Определение характеристик желудочных линий клеток аденокарциномы, созданных из CEA424 /SV40 Т-антигена-трансгенных мышей, с или без человеческого CEAtransgene

Характеристика желудочных линий клеток аденокарциномы, созданных из CEA424 /SV40 Т-антигена
-transgenic мышей с или без человеческого СЕА
трансгена
Аннотация
Справочная информация
Желудочный карцинома является одним из наиболее часто встречающихся видов рака во всем мире , У пациентов с раком желудка на продвинутой стадии болезни имеют плохой прогноз, в связи с ограниченной эффективностью доступных методов лечения. Таким образом, разработка новых методов лечения, как иммунотерапии для лечения рака желудка имеет первостепенное значение. Так как удобство и простота использования существующих доклинических моделях для оценки иммунотерапии для желудка аденокарциномы ограничена, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы установить мышиные виво
модели, в которых позволяют ступенчатое улучшение иммунотерапии рака желудка.
Методы
Поскольку нет мышиные аденокарциномы желудка клеточные линии не доступны, мы установили четыре клеточные линии (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) от спонтанно развивающихся опухолей CEA424 /SV40 Т-антигена (CEA424 /Tag) мышей и трех клеточных линий, полученных из дважды трансгенной отпрыски CEA424 /Tag мышей сопряженными с раково антигена человека (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) мышей (mgc2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Метка является трансгенной линии C57BL /6 мыши штамма укрывает тег под контролем АД CEA промотора гена -424 /-8, что приводит к развитию инвазивной аденокарциномы в железистого желудка. опухолевые клеточные линии, установленные у мышей CEA424 /Tag-СЕА выразить хорошо определенный СЕА опухолевого антигена под контролем его естественных регуляторных элементов.
Результаты
эпителиального происхождения опухолевых клеток была доказана морфологическим критериям, включая наличие муцина в клетках и экспрессию клеточной адгезии молекулы EpCAM и CEACAM1. Все клеточные линии последовательно выражают трансгены СЕА и /или метки и молекулы МНС класса I приводит к их восприимчивости к лизису Tag-специфических ЦТЛ в пробирке
. Несмотря на презентации CTL-эпитопов, полученных из трансгенных продуктов линии опухолевых клеток онкогенными при прививке в C57BL /6, CEA424 /Tag или CEA424 /Tag-СЕА-трансгенные хостов и никаких существенных различий в опухоли берут и рост опухоли наблюдались в различные хосты. Хотя не наблюдалось отторжение спонтанное опухоли, вакцинация мышей C57BL /6 с лизатах из желудка линий клеток карциномы защищенных C57BL /6 мышей от опухоли вызов, демонстрирующих туморогенности клеточных линий опухолевых в нетрансгенных мышей Н-2 Ь гаплотип.
Вывод изображения Эти линии опухолевых клеток, привитые в различных сингенных хозяев должно оказаться очень полезным для оптимизации схемы иммунотерапии, чтобы быть окончательно проверены в трансгенных животных, развитие первичной желудочных карцином.
Справочная информация
Желудочный рак второй во всем мире наиболее распространенным видом рака [1]. Он часто не обнаруживается до продвинутой стадии; следовательно, показатели выживаемости в течение 5 лет низкие (от 10 до 20%). Благодаря местной инвазии и метастазированию, лучевая терапия или химиотерапия не приводит к существенному увеличению длины или качества жизни пациентов с распространенным раком желудка. Таким образом, разработка новых методов лечения неоадъювантной и адъювантной необходимы. Иммунотерапия может быть перспективным альтернативным вариантом. Ряд иммунотерапии подходов, как приемному передачи опухоль-специфических Т-клеток, а также вакцинации с использованием либо неопределенные опухолевых антигенов, полученных из опухолевых лизатов и опухолевых клеточных линий или определенных антигенов опухоли, обычно представленных дендритные клетки оцениваются для различных видов рака [2, 3] , Для рака желудка, иммунотерапия не принимали всерьез во внимание в связи с концепцией, что рак желудка является слабо иммуногенным. Таким образом, лишь небольшое количество клинических испытаний иммунотерапии сообщалось [4-7]. Кроме того, лишь ограниченное число опухолевых антигенов, ассоциированных с потенциальным использованием для иммунотерапии были идентифицированы [8-11]. Следовательно, способность иммунной системы распознавать и искоренить рак желудка в значительной степени неизвестен. Для того, чтобы получить представление об эффективности различных иммунотерапии для лечения рака желудка и выяснить основной механизм индуцированных иммунных реакций животных модели аденокарциномы желудка незаменимы.
С этой целью, несколько групп, включая наш недавно создали трансгенным или постучать отъезда линии мышей, которые развиваются желудочные аденомы или аденокарциномы в различных отделах желудка после различных задержках [12]. Мы разработали трансгенного рака желудка мышей C57BL /6 мышиная модель основана на большом SV40 Т-антигена (SV40-Tag) трансгена под контролем промотора гена карциноэмбриональный антиген человека (CEA) (от -424 до -8 поступательной сайта инициации) [13 ]. В 100% животных, диспластические крипты образование в слизистой оболочке желудка наблюдается в пилорической уже 30 день старый CEA424 /SV40 Tag-трансгенных мышей. Дисплазия прогрессирует с инвазивными карциномами и 50-й день весь пилорический слизистую оболочку желудка была заменена клетками карциномы. В возрасте от 90 до 110 дней трансгенные мыши становятся умирающий и умирают, вероятно, недоедания из-за закупорки привратника [13]. Контроль экспрессии тегов на минимальной промотора гена СЕА позволяет экспрессию CEA онкогенная направленный путем скрещивания CEA424 /SV40 Tag-трансгенных мышей, с СЕА человека
-transgenic C57BL /6 мышей, которые экспрессируют трансген СЕА в подобном пространственно-временной паттерн экспрессии, которые содержатся в организме человека [13, 14]. СЕА человека опухолевый маркер выражается во многих человеческих аденокарциномы в том числе более чем на 50% желудочных карцином [15, 16]. СЕА все чаще используется в качестве антигена-мишени для различных антитело и клеточно-опосредованных подходов иммунотерапии опухолей [17-19]. СЕА и Тэг подходящие целевые иммунотерапии антигены, поскольку ряд Т-клеточных эпитопов этих антигенов были идентифицированы у мышей C57BL /6 мышей [20-22]. Хотя эти трансгенные линии мышей зеркало развитие аденокарциномы очень тесно желудка у людей, экспериментирование с этими мышами относительно много времени и дорого из-за трудностей, чтобы определить рост опухоли и требование селекции трансгенных мышей. Поэтому желательно иметь сингенную систему для трансплантации опухоли желудка аденокарциномы у иммунокомпетентных мышей для оптимизации данного протокола иммунотерапии до того, как оценивается в трансгенных мышах. Здесь мы опишем мышиные линии клеток аденокарциномы желудка, установленным от спонтанно развивающихся опухолей SV40 Tag-трансгенных мышей, которые являются онкогенными в обоих сингенных дикого типа и трансгенных мышей.
Методы
штаммы мышей и клеточные линии
CEA424 /, отве трансгенные мыши (C57BL /6-TG (CEACAM5-Таг) L5496Wzm), СЕА-трансгенных мышей (C57BL /6-TG (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) и F1 мышей от скрещивания между CEA424 /Tag-трансгенный и СЕА-трансгенных мышей были описаны ранее [13, 14]. В то же время трансгенные линии были возвратное скрещивание для мышей C57BL /6 (H-2 б) в течение более 15 поколений. Трансгенные линии, а также мышей C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Германия) были выведены и содержали в стандартных патогена условиях в виварии Института хирургических исследований Людвига-Максимилиана университета Мюнхена. Эксперименты на животных были проведены после утверждения местного комитета по защите здоровья животных. Для туморогенности и иммуногенность анализов использовали мышей в 8-12-недельного возраста. Африканский зеленый Cos7L линия клеток почки обезьяны была получена из Американской коллекции тканевых культур (АТСС, Роквилл, штат Мэриленд). BALB /C происхождения фибросаркомы Meth-A был любезно предоставлен В. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Гамбург). Клетки Meth-A-CEA были получены путем трансфекции клеток Meth-A с плазмид экспрессии PRC /CMV-СЕА с использованием Fugene ™ 6 трансфекции реагента (Roche Molecular Biochemicals, Швейцария) в соответствии с инструкцией изготовителя. Мет-А-ГКТД и RBL5 /T трансфектанты описаны ранее [23].
Создание карциномы желудка клеточных линий
Желудочные карцином, используемые для установления опухолевых клеточных линий были получены из 8 различных, 13-недельных мышей. Четыре полученный из CEA424 Tag-трансгенных мышей /и 4 из CEA424 /Тэг CEA-двойных трансгенных мышей. Названия клеточных линий, полученных из последних мышей отмечены верхним индексом "СЕА". Все культуры были выполнены в RPMI1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS "Gold"; PAA Laboratories, Кёльбе, Германия), 2 мМ L-глутамина, 100 ед /мл пенициллина, 100 мкг /мл стрептомицина, несущественные аминокислоты и 1 мМ пирувата натрия (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Германия), далее в качестве среды опухоли (TM). опухолевых тканях интенсивно промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 200 мкг /мл гентамицина и 2,5 мкг /мл амфотерицина В (GIBCO /Invitrogen), разрезают на 1 мм 3 части со скальпелем и высевают в культуре ткани колбы, содержащие ТМ. Питательную среду меняли каждые 3-4 дня. Эпителиальные клетки и фибробласты, растущие из фрагментов ткани были разделены клетки выскабливание, селективного трипсином и селективного пассажей с 1000 ед /мл коллагеназы и 500 Ед /мл гиалуронидазы (Biochrom, Берлин, Германия). Во время диссоциации, колбы наблюдали под инвертированным микроскопом и пищеварение было остановлено, когда фибробласты, но не эпителиальные клетки отделяли (трипсин) или наоборот (коллагеназы /гиалуронидазу). Эту процедуру повторяют до тех пор, еженедельно все фибробласты не были исключены из культур опухолевых клеток. Во время генерации клеточной линии 424GC, фибробласта культура была создана из загрязняющими фибробластов (424 фибробласты). Spheroids формируется в течение 5-7 дней после посева 0,5 × 10 3 mGC8 клеток в Noble агар (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) -покрытие 96-луночные планшеты (ТЭЦ-Biochrom, Берлин, Германия) в 200 мкл ТМ, которая заменяли свежей средой один раз в два дня. Для оценки жизнеспособности клеток на поверхности сфероидов, сфероиды, инкубировали с ФИТЦ-меченого аннексина V (аннексина V FITC Апоптоз Обнаружение комплект; Calbiochem, Merck Biosciences, Дармштадт, Германия) для обнаружения апоптотических клеток или с пропидийиодидом для выявления некротическими клетки в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
Проточная цитометрия анализ
для окрашивания клеток поверхности трипсином, промывали PBS и суспендировали в PBS /0,5% вес /об бычьего сывороточного альбумина (БСА), дополненной 0,02% вес /объем натрия азид. Для индукции молекул MHC, клетки инкубировали с 20 нг /мл интерферона-гамма (IFN γ Peprotec, Лондон, Великобритания) в течение 24 часов до начала уборки урожая. Неспецифическое связывание антител с рецепторами Fc была блокирована предварительной инкубации клеток с 1 мкг /10 6 клеток анти-CD16 /CD32 моноклональных антител (монАТ) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany) в течение 15 мин , Затем клетки инкубировали с 0,5 мкг /10 6 клеток ГПА интереса в течение 30 мин при 4 ° С, промывают дважды, и когда это необходимо, затем подвергают взаимодействию с вторым шагом антителом в течение 15 мин при температуре 4 ° С , Клетки дважды промывали и анализировали с использованием FACScan (BD, Mountain View, CA). Мертвые клетки исключались путем пропидийиодидом окрашивания. Были использованы следующие реагенты и моноклональные антитела против мышиных антигенов из BD Pharmingen: фикоэритрин (РЕ) -conjugated мыши IgG <суб> 2a анти-IA б, биотинилированного мышиного IgG <суб> 2a анти-Н-2D б , PE-конъюгированного IgG мыши <суб> 2aanti-H-2K б, PE-конъюгированного антитела против мышиных CD80 /B7-1, PE-конъюгированного IgG крысы <суб> 2a анти-CD40 мыши, PE-конъюгированного IgG крысы <суб> 2a анти-мышиного CD86 /B7-2, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -conjugated, Армянский хомяка IgG <суб> 2 анти-мыши CD80 /B7-1. FITC-конъюгированного IgG крысы <суб> 1 МАт R3-34, PE-конъюгированного IgG крысы <суб> 1 МАт R3-34, PE-конъюгированного IgG мыши <суб> 2a против крысиного SIRP, FITC-конъюгированного Армянский хомяка IgG <суб> 2anti-KLH и PE-конъюгированного IgG крысы <суб> 2amAb служил в качестве контроля изотипа. Мышь анти-мышиного CEACAM1 мАт CC1, крысы против мышиного CEACAM1 AgB10 [24] и крысы против мышиного Е-кадгерина и анти-мышиного EpCAM мАт были своего рода подарок от К. Холмс, Университет Колорадо, Б. Б. Зингера, Шарите Берлин, и П. Руф, Trion Research, Мюнхен, соответственно. Перекрестно-реактивными мышиного антитела против человеческого CEACAM мАт 4/3/17 (специфический для СЕА человека /CEACAM5 у мыши) были приобретены у GENOVAC (Freiburg, Germany). Мышиные антитела выявляли с РЕ-конъюгированные антитела из козы против мышиного IgG, крысы антител с FITC-конъюгированные осла против крысиного-IgG (DAKO).
Обнаружение CEA и SV40 Tag с помощью Вестерн-блоттинга
экспоненциальный рост клеток рака желудка , Cos7L клетки, Cos7L-CEA трансфектантов, клетки Meth-A и Meth-A-ГКД трансфектантов, выражающие усеченного цитоплазматической расположенный SV40 Tag собирали трипсином. Клетки промывали три раза в PBS и лизируют при плотности 10 6 клеток /мл в буфере для лизиса. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Иллинойс, США). Клеточные экстракты, соответствующие 10 мкг белка разделяли с помощью электрофореза на 10% полиакриламидном геле (Invitrogen, Karlsruhe, Германия), переносили в polyvinyliden фторсодержащие мембраны и инкубировали с 10 мкг /мл анти-человеческого CEACAM мАт 4/3/17 или его 1: 100 разбавляется хомяка анти-SV40 Tag антисыворотка (дар вид на К.-Х. Scheidtmann, Боннский университет). Св занные антитела реагируют с пероксидазой хрена, меченного вторичными антителами и визуализируют с использованием хемилюминесценции на основе системы обнаружения. (ЭХЛ, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Германия)
Cell определения времени удвоения
В пробирке
удваивая раз клеточных линий определяли путем высева желудочных клеток карциномы у 24-луночные планшеты в ТМ в указанных исходных числа клеток и подсчета клеточных образцов из трех лунок после осторожного трипсином каждые 3 дня в течение 21 дней. В естественных условиях
раз удваивая были рассчитаны на основе измерений объема опухоли (см ниже) после прививки с тремя различными номерами, начинающимися клеток (трех мышей на группу). Удвоение раз рассчитывались из логарифмической фазы кривых роста.
Туморогенность и иммуногенность клеточных линий Китай для оценки туморогенность опухолевые клетки промывали три раза в PBS и 50 мкл суспензии клеток с указанными количествами клеток впрыскивали подкожно в бритой правый фланг мышей. Для определения иммуногенности, 10 7 опухолевых клеток /мл подвергали лизису с помощью двух следующих друг за другом при замораживании и оттаивании циклов. Мыши были иммунизированы четыре раза с интервалом в неделю с 10 6 лизированных опухолевых клеток в правый бок. Три недели спустя, мышей заражали путем подкожной инъекции 3 × 10 6 жизнеспособных опухолевых клеток в левый бок. Экспериментальные группы состояли из 4-6 мышей. Развитие опухоли с последующим последовательным измерения размера опухоли и объем опухоли рассчитывали в соответствии с уравнением: объем опухоли (мм 3) = d 2 × D /2, где d и D были кратчайшим и самый длинный диаметр опухоли, соответственно. Животные были умерщвлены, когда опухоли достигали объема 300 мм 3.
Генерация Tag-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и стимуляции желудочной Клеточные линии карциномы
ЦТЛ были получены, как описано ранее [23] , Вкратце, мышей внутрикожно засевают с золотыми частицами размером 1 мкм, покрытых экспрессии плазмиды Tag (BMG /Ct-Ag.1 [23]) в выбритой кожи живота с использованием давления гелия (200 фунтов на квадратный дюйм) Приведено биолистической устройство (Helios генной пушки; Bio-Rad Laboratories GmbH, Мюнхен, Германия). Клетки селезенки, полученные через 14 дней после вакцинации были повторно стимулированных с недельными интервалами с облученным RBL5 /T-трансфектантов в RPMI-1640/10% FCS с добавлением 30 МЕ /мл IL-2. RBL5 /T является Rauscher вирус-трансформированных клеток линии Т-лимфома, полученный из (H-2b) мыши C57BL6 трансфицированных с выражением Tag SV40 плазмиды. Для создания эпитоп-специфических ЦТЛ, клетки селезенки, принятое 10 дней после вакцинации были рестимулируется в пробирке с облученным, Tag пептид-импульсно RBL5 клеток. Т1, Т2 /3 и Т4 эпитоп специфичность ЦТЛ контролировалась определения содержания IFN γ носителя при стимуляции пептид-импульсно клеток-мишеней с помощью ELISA.
Обнаружения цитокина с помощью ELISA
для захвата и обнаружения IFN γ в супернатантах с помощью обычных сэндвич-ELISA, мы использовали Mab R4-6A2 и биотинилированного MAb XMG1.2, соответственно (BD Pharmingen). Вымирание анализировали при 405/490 нм на TECAN микропланшетов ELISA читателя (TECAN Crailsheim, Германия) с программным обеспечением EasyWin (TECAN). Предел обнаружения ИФА для IFN γ было 20 пг /мл.

Результаты Создание и фенотип карциномы желудка клеточные линии 8 на продажу из образцов желудочного рака может быть установлено 7 клеточных линий. Четыре клеточные линии были получены из CEA424 Tag-трансгенных мышей /(424GC, от самца мыши, mGC3, женского, mGC5, мужской и mGC8, женщина) и три строки из CEA424 /Tag-СЕА-трансгенных мышей (mgc2 CEA, мужчина; mGC4 CEA, мужчина; mGC11 CEA, женщина). Время, необходимое для получения чистых эпителиальные клеточные культуры сильно различались (в среднем 6 месяцев, диапазон 3-16 месяцев). Несмотря на то, что опухолевые клетки растут как прилипшие клетки в культуре, они имеют тенденцию к образованию агрегатов, а не распространяющийся по культуральной подложки (рис. 1А). Эпителиального происхождения опухолевых клеток была подтверждена морфологическими критериями, в том числе и в присутствии муцина в клетках (фиг. 1А) и анализ экспрессии белка обычно выражается в эпителиальных клетках (EpCAM, Е-кадгерин, CEACAM1) (рис. 2А) , Сниженное содержание муцина был обнаружен во всех клеточных линиях по сравнению с содержанием в нормальных эпителиальных клеток желудка, но близка к найденной в опухолевых клетках в пределах карциномы желудка у трансгенных мышей (фиг. 1A и [13]). Все клеточные линии отображаются CEACAM1 и EpCAM на их поверхности, за исключением mGC11 CEA, ни один из них не выразил Е-кадгерин (рис. 2А и данные не показаны). Все клеточные линии выражены МНС класса I H-2K и, и на значительно более низком уровне, H-2D молекулы (рис. 2В). Экспрессия обоих белков сильно усиливается IFN γ стимуляции. Не обнаружено экспрессии молекул МНС класса II (I-Ab) (рис. 2В и данные не показаны). CD54, CD80, CD86, CD95 или не были обнаружены на любой линии клеток (данные не показаны). Рисунок 1 Морфология желудка линий клеток карциномы, выращенных в виде монослойных культур, или в виде трехмерных сфероидов. (А) Клеточные линии показывают несколько иную эпителиальную морфологию. Большинство клеток всех клеточных линий содержат характерную внутриклеточную вакуоль (стрелки), которые, вероятно, содержит коллоидный материал окрашивается в красный цвет методом ПАС (Последнее изображение прямо в нижней панели). (B) Сфероид образована путем культивирования mGC8 опухолевых клеток на мягком агаре: левый, фазовый контраст; Хорошо, флуоресцентного окрашивающего некротических клеток с пропидийиодидом (красный) и апоптоза клеток с FITC-меченого annexinV (зеленый, отмеченные наконечниками), как описано в разделе "Материалы и методы". Увеличение: бары соответствуют 10 мкм. MGC, мышиный рак желудка. Рисунок
выражение поверхности 2 клеток эпителиальных маркеров (А) и МНС класса I и молекул II (В). Желудочный линий клеток карциномы подвергали взаимодействию либо с РЕ-меченого (H-2Kb, H-2 дБ, I-Ab) или с немеченых мАт (CEACAM1, Е-кадгерин, EpCAM) с последующей инкубацией с РЕ-меченными анти-мышиного IgG или FITC меченные IgG против крысиного и анализировали с помощью проточной цитометрии. Гистограмма отображает результаты, полученные с помощью антител против соответствующих антигенов с (открытым серым цветом) или без него (открытый черный) до стимуляции и не относящиеся к делу IFN, антигены (серые заполненные кривые).
Для того, чтобы определить потенциал клеточных линий, которые будут использоваться для генерация трехмерных моделей опухолей мы проанализировали опухолевых клеток сфероида образование в пробирке. Как показано на рис. 1В клеточные линии образуются компактные сфероиды клеток опухоли через 8 дней культивирования при 103 клеток высевали в мягком агаре с покрытием 96-луночных планшетах. Только наблюдалось незначительное интра-экспериментальное изменение относительно размера сфероидов. Окрашивание пропидийиодидом и FITC-меченого аннексина V показано, что, по меньшей мере поверхностный слой сфероидов состоял из жизнеспособных клеток с очень мало мертвых клеток, прикрепленных к ней (рис. 1, б). Экспрессию трансгена
желудочными карцинома клеточных линий
CEA и Tag может служить опухолевым антигенам (TSA) или ассоциированных с опухолью антигенов (ТАА) после трансплантации вновь созданных линий опухолевых клеток в иммунокомпетентных сингенных C57BL /6 и CEA- или Tag-трансгенных мышей, соответственно. Несмотря на важную роль в формировании опухоли, экспрессия Tag трансген не всегда можно найти в опухолевых клеточных линиях, полученных от Tag-трансгенных мышей, как и в линиях опухолевых клеток TRAMP [25]. Это побудило нас проанализировать выражение и класса MHC I-ограниченный презентацию Tag трансгенов, а также экспрессию CEA в установленных линий карциномы желудка клеток. экспрессии клеточной поверхности СЕА анализировали в клеточных линиях, полученных из опухоли желудка от двойных трансгенных мышей с помощью проточной цитометрии и Вестерн-блот-анализа. В то время как экспрессия трансгена CEA регулируется полной промоторной области ген СЕА человека экспрессия Tag контролируется минимальной -424 /-8 п.н. CEA промотора (фиг. 3A). Все три двойных трансгенные клеточные линии выражены СЕА на поверхности клетки (рис. 3, б). В желудочном клеточной линии карциномы mgc2 СЕА трансген экспрессируется СЕА проявляли молекулярную массу 180 кДа, подобную той, найденной в SV40-трансформированные африканских клеток почки зеленой мартышки, стабильно трансфицированные экспрессии СЕА вектором и к СЕА обнаружен в организме человека. Как и ожидалось, не СЕА не было обнаружено в клетках 424GC, которые были созданы из СЕА-отрицательной Tag-трансгенной мыши (рис. 3в). Тэг было установлено, что выражается с помощью Вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентного анализа во всех клеточных линий, полученных из одной и двумя трансгенные мыши (рис. 3D и данные не показаны). Это открытие также поддерживает происхождение клеточных линий от карцином желудка. Кроме того, 424GC линия клеток эффективно представлены эндогенно обработанные Tag-пептиды, особенно эпитоп Т1, в ГКГ-я ограниченным способом, как определено индукцию IFN γ секреции byTag-специфических ЦТЛ (фиг. 4А). Кроме того, клеточные линии были эффективно убиты Tag-специфических ЦТЛ в цитотоксических тестах (рис. 4б). Рисунок 3. Экспрессия CEA и Tag желудочной линии карциномы клеток, полученных из CEA424 /, отве или CEA424 /Tag × СЕА-трансгенных мышей. (А) Структура CEA и CEA424 /Tag трансгенов. Экзоны 1-10 из человеческого гена СЕА, содержащегося внутри вставки космидный клон cosCEA1 [14], показаны в виде цветных закодированы коробки (светло-голубой, лидер, красный, ВНА-подобный домен, синий IGC-подобный домен, серый, трансмембранный домен;.. белый, 5 'и 3'-нетранслируемые область экзоны, фланкирующих последовательностей вектора обозначены как черные ящики расположение CEA минимального промотора, присутствующего в SV40 гена Тэг трансгена обозначаются пунктирными линиями, имена трансгенных линий показаны в левом поле. (в) Проточная цитометрия проводили мечения указанных клеток либо с СЕА-специфической мАт 26/3/13 (заполненные кривые) или изотипа антитела (открытые кривые), а затем PE-меченых козьего анти-мышиного IgG антитела. (C, D) для Вестерн-анализа, 10 мкг общего белка из экстрактов клеток 424GC или mGC8 созданных из CEA424 Tag-трансгенных мышей, /и mGC2CEA и mGC4CEA клеток из CEA424 /Tag × СЕА-трансгенных мышей размер разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, переносили на мембрану и реагирует с СЕА-специфические монАТ 26/3/13 (с) или хомячка поликлональные антитела анти-Tag (D). Экстракты из Cos7L-CEA и клеток Мет-стабильно трансфицировали векторами экспрессии, кодирующими СЕА или теге отсутствует область с ядерной локализации сигнала (ГКД) служил в качестве положительного контроля. Размеры белковых маркеров указаны в левом полях. Рисунок 4
MHC класса I-ограниченное представление Tag эпитопов на мышиных карциномы желудка клеточных линий. (А) эпитоп-специфические ЦТЛ генерируется у мышей C57BL /6 с помощью иммунизации ДНК с вектором экспрессии тегов и последующего расширения путем стимуляции в пробирке с меткой пептидных загруженным RBL5 клетки инкубировали с облученным 424GC, 424 фибробласты, RBL5 и Tag T1, T2 /3 или T4 пептид-импульсно RBL5 клетками в течение 24 ч и их секрецию IFN γ в культуральную среду определяли с помощью ELISA. Секреция IFN γ ЦТЛ, стимулированных 424GC клеток указывает на то, что эти клетки, присутствующие SV40Tag-специфические пептиды в качестве MHCI-ограниченным образом. (Б) Совместное культивирование из 424GC и 424 фибробласты обрабатывали 107 Тэг ЦТЛ в чашке Петри в течение 48 ч. После этого, не прилипшие (мертвые клетки) были удалены. Левая, Совместное культивирование до лечения CTL; право, Совместное культивирование после лечения. Стрелки указывают на положение опухолевых клеток перед добавлением CTL
туморогенности желудка карцинома клеточных линий
Для определения туморогенности клеточных линий, различные числа (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) клеток вводили подкожно в мышей C57BL /6. Все клеточные линии были способны образовывать опухоли у 100% животных, если по меньшей мере 3 × 10 5 опухолевые клетки вводили (рис. 5А). Опухоли выросли почти в геометрической прогрессии без каких-либо задержек, пока они не достигли объема 300 мм 3. Нет отдаленные метастазы не могут быть обнаружены во время наблюдения. Вестерн-блот-анализ, проведенный на перевиваемых опухолей показал, что оба трансгены были выражены клеточных линий в естественных условиях
(данные не показаны). Удвоение времена опухолевых клеток в естественных условиях
при начальной загрузке опухоли 10 6 клеток колебалась от 7,2 (mGC8) и 13,8 дней (mGC3) (рис. 5А). В пробирке
, все клеточные линии выставлены аналогичные раз удвоением около 3 дней (рис. 5б). Кроме того, мы по сравнению образование подкожных опухолевых клеточных линий в дикого типа (C57BL /6) и трансгенных мышей. Никаких существенных различий не наблюдалось в взятием опухоли и рост опухоли на клеточной линии 424GC при подкожном введении в дикого типа или CEA424 /Tag-трансгенные мыши (рис. 6, а) и для mGC11 CEA клеток после инъекции в мышей дикого типа и CEA424 /Tag-СЕА-трансгенных мышей (рис. 6Б). Рисунок 5 В естественных условиях (А) и экстракорпоральное ростовых характеристик (В) мышиного карциномы желудка клеточных линий. У трех мышей каждый вводили в указанных дозах опухолевых клеток. Рост опухоли определяли количественно двух перпендикулярных измерений диаметра опухоли и расчета объема, как описано в разделе Материалы и методы. Для того, чтобы определить in vitro на характеристики роста, клетки выращивали в 24-луночных планшетах, начиная с указанными количествами клеток. В разные моменты времени собирали и подсчитывали клетки из трех лунок. Результаты представлены в виде среднее +/- стандартное отклонение (SD). Лучшие кривые подходят, а также раз двоение в дни (указаны в скобках) были рассчитаны с использованием программного обеспечения GraphPad.
Рисунок 6 Рост карциномы желудка клеточных линий в дикого типа и трансгенных мышей. 3 × 105 424GC клетки вводили подкожно в C57BL /6 и CEA424 /Tag-трансгенные мыши (А) или 3 × 105 mGC11CEA клетки вводили мышам C57BL /6 и CEA424 /Tag × CEA-двойной трансгенных мышей (В). Рост опухоли определяли количественно двух перпендикулярных измерений диаметра опухоли и расчета объема, как описано в разделе Материалы и методы. Результаты представлены в виде среднего +/- SD (n = 3).
Иммуногенность карциномы желудка клеточных линий
аналогичный рост опухолевых клеточных линий в дикого типа и трансгенных мышей, указывает на то, что отсутствие значительной иммунного ответа на либо опухолевый антиген (Tag, CEA) произошло в с опухолью мышей. Действительно, ни Тэг ЦТЛ не могут быть идентифицированы в селезенке с опухолью мышей дикого типа при прогрессивном подкожного роста Tag-экспрессирующих желудочных клеток карциномы (данные не показаны). Тем не менее, когда двойные клеточные линии трансгенные росли у мышей, СЕА-специфичные антитела могут быть идентифицированы в 6 мышей дикого типа C57BL /но не в СЕА-трансгенных мышей (рис. 7А). Кроме того, три иммунизацию мышей C57BL /6 с 106 сублимационной размораживают mGC8 опухолевых клеток с интервалом в неделю либо предотвратить рост подкожно вводили mGC8 живые клетки полностью или опухоль отросток была задержана в течение почти трех недель, в зависимости от введенной дозы опухолевых клеток (рис. 7Б , С). Эти эксперименты показывают, что линии опухолевых клеток являются иммуногенными при определенных условиях. Тем не менее, мыши C57BL /6 не спонтанно смонтировать эффективную опухоль без прогрессирования ограничения иммунного ответа на опухолевый антиген либо в процессе роста подкожной опухоли. Рисунок 7 иммуногенность клеток MGC. (А) Анти-СЕА антитела определяли в сыворотке мышей C57BL /6 и СЕА-трансгенных мышей с использованием проточной цитометрии. Все мыши имели опухоли постепенно расти без явного некроза после трансплантации и роста указанных клеточных линий, в течение 35-40 дней. Клетки mGC4CEA инкубировали с сывороткой указанных мышей при различных разведениях и связанных первичных антител были обнаружены с PE-конъюгированным антителом анти-мыши. (В, С) Три линии C57BL /6 мышей в каждой вводили подкожно три раза с интервалом в неделю с 1 × 106 клеток mGC8 убитых двух циклов замораживания-оттаивания. Через две недели после последней вакцинации мышей заражали путем инъекции 1 × 106 (В) и 3 × 106 (C) живут mGC8 клеток соответственно (заполненные кружки). В качестве контроля, опухолевые клетки вводили в неиммунизированных мышей (белые кружки). Объемы опухолей рассчитывали, как описано в Материалы и методы секции. Результаты представлены в виде средних значений +/- SD.
Обсуждение
Основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы создать терапевтическую модель рака желудка у иммунокомпетентных мышей, которая будет обеспечивать животную модель для оценки противоопухолевого иммунитета и иммунотерапевтические стратегии.

• Первичная желудочная неходжкинской лимфомой в китайских пациентов: клинические характеристики и прогностич…
• GASTRICHIP: D2 резекция и гипертермическая внутрибрюшинного химиотерапии при местно-распространенном раке желудк…