEACAM mAb 4/3/17 arba 1: 100 atskiesti žiurkėnas anti-SV40 Gairė serumas (natūra dovana iki K.-H. SCHEIDTMANN, Bonos universitetas). Rasta antikūnai reaguoja su krienai peroksidazinis žymėto antrinių antikūnų ir ryškinamos naudojant liuminescencijos pagrindu aptikimo sistemą. (ECL; Amersham biomokslai Europe GmbH, Freiburgas, Vokietija)
Mobilusis dvigubai laiko nustatymo
in vitro
besidubliuojančių laikai ląstelių linijų lėmė dengimo skrandžio karcinoma ląsteles 24 duobučių plokšteles TM Nurodytoje prasideda ląstelių skaičių ir skaičiavimo ląstelių mėginių iš trijų dalių šulinių po švelniu trypsinization kas 3 dienas 21 dienų. In vivo
dalijimosi periodu buvo apskaičiuotos iš naviko tūrio matavimų (žr žemiau) po skiepijimo su trimis skirtingais išeities ląstelių skaičių (trijų pelių, kiekvienai grupei). Padvigubinti kartų buvo apskaičiuotos iš žurnalo etapo augimo kreivės.
Tumorogeniš- ir imunogeniškumo ląstelių linijų
tumorogeninio vertinimo vėžinių ląstelių buvo triskart plaunami PBS ir 50 įxL ląstelių suspensijos su nurodytais ląstelių skaičių buvo suleistas po oda į nusiskuto dešinės, ir rezultatas iš pelių. Norėdami nustatyti imunogeniškumo, 10 7 vėžinių ląstelių /ml lizuoti dviejų iš eilės užšaldyti ir atšildymo ciklų. Pelės buvo paskiepyti keturis kartus kas savaitę su 10 6 lizuotų vėžinių ląstelių į dešinio krašto. Po trijų savaičių, pelės užginčijo poodinės injekcijos 3 × 10 6 gyvybingų naviko ląstelių į kairės. Eksperimentiniai grupės sudarė 4-6 peles. Tumoro vystymasis po serijos matavimų naviko dydžio ir naviko apimties buvo apskaičiuojamas pagal lygtį: naviko tūris (mm 3) = d 2 × D /2, kur D ir D buvo trumpiausias ir ilgiausias naviko skersmuo, atitinkamai. Gyvūnai buvo numarinti tada, kai navikai pasiekė 300 mm Talpa 3.
Kartos Tag konkrečių citotoksiniais T limfocitų (CTL) ir stimuliacijos skrandžio karcinoma ląstelių linijų
NBN buvo sukurtas kaip aprašyta anksčiau [23] , Trumpai tariant, pelėms buvo odą pasėta 1 mkm aukso dalelėmis padengtais žymos ekspresijos plazmidės (BMG /CT-AG.1 [23]) į nusiskuto pilvo odą, naudojant helio spaudimą (200 psi) Powered biolistic įrenginys ( "Helios genas pistoletas; Bio-Rad Laboratories GmbH ", Miunchenas, Vokietija). Blužnies ląstelių, gautų 14 dienų po vakcinacijos buvo restimuliuotos kas savaitę su apšvitinto RBL5 /T transfectants į RPMI-1640/10% FCS papildyta 30 TV /ml IL-2. RBL5 /T yra Rauscher virusas transformuotos, T-limfoma ląstelių linija, gautas iš C57BL6 (H-2b) pelės transfekuota su SV40 žymų ekspresijos plazmidės. Norėdami sukurti CTL, blužnis ląstelės, paimtos 10 dienų po vakcinacijos epitopą specifinis buvo restimuliuotos in vitro su apšvitinti, Tag peptidų impulsų RBL5 ląsteles. T1, T2 /3 ir T4 epitopas specifiškumas CTL buvo kontroliuojama nustatant IFNγ turinio žiniasklaidos, po stimuliacijos peptidų impulsų ląsteles-taikinius naudojant ELISA.
Citokinų aptikimo ELISA
gaudymo ir aptikimo IFNγ į nuopile įprastiniais daugiasluoksnis ELISA, mes panaudojome mAb R4-6A2 ir biotinilintą mAb XMG1.2, atitinkamai (BD Pharmingen). Išnykimas buvo analizuojami 405/490 nm dėl TECAN mikroplokštelės ELISA skaitytuvu (TECAN Crailsheim, Vokietija) su EasyWin programinės įrangos (TECAN). Aptikimo riba už IFNγ ELISA buvo 20 pg /ml.
Rezultatai
įkūrimas ir fenotipas skrandžio karcinoma ląstelių linijos
iš 8 skrandžio karcinoma pavyzdžių galėtų būti nustatyta 7 ląstelių linijos. Keturi ląstelių linijos buvo kilęs iš CEA424 /Tag-transgeninių pelių (424GC, iš vyrų pele; mGC3, moterų; mGC5, vyrų ir mGC8, moterų) ir tris eilutes iš CEA424 /Tag-CEA-transgeninių pelių (mGC2 CEA, Vyras; mGC4 CEA, Vyras; mGC11 CEA, moterų). Laikas, reikalingas gauti grynus epitelio ląstelių kultūras labai skyrėsi (vidurkis 6 mėnesių, diapazonas 3-16 mėnesių). Nors naviko ląstelės auga kaip prilipusios kultūros ląsteles, jie linkusios suformuoti agregatus, o ne plinta per kultūros substrato (pav. 1A). Epitelio kilmė vėžinių ląstelių buvo įrodyta morfologinių kriterijų įskaitant muciną akivaizdoje per ląstelių (. 1A pav) ir ekspresijos analizės baltymų dažniausiai išreikštą epitelio ląstelių (EpCAM E-cad, CEACAM1) (. 2A pav) , Sumažintą kiekis muciną buvo nustatyta visų ląstelių linijų, palyginti su įprastomis skrandžio epitelinių ląstelių turinio, bet panašus į, kad aptinkama ne tik navikų ląstelių per skrandžio karcinoma transgeninių pelių (pav. 1A ir [13]). Visi ląstelių linijos rodomas CEACAM1 ir EpCAM ant jų paviršiaus, išskyrus mGC11 CEA, nė vienas iš jų išreiškė El cad (pav. 2A ir duomenų nerodomas). Visi ląstelių linijos išreikštas MHC I klasės H-2K ir, ir kur kas žemesnio lygio, H-2D molekulės (2B pav.). Išraiška abiejų baltymų buvo stipriai padidintas IFNγ stimuliacijos. neušfiksuota MHC II klasės molekulių raiška (I-ab) (pav. 2B ir duomenų neparodyta). CD54, CD80, CD86 arba CD95 nebuvo aptikta bet ląstelių linijos (duomenys neparodyta). 1 pav morfologija skrandžio karcinoma ląstelių linijų auginami kaip monomolekulinių sluoksnių kultūrų arba kaip trijų dimensijų sferoidų. (A) ląstelių linijas rodo šiek tiek kitokį epitelio morfologiją. Dauguma ląstelių visų ląstelių linijų yra būdingas ląstelėje vacuole (rodykles), kuris tikriausiai kuriame mucinous medžiagą tamsintas raudonas iki PAS metodą (paskutinis paveikslėlį dešiniuoju apatiniame skydelyje). (B), sferinis suformuota auginimo mGC8 navikines ląsteles ant minkšto agaro: kairėje, fazinio kontrasto; teisę, fluorescencija dažymo nudžiūvusiuose ląstelių su propidiumo jodido (raudona) ir apoptozinių ląstelių su FITC pažymėtą annexinV (žalia, pažymėtų strėlių antgalių), kaip aprašyta "Medžiaga ir metodai". Didinimas: barai, atitinka 10 mikronų. MSV, pelių skrandžio karcinoma.
2 pav ląstelės paviršiaus išraiška epitelio žymekliai (A) ir MHC I klasės ir II molekulių (B). Skrandžio vėžys ląstelių linijos buvo reagavo arba su PE žymėto (H-2 Kb, H-2DB I-AB) arba etiketės mAb (CEACAM1 E-cad, EpCAM), po to inkubacijos su PE žymėto anti-pelės IgG ar FITC žymėto anti-žiurkė IgG ir analizuojami tėkmės citometrijos metodą. Histogramos rodyti gautus rezultatus su antikūnų atitinkamų antigenų, kurių (atviros pilka) rezultatus arba be (atvira juoda) IFNγ stimuliacija ir nesusiję antigenai (Gray užpildyti kreives).
Siekiant nustatyti ląstelių linijų gali būti naudojamas trijų dimensijų navikų modelių karta mes analizuojami naviko ląstelių STIPRIOJO formavimąsi in vitro. Kaip parodyta Fig. 1B ląstelių linijų suformuotas kompaktiškas naviko ląstelių sferoidus po 8 dienų kultūros, kai 103 ląstelės buvo pasėjamos į minkštą agaro dengtos 96-duobučių lėkštelėse. buvo pastebėtas tik nedidelis viduje eksperimentinis variantas, susijusių su sferoidai dydžio. Nudažant propidiumo jodido ir FITC žymėto aneksino V parodė, kad ne mažiau kaip paviršinis sluoksnis iš sferoidai, sudarė gyvybingų ląstelių su labai nedaug negyvų ląstelių prie jo pritvirtintos (1B pav.).
Transgeno pagal skrandžio karcinoma ląstelių linijų
CEA ir Gairė gali tarnauti kaip naviko specifinius antigenus (TSA) arba naviko susijusių antigenų (TAA) po transplantacijos naujai įsteigtų vėžinių ląstelių linijų imunitetą singeninės C57BL /6 ir CEA- ar Tag-transgeninių pelių, atitinkamai. Nors priemonė navikų susidarymo, Markeris transgenų ne visada randama vėžinių ląstelių linijų, gautų iš Tag-transgeninių pelių, kaip ir trampinių naviko ląstelių linijų [25]. Tai paskatino mus analizuoti žodžio ir MHC I klasės ribojamas pristatymą Tag transgenui taip pat CEA išraišką nustatytų skrandžio karcinoma ląstelių linijų. CEA ląstelės paviršiaus išraiška buvo analizuojamas ląstelių linijų, gautų iš skrandžio navikų iš dvigubo transgeninių pelių tėkmės citometrijos ir Vakarų blot analizė. Nors CEA transgeno reglamentuoja visiškai promotoriaus regione žmogaus CEA geno iš Tag išraiška yra kontroliuojama minimalus -424 /-8 BP CEA promotoriaus (pav. 3A). Visi trys dukart transgeninių ląstelių linijos išreikštas CEA ant ląstelės paviršiaus (3B pav.). Į skrandžio karcinoma ląstelių linijos mGC2 CEA transgenas-išreikštas CEA eksponuojama molekulinę masę 180 kDa, panašią į vieną rasti SV40 transformuotos Afrikos žalios beždžionių inkstų ląstelių stabiliai transfekuotų su CEA ekspresijos vektoriumi, ir CEA ir žmonėms. Kaip ir tikėtasi, ne CEA buvo aptikta 424GC ląstelių, kurios buvo sukurtos iš CEA-neigiamas Tag-Transgeninis pelės (3C pav.). buvo rastas Tag būti išreikšta imunoblotingo ir imunofluorescenciniam analizės visų ląstelių linijų, gautų iš vienos ir dviejų transgeninių pelių (pav. 3D ir duomenų neparodyta). Ši išvada taip pat palaiko ląstelių linijų iš skrandžio karcinoma kilmę. Be to, 424GC ląstelių linija efektyviai pateikti endogeniškai perdirbtų Tag kilmės peptidų, ypač T1 epitopą, į MHC-I apribota būdą, kaip nustatyta pagal IFNγ sekrecijos byTag specifinio CTL (pav. 4A) indukcijos. Be to, ląstelių linijas, buvo efektyviai nužudyti Tag specifinio CTL citotoksinėse tyrimai (pav. 4b). 3 pav išraiška CEA ir pažymėti skrandžio karcinoma ląstelių linijų, gautų iš CEA424 /Tag- ar ​​CEA424 /Tag × CEA-transgeninių pelių. (A), struktūra CEA ir CEA424 /Tag transgenų. Į egzonų 1-10 žmogaus CEA geno esančios pagal kosmidė klonas cosCEA1 įdėklu [14], yra apskaitomos kaip spalvų koduojami dėžės (šviesiai mėlyna, lyderis, raudona, IGV-kaip domeno; mėlyna TVK-kaip domeną; pilka, transmembraninę;.. balti, 5 'ir 3'-neišverstas regionas egzonų Gretutinės vektorinę sekas yra nurodoma kaip juodosios dėžės iš CEA minimaliomis promotoriaus metu į SV40 Gairė genų transgenui vietą nurodo punktyrinės linijos, rodomi transgeninių linijų pavadinimai kairiojoje paraštėje. (B), tėkmės citometrijos buvo atlikta pagal nurodytus ląstelių ženklinimo arba su CEA-konkretų mAb 26/3/13 (užpildyti kreivės) arba izotipo atitikimo antikūnas (atviros kreivės), po to PE žymėto ožką anti-pelės IgG antikūnai. (C, d), Vakarų analizės, 10 mikrogramų viso baltymų ekstraktų 424GC arba mGC8 ląstelių nustatytų iš CEA424 /Tag-transgeninių pelių ir mGC2CEA ir mGC4CEA ląstelėmis CEA424 /Tag × CEA-transgeninių pelių buvo dydis atskirti SDS poliakrilamido gelio elektroforezės, perduoti su membrana, ir reaguoja su CEA-specifinis mAb 26/3/13 (C) arba žiurkėno polikloniniai anti-Tag antikūnai (D). Ištraukos iš Cos7L-CEA ir Me-A ląstelių stabiliai perkeltų su ekspresijos vektoriai kodavimo CEA arba Gairė trūksta regioną su branduolinės lokalizacijos signalo (cTag) tarnavo kaip teigiamos kontrolės. Baltymų žymekliai dydžiai nurodyta kairėje maržas.
4 pav MHC I klasės ribojamas pristatymą Tag epitopq iki pelių skrandžio karcinoma ląstelių linijų. (A), epitopq konkrečių CTL generuojami linija C57BL /6 peles DNR imunizacijos žymos ekspresijos vektorių ir po plėtros in vitro stimuliacijos Tag peptidų pakrauti RBL5 ląstelių buvo inkubuojami su apšvitinto 424GC 424 fibroblastų, RBL5 ir pažymėti T1, T2 /3 arba T4 peptido impulsų RBL5 ląstelės, skirtos 24 h ir jų IFNγ sekrecijos į terpėje buvo nustatomas pagal ELISA. Sekrecijos IFNγ iki CTL skatino su 424GC ląstelių rodo, kad šios ląstelės dabartiniai SV40Tag-specifiniai peptidai yra MHCI-ribotu mastu. (B), Coculture iš 424GC ir 424 fibroblastų buvo gydomi 107 Gairė specifinio CTL į Petri lėkštelę 48 h. Po to, neadhezinę (negyvi) ląstelės buvo pašalintas. Kairysis, coculture prieš CTL gydymą; Gerai, coculture po gydymo. Rodyklės rodo naviko ląstelių prieš pridedant CTL poziciją
tumorogeniš- iš skrandžio karcinoma ląstelių linijų
Norėdami nustatyti ląstelių linijų tumorogeniš-, įvairūs numeriai (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) ląstelių buvo suleista po oda į C57BL /6 pelių. Visi ląstelių linijos galėjo suformuoti auglių 100% gyvūnų, jei bent 3 × 10 5 naviko ląstelės buvo suleistas (5A pav.). Augliai išaugo beveik eksponentiškai nedelsiant, kol jie pasiekė 300 mm 3 apimtį. tolimi metastazių nėra galima aptikti per stebėjimo laiką. Vakarų dėmė analizė atliekama transplantacija navikų parodė, kad abi transgenai išreiškė ląstelių linijų in vivo
(duomenys neparodyti). Dubliavimo kartų naviko ląstelių in vivo
pradinė naviko apkrova 10 6 ląstelių svyravo nuo 7,2 (mGC8) ir 13,8 dienų (mGC3) (pav. 5a). In vitro
, visų ląstelių linijos eksponuojama panašius dalijimosi periodu apie 3 dienų (5B pav.). Mes taip pat palyginti poodinių navikų susidarymą ląstelių linijų laukinio tipo (linija C57BL /6) ir transgeninių pelių. Jokių reikšmingų skirtumų nepastebėta naviko imk ir naviko augimo ląstelių linijos 424GC kai švirkščiama po oda į laukinio tipo arba CEA424 /Tag-transgeninių pelių (6a pav.) Ir mGC11 CEA ląstelės po injekcijos į laukinio tipo ir CEA424 /Tag-CEA-transgeninių pelių (pav. 6B). 5 pav in vivo (A) ir in vitro augimo savybes (B) pelių skrandžio karcinoma ląstelių linijų. Trys pelės kas buvo suleistas su nurodytomis naviko ląstelių dozėmis. Naviko augimo buvo įvertintas dviem statmenomis matavimų naviko skersmuo Tūrio skaičiavimas, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai skyriuje. Norėdami nustatyti augimą in vitro savybes, ląstelės buvo auginamos 24-duobučių lėkštelėse pradedant nurodytuose ląstelių skaičių. Skirtingais laiko momentais ląstelės arba trijų šulinių buvo surinktos ir suskaičiuoti. Rezultatai rodomi kaip vidurkis +/- standartinis nuokrypis (SD). Geriausi tinkami kreivės taip pat besidubliuojančių kartus dienų (skliausteliuose) buvo apskaičiuotas naudojant GraphPad programinę įrangą.
6 pav augimas skrandžio karcinoma ląstelių linijų laukinio tipo ir transgeninių pelių. 3 × 105 424GC ląstelės buvo švirkščiamas į poodį į C57BL /6 ir CEA424 /Tag-transgeninių pelių (A) arba 3 × 105 mGC11CEA ląstelės buvo švirkščiamas į C57BL /6 ir CEA424 /Tag × CEA-dviguba transgeninių pelių (B). Naviko augimo buvo įvertintas dviem statmenomis matavimų naviko skersmuo Tūrio skaičiavimas, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai skyriuje. Rezultatai rodomi kaip vidutinis +/- SD (n = 3).
Imunogeniškumas skrandžio karcinoma ląstelių linijos Viesbutis The panašų augimą naviko ląstelių linijų laukinio tipo ir transgeninių pelių rodo, kad nėra reikšminga imuninis atsakas į arba naviko antigenų (Gairė CEA) pasireiškė naviko guolio pelių. Iš tiesų, ne Gairė konkrečių CTL gali būti identifikuojami naviko guolio laukinio tipo peles nuo laipsniško oda augimo Tag ekspresija skrandžio karcinoma ląstelių blužnies (duomenų nerodomas). Tačiau, kai dvigubi transgeninių ląstelių linijos išaugo pelėms, CEA-specifinius antikūnus galėtų būti identifikuojami laukinio tipo C57BL /6 pelių, bet ne CEA-transgeninių pelių (pav. 7A). Be to, trys skiepai iš C57BL /6 pelių 106 užšaldymo atšildyti mGC8 vėžinių ląstelių kas savaitę arba trukdo augti po oda švirkščiamo gyvi mGC8 ląstelės visiškai ar naviko pasekmė buvo atidėtas beveik tris savaites, priklausomai nuo švirkščiamas naviko ląstelių dozės (pav. 7B C). Šie eksperimentai įrodyti, kad navikų ląstelių linijos yra imunogeniška esant tam tikroms sąlygoms. Tačiau C57BL /6 peles nereikia spontaniškai prijungti veiksmingą naviko progresavimas ribojantis imuninį atsaką į abiejų naviko antigenų metu oda naviko augimą. 7 pav imunogeniškumo MSV ląsteles. (A), Anti-CEA antikūnai buvo nustatomas atsižvelgiant į C57BL /6 ir CEA-transgeninių pelių naudojant tėkmės citometrijos serume. Visi pelėms buvo palaipsniui didėja auglių be akivaizdžių nekrozės po transplantacijos ir augimo nurodytų ląstelių linijas 35-40 dienų. mGC4CEA ląstelės inkubuojamos su nurodytais pelių skirtingais skiedimo ir surištų pirminių antikūnų serume buvo aptikta su PE-konjuguoto anti-pelės antikūnų. (B, C) Trys C57BL /6 pelių kiekvienas buvo suleistas po oda tris kartus kas savaitę su 1 × 106 mGC8 ląstelių žuvusių dviem užšaldyti-atšildymo ciklų. Praėjus dviem savaitėms po paskutinės vakcinacijos, pelėms buvo užginčytos injekcija 1 × 106 (B) ir 3 × 106 (c) gyviems mGC8 ląstelės, atitinkamai (užpildytos ratu). Kaip kontrolės, naviko ląstelės buvo suleistas į ne-imunizuoti pelių (atviros apskritimai). Naviko apimtys buvo apskaičiuotas kaip aprašyta medžiaga ir metodai skyriuje. Rezultatai rodomi kaip vidurkius +/- SD.
Diskusijos
pagrindinis tikslas šiame tyrime buvo nustatyti terapinį modelį skrandžio vėžio imunitetą pelių, kurios teiktų gyvūnų modelį įvertinti Priešnavikinio imunitetą ir imunoterapinių strategijos.

• Pirminis skrandžio Ne Hodžkino limfoma Kinijos pacientai klinikinių charakteristikų ir prognostinių faktorių
• GASTRICHIP: D2 rezekcija ir hipertermiškos pilvaplėvės ertmę chemoterapija vietiškai išplitusiu skrandžio karcinoma III tyrimas atsitiktinių imčių ir daugiacentrinį etapas