Karakterisointi mahan adenokarsinooman solulinjoja perustetaan CEA424 /SV40 T-antigeenin-siirtogeenisiä hiiriä tai ilman ihmisen CEAtransgene

luonnehdinta mahan adenokarsinooman solulinjoja perustetaan CEA424 /SV40 T-antigeenin
-transgenic hiiriä tai ilman ihmisen CEA
siirtogeenin
Abstract
tausta
Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti. Potilaat, joilla mahalaukun syövän myöhäisessä taudin vaiheessa on huono ennuste, rajallisen tehokkuuden käytettävissä hoitoja. Siksi uusien hoitomuotojen, kuten immunoterapian hoitoon mahasyövän on äärimmäisen tärkeää. Koska käytettävyys nykyisten prekliinisissä arviointia varten immunoterapioiden mahalaukun adenokarsinooman on rajallinen, tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää hiiren in vivo
malleja, jotka mahdollistavat vaiheittaisen parantamista immunoterapioiden mahasyövän. Tool Menetelmät
Koska ei hiiren mahan adenokarsinooman solulinjoja on saatavilla loimme neljä solulinjat (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) spontaanisti kehittää kasvaimia CEA424 /SV40 T-antigeenin (CEA424 /Tag) hiirissä ja kolme johdetut solulinjat double-siirtogeenisten jälkeläiset on CEA424 /Tag hiiret astutetaan ihmisen syöpä -antigeeni (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) hiirillä (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag on siirtogeeninen C57BL /6-hiiren -kanta Tag valvonnassa on -424 /-8 bp CEA-geenin promoottori, joka johtaa kehitystä invasiivisen adenokarsinooma rauhaslimakalvossa mahassa. Kasvainsolulinjoja perustetaan CEA424 /Tag-CEA hiiret ilmentävät hyvin määritelty kasvaimen antigeeniä CEA valvonnassa sen luonnollisen säätelyelementit.
Tulokset
epiteelin alkuperä tuumorisolujen osoitettiin morfologiset kriteerit, mukaan lukien läsnä musiinin solujen sisällä ja ilmentyminen solun adheesiomolekyylien EpCAM ja CEACAM1. Kaikki solulinjat johdonmukaisesti ilmaista siirtogeenien CEA ja /tai Tag ja MHC-luokan I molekyylien johtaa alttius hajoamiselle Tag CTL in vitro
. Huolimatta esittäminen CTL-epitooppien johdettu siirtogeenin tuotteista kasvaimen solulinjojen olivat tuumorigeenisia kun oksastettu C57BL /6, CEA424 /Tag tai CEA424 /Tag-CEA-transgeenisiä isännät, eikä merkittäviä eroja kasvaimen ottaa ja kasvainten kasvua havaittiin eri isännät. Vaikka ei ole spontaani kasvaimen hyljinnän havaittiin, rokottaminen C57BL /6-hiirten kanssa lysaatit mahalaukun sinoomasolulinjoja suojattu C57BL /6-hiiriä kasvaimen haaste, osoittaa tuumorigeenisyyden kasvaimen solulinjojen siirtogeenisissä hiirissä H-2 b haplotyypin.
Päätelmä
Nämä tuumorisolulinjoissa oksastettu eri syngeenisissä isännät osoittautuu erittäin hyödyllistä optimoida immunoterapia hoito lopullisesti testata siirtogeenisiä eläimiä kehittämisessä ensisijainen mahakarsinoomat.
Tausta
mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syöpä maailmanlaajuisesti [1]. Se on usein havaitaan vasta pitkälle edenneessä vaiheessa; näin ollen 5-vuoden eloonjäämisluvut ovat alhaiset (10- 20%). Koska paikallinen invaasio ja metastaasi, sädehoidon tai kemoterapian ei merkittävästi lisää pituutta tai elämänlaatua potilailla, joilla on edennyt mahasyöpä. Siksi uusien neoadjuvant ja adjuvantti hoitotapoja tarvitaan. Immunoterapia voi olla lupaava vaihtoehto vaihtoehto. Useita immunoterapian lähestymistapoja, kuten adoptiivisen siirron kasvaimen spesifisten T-solujen, ja rokotuksen joko määrittelemätön kasvaimen antigeenejä, jotka ovat peräisin kasvaimeen lysaateista ja kasvainsolulinjoja tai määritelty kasvainantigeenejä yleisesti esittämä dendriittisolut arvioidaan eri syöpiä [2, 3] . Sillä syöpien immunoterapia ei otettu vakavasti huomioon, koska käsite, joka mahasyövän on heikosti immunogeeninen. Näin ollen vain pieni määrä kliinisiä immunoterapian tutkimuksissa on raportoitu [4-7]. Lisäksi vain rajoitettu määrä kasvaimeen liittyvien antigeenien kanssa potentiaalista käyttöä immunoterapiassa on tunnistettu [8-11]. Näin ollen valmiutta immuunijärjestelmä tunnistaa ja poistaa mahasyövistä ei juuri tunneta. Perehtyä tehoa eri immunoterapioiden hoitoon mahasyövän ja selvittämiseksi taustalla olevan mekanismin aiheuttama immuunivasteen eläinmalleissa mahalaukun adenokarsinooman ovat välttämättömiä.
Tätä varten useat ryhmät myös meidän äskettäin perustettu siirtogeenisiä tai knock uloskirjautuminen hiirikantoja joka mahalaukun adenoomia tai adenokarsinooman eri puolilla vatsan jälkeen eri latenssit [12]. Olemme kehittäneet siirtogeenisiä mahakarsinoo- C57BL /6 hiirimallissa perustuvat SV40 suuri T-antigeenin (SV40 Tag) siirtogeenin ohjaa ihmisen syöpä -antigeeni (CEA) -geenin promoottori (-424--8 n translationaalisen aloituskohdan) [13 ]. 100% eläimistä, dysplastic crypt muodostuminen mahalaukun limakalvon havaitaan mahanportin alueella jo 30 päivää vanha CEA424 /SV40 Tag-siirtogeenisiä hiiriä. Dysplasia etenee invasiivisia karsinoomia ja päivällä 50 koko mahanportin mahalaukun limakalvo on korvattu syöpä soluja. Vuotiaista 90-110 päivää siirtogeeniset hiiret tulevat kuolemaisillaan ja kuolevat todennäköisesti aliravitsemuksen takia tukkeutuminen pylorus [13]. Valvonta Tag ilmentymisen minimaalinen CEA-geenin promoottori mahdollistaa kasvaimen ohjaama ekspressio CEA ylittämällä CEA424 /SV40 Tag-siirtogeenisiä hiiriä ihmisen CEA
-transgenic C57BL /6-hiiret, jotka ilmentävät CEA siirtogeenin samanlainen spatiotemporaalinen ilmaus kaavaa todettu ihmisillä [13, 14]. Ihmisen tuumorimarkkeri CEA ilmentyy monissa ihmisen adenokarsinoomia mukaan lukien yli 50% mahakarsinoomat [15, 16]. CEA käytetään yhä enemmän kohdeantigeenina erilaisia ​​vasta-aine- ja soluvälitteinen kasvain -immunoterapialähestymistavat [17-19]. CEA ja Tag ovat sopivia immunoterapiaa kohdeantigeeniä, koska useita T-soluepitooppeja näiden antigeenien on havaittu C57BL /6-hiirissä [20-22]. Vaikka nämä siirtogeenisen hiiren kantoja peilaavat hyvin tarkasti mahalaukun adenokarsinoomaa kehittyminen ihmisellä, kokeilu näillä hiirillä on melko aikaa vievää ja kallista johtuen vaikeuksista määrittää kasvaimen kasvua ja vaatimus jalostukseen siirtogeenisiä hiiriä. Sen vuoksi on toivottavaa saada syngeenisiin transplantable kasvaimen järjestelmän mahalaukun adenokarsinooman immunokompetenteilla hiirillä optimoimiseksi tietylle immunoterapia protokolla, ennen kuin se on arvioitava siirtogeenisiä hiiriä. Ohessa kuvataan hiiren mahan adenokarsinooman solulinjoja perustetaan spontaanisti kehittää kasvaimia SV40 Tag-siirtogeenisiä hiiriä, jotka ovat tuumorigeenisia molemmissa syngeenisissä villityypin ja siirtogeeniset hiiret. Tool Menetelmät
Hiiri kantoja ja solulinjat
CEA424 /Tag- siirtogeenisiä hiiriä (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgeenisiä hiiriä (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm, CEA2682) ja F1-hiiriä risteytys CEA424 /Tag-siirtogeenisiä ja CEA-siirtogeenisiä hiiriä on kuvattu aikaisemmin [13, 14]. Samaan transgeenisissä linjoissa on takaisinristeytettiin C57BL /6-hiirten (H-2 b) yli 15 sukupolven ajan. Siirtogeeniset linjat sekä C57BL /6-hiiriä (Charles River, Sulzfeld, Saksa) oli kasvatettu ja pidettiin vakiona patogeenivapaissa olosuhteissa eläimen laitoksen Institute for Surgical Research, Ludwig-Maximilians-University of Munich. Eläin kokeet tehtiin hyväksynnän jälkeen paikallisen eläinten hyvinvoinnin komitea. Tuumoreita ja immunogeenisuuden määrityksiä hiiriä käytettiin 8-12 viikon iässä. Afrikkalainen vihreän apinan munuaisen Cos7L solulinja saatiin American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). BALB /c-johdettuja fibrosarkooma Meth-A ystävällisesti W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hampuri). Meth-A-CEA-solut saatiin transfektoimalla Meth-A-solujen kanssa pRc /CMV-CEA ilmentämisplasmideja käyttäen FuGENE ™ 6-transfektioreagenssia (Roche Molecular Biochemicals, Sveitsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Meth-A-cTag ja RBL5 /T transfektantit aikaisemmin kuvatulla tavalla [23].
Perustaminen mahalaukun sinoomasolulinjoja
mahakarsinoomat käytetään osoittamaan tuumorisolulinjat saatiin 8 eri, 13 viikkoa vanhoja hiiriä. Neljä johdettu CEA424 /Tag-siirtogeenisiä hiiriä ja 4 CEA424 /tag-CEA-double siirtogeenisiä hiiriä. Nimet johdetut solulinjat Jälkimmäisessä hiiriä on merkitty yläindeksi "CEA". Kaikki viljelmät suoritettiin RPMI1640 täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (FCS "Gold", PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1 mM natriumpyruvaattia (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), jota myöhemmin kutsutaan nimellä kasvaimen keski- (TM). Kasvaimen kudokset pestiin perusteellisesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jota oli täydennetty 200 ug /ml gentamisiinia ja 2,5 ug /ml amfoterisiini B: tä (GIBCO /Invitrogen), leikattiin 1 mm 3 kappaletta veitsellä ja päällystetty kudosviljelmässä pullot, jotka sisältävät TM. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 3-4 päivä. Epiteelisolujen ja fibroblastien kasvaa kudoksen kappaleet erotettiin solu kaavinta, valikoiva trypsinaatiolla ja selektiivinen johtamisella on 1000 U /ml kollagenaasia ja 500 U /ml hyaluronidaasia (Biochrom, Berliini, Saksa). Aikana dissosiaatio, pulloja valvotaan käännettyä mikroskooppia, ja digestio lopetettiin, kun fibroblastit, mutta ei epiteelin solut irrotettiin (trypsiini) tai päinvastoin (kollagenaasi /hyaluronidaasin). Tämä menettely toistettiin viikoittain, kunnes kaikki fibroblastit poistettiin kasvain soluviljelmissä. Aikana sukupolven 424GC solulinjan, joka on fibroblastiviljelmässä perustettiin saastuttamaan fibroblasteista (424 fibroblasteja). Sferoidia muodostunut 5-7 päivän kuluessa kylvö 0,5 × 10 3 mGC8 solujen Noble-agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa) pinnoitettu 96-kuoppaisille levyille (TPP-Biochrom, Berliini, Saksa) 200 ul TM joka korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka toinen päivä. Arvioida Solujen elinkelpoisuus pinnalla palloset, sferoidit inkuboitiin FITC-anneksiini V (anneksiini V FITC Apoptosis Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Saksa) havaitsemiseksi apoptoottisten solujen tai propidiumjodidilla tunnistaa nekroottista solut mukaan valmistajan suositusten mukaisesti.
Virtaussytometria analysoi
pinta-värjäystä solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin PBS: ään /0,5% w /v naudan seerumialbumiinia (BSA), jota oli täydennetty 0,02% w /v natrium- atsidia. Induktioon MHC-molekyylien, soluja inkuboitiin 20 ng /ml interferoni-γ (IFNy, Peprotec, Lontoo, Iso-Britannia) 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Ei-spesifinen sitoutuminen vasta-aineiden Fc-reseptoreihin estettiin esi-inkuboimalla soluja 1 ug /10 6 solujen anti-CD16 /CD32 monoklonaalinen vasta-aine (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Saksa) 15 min . Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 0,5 ug /10 6 soluja mAb kiinnostavia 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pestiin kahdesti ja tarvittaessa tämän jälkeen saatetaan reagoimaan toisen vaiheen vasta-ainetta 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa . Solut pestiin kahdesti ja analysoitiin käyttäen FACScan (BD, Mountain View, CA). Kuolleet solut poissuljettu propidiumjodidivärjäys. Seuraavat reagenssit ja mAb: t vastaan ​​hiiren antigeenejä BD Pharmingen käytettiin: fykoerytriini- (PE) konjugoitua hiiren IgG 2a anti-IA b, biotinyloitua hiiren IgG 2a anti-H-2D b PE-konjugoitu hiiren IgG: 2aanti-H-2K b, PE-konjugoitu anti-hiiri-CD80 /B7-1, PE-konjugoidun rotan IgG: 2a anti-hiiri-CD40, PE-konjugoidun rotan IgG 2a anti-hiiri CD86 /B7-2, fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua, Armenian hamsterin IgG 2 anti-hiiri CD80 /B7-1. FITC-konjugoidun rotan IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugoidulla rotan IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugoidulla hiiren IgG 2a anti-rotta SIRP, FITC-konjugoitua Armenian hamsterin IgG 2anti-KLH ja PE-konjugoidulla rotan IgG 2amAb toimi isotyyppikontrolleja. Hiiren anti-hiiri CEACAM1 mAb CC1, rotan anti-hiiri CEACAM1 AgB10 [24] ja rotan anti-hiiren E-kadheriinin ja anti-hiiri EpCAM mAb: t olivat ystävällinen lahja K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité Berliini, ja P. Ruf, Trion Research, Munich, vastaavasti. Rajat reaktiivinen hiiren anti-humaani CEACAM mAb 3.4.17 (spesifinen ihmisen CEA /CEACAM5 hiiren) ostettiin GENOVAC (Freiburg, Saksa). Hiiren vasta-aineet havaittiin PE-konjugoidulla vuohen anti-hiiri-IgG, rotan vasta-aineita, FITC-konjugoidulla aasin anti-rotta-IgG: tä (DAKO).
Havaitseminen CEA: n ja SV40 Tag Western-blottauksella
Eksponentiaalisesti kasvavat mahan karsinoomasoluja , Cos7L solut, Cos7L-CEA transfektantit, Meth-A-solujen ja Meth-A-cTag transfektanttien jotka ilmentävät typistetty sytoplasmisesti sijaitsee SV40 Tag kerättiin trypsinaatiolla. Solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja hajotettiin tiheydessä 10 6 solua /ml hajotuspuskuria. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Solu-uutteita, jotka vastaavat 10 ug proteiinia erotettiin elektroforeesilla 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), siirrettiin polyvinyliden fluoria kalvoja ja inkuboitiin 10 ug /ml anti-humaani-CEACAM mAb 4.3.17 tai 1: 100 laimennettua hamsterin anti-SV40 Tag antiseerumilla (eräänlainen lahja K.-H. Scheidtmann, University of Bonn). Sitoutuneet vasta-aineet saatettiin reagoimaan piparjuuriperoksidaasiin-leimatut sekundääriset vasta-aineet ja visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi-pohjainen havaitsemisjärjestelmä (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Saksa).
Cell kaksinkertaistaa ajan määrittämiseksi
In vitro
kaksinkertaistaa kertaa solulinjoista määritettiin maljaamalla mahakarsinoo- solut 24-kuoppalevyille TM ilmoitettuina alkaa solujen määrä ja laskenta solun näytteitä kolmen kuopan jälkeen kevyesti trypsinoimalla joka 3 päivä ja 21 päivää. In vivo
kaksinkertaistumisaikaa laskettiin tuumorin tilavuuden mittausten (katso alla) istuttamisen jälkeen kolmella eri lähtökohdat solujen määrä (kolme hiirtä ryhmää kohti). Kaksinkertaistumisaikaa laskettiin log-vaiheen kasvun käyriä.
Tuumorigeenisyyteen ja immunogeenisyyden solulinjojen
tuumoreita arviointia kasvaimen solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja 50 ui solususpensiot, jossa on esitetty solujen määrä injektoitiin ihonalaisesti ajellaan oikeaan kylkeen hiirillä. Voit selvittää immunogeenisyyden, 10 7 kasvainsolut /ml hajotettiin kahden peräkkäisen jäädytys ja sulatus syklien. Hiiret immunisoitiin neljä kertaa viikon välein 10 6 hajotettiin kasvainsoluja oikeaan kylkeen. Kolme viikkoa myöhemmin hiiret altistettiin ihonalaisella 3 x 10 6 elinkelpoisia tuumorisoluja vasempaan kylkeen. Koeryhmät koostuivat 4-6 hiirillä. Kasvainten kehittymiseen seurasi järjestysnumero mittaukset kasvaimen koon ja kasvaimen tilavuus laskettiin yhtälön mukaisesti: kasvaimen tilavuus (mm 3) = d 2 x D /2, jossa d ja D olivat lyhin ja pisin kasvaimen halkaisija, vastaavasti. Eläimet lopetettiin, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 300 mm 3.
Generation Tag-spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) ja stimulaation mahalaukun sinoomasolulinjoja
CTL: t tuotetaan, kuten aiemmin on kuvattu [23] . Lyhyesti, hiiret ihonsisäisesti inokuloitiin 1 um kultahiukkasia päällystetty Tag ekspressioplasmidin (BMG /CT-Ag.1 [23]) osaksi ajeltu vatsan ihoon helium paineessa (200 psi) virtansa biolistinen laite (Helios geenipyssyllä; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Saksa). Pernasolut saatiin 14 päivää rokotuksen jälkeen stimuloitiin uudelleen viikoittain käyttäen säteilytettyjä RBL5 /T transfektanttien RPMI-1640/10% FCS, johon oli lisätty 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T on Rauscher-virus-transformoitu T-lymfooman solulinja, joka on johdettu C57BL6 (H-2b) hiiri on transfektoitu SV40 Tag ekspressioplasmidin. Tuottamaan epitooppi-spesifisten CTL, pernasolut otetaan 10 päivää rokotuksen jälkeen stimuloitiin uudelleen in vitro säteilytetyillä, Tag peptidilisätyt RBL5 soluja. T1, T2 /3 ja T4 epitooppispesifisyys CTL kontrolloitiin määrittämiseksi IFNy-sisällön media stimuloitaessa peptidillä pulssitetun kohdesoluihin käyttämällä ELISA: aa.
Sytokiinin tunnistus ELISA
sieppaamiseksi ja havaitseminen IFNy supernatanteista tavanomaisilla sandwich-ELISA, käytimme mAb R4-6A2 ja biotinyloitu mAb XMG1.2, vastaavasti (BD Pharmingen). Extinction analysoitiin 405/490 nm TECAN mikrolevyn ELISA-lukijaa (TECAN Crailsheim, Saksa) kanssa EasyWin ohjelmisto (TECAN). Toteamisraja on ELISA IFNy oli 20 pg /ml.
Tulokset
perustaminen ja fenotyypin mahalaukun sinoomasolulinjoja myynnissä maassa 8 mahakarsinoo- näytettä 7 solulinjat voitaisiin perustaa. Neljä solulinjat peräisin CEA424 /Tag-siirtogeenisiä hiiriä (424GC, miehestä hiiri, mGC3, nainen, mGC5, miespuolinen, ja mGC8, naaras) ja kolme riviä CEA424 /Tag-CEA-transgeenisiä hiiriä (mGC2 CEA, miespuolinen, mGC4 CEA, miespuolinen, mGC11 CEA, naispuolinen). Tarvittava aika saada puhtaita epiteeli- soluviljelmiä vaihtelivat suuresti (keskiarvo 6 kuukautta, alue 3-16 kuukautta). Vaikka kasvainsolut kasvavat tarttuvien solujen viljelmässä, niillä on taipumus muodostaa aggregaatteja sijaan leviää viljelyalustasta (Fig. 1A). Epiteelin alkuperä tuumorisolujen osoitettiin morfologiset kriteerit, mukaan lukien läsnä musiinin solujen sisällä (Fig. 1A) ja ilmaisu analyysi proteiinin yleisesti ilmaistuna epiteelisoluissa (EpCAM, E-kadheriinin, CEACAM1) (Fig. 2A) . Pitoisuus on pienentynyt musiinia havaittiin kaikissa solulinjoissa verrattuna sisällön normaaleissa mahan epiteelisoluissa, mutta samanlainen kuin kasvainsoluissa sisällä mahakarsinoo- siirtogeenisissä hiirissä (Fig. 1A ja [13]). Kaikki solulinjat näytetään CEACAM1 ja EpCAM pinnallaan lukuun ottamatta mGC11 CEA, mikään niistä ilmaistaan ​​E-kadheriinin (kuvio. 2A ja tietoja ei ole esitetty). Kaikki solulinjat ilmensivät MHC luokan I H-2K ja, ja paljon alemmalla tasolla, H-2D molekyylien (Fig. 2B). Expression Molempien proteiinien voimakkaasti parannettu IFNy stimulaatiota. O MHC luokan II molekyylien (I-Ab) havaittiin (Fig. 2B ja tietoja ei ole esitetty). CD54, CD80, CD86 tai CD95 ei havaittu millään solulinjassa (määritystuloksia ei ole esitetty). Kuvio 1 morfologia mahalaukun sinoomasolulinjoja kasvanut yksikerroksisiin tai kolmiulotteinen pallosia. (EN) solulinjat osoittavat hieman eri epiteelin morfologia. Useimmat solut kaikista solulinjat sisältävät ominaisuuden intrasellulaarisen vacuole (nuolet), joka todennäköisesti sisältää mucinous materiaali värjätään punainen PAS menetelmällä (viimeinen kuva oikealla alempi paneeli). (B) Sferoidiviljelmiä muodostettu viljelemällä mGC8 kasvainsolujen pehmeillä agar: vasen, vaihe kontrasti; oikea, fluoresenssivärjäyksellä nekroottisia soluja propidiumjodidilla (punainen) ja apoptoottisten solujen FITC-leimatun anneksiiniV (vihreä, merkitty nuolenpäin) kuvatulla tavalla "Materiaalit ja menetelmät". Suurennus: säädintä vastaavat 10 pm. MGC, hiiren mahasyöpä.
Kuvio 2 ilmentyminen solun pinnalla epiteelisolujen markkereita (A) ja MHC-luokan I ja II molekyylejä (B). Mahalaukun sinoomasolulinjoja reagoimaan joko PE-leimattua (H-2Kb, H-2Db, I-Ab) tai leimaamattoman mAb: itä (CEACAM1, E-kadheriinin, EpCAM), jota seurasi inkubaatio PE-leimattua anti-hiiri-IgG- tai FITC -leimatun anti-rotta-IgG ja analysoitiin virtaussytometrialla. Histogrammit näyttää saadut tulokset vasta-aineiden kyseessä olevat antigeenit kanssa (avoin harmaa) tai ilman (avoin musta) ennen IFNy stimulaatiota ja merkityksetön antigeenejä (harmaa täynnä käyriä).
Sen määrittämiseksi potentiaalia solulinjoja voidaan käyttää sukupolven kolmiulotteinen kasvainmalleissa analysoitiin kasvainsolujen sferoidi muodostumista in vitro. Kuten kuviossa. 1B solulinjat muodostunut kompakti kasvainsolun pallosia kuluttua 8 päivän viljelyn kun 103 solua ympättiin pehmeä agar-pinnoitettu 96-kuoppaisille levyille. Vain vähäisiä sisäisiä kokeellinen vaihtelua havaittiin kokoa koskevat palloset. Propidiumjodidilla ja FITC-leimattua anneksiini V osoittaa, että ainakin pintakerros pallosia koostui elävien solujen kanssa hyvin vähän kuolleet solut on kiinnitetty siihen (Fig. 1 B).
Transgeeniekspressio, jonka mahan sinoomasolulinjoja
CEA ja Tag voivat toimia kasvaimen antigeenejä (TSA) tai kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) elinsiirron jälkeen vasta perustetun kasvainsolulinjojen immunokompetenteilla syngeenisissä C57BL /6 ja CEA tai Tag-siirtogeenisiä hiiriä, vastaavasti. Vaikka instrumentaalinen kasvaimen muodostumisessa, Tag geenin ilmentyminen ei aina löytyy kasvainsolulinjoissa, jotka ovat peräisin Tag-siirtogeenisten hiirten, kuten TRAMP kasvainsolulinjoissa [25]. Tämä sai meidät analysoimaan ilmaisun ja MHC-luokan I-rajoitettu esittely Tag siirtogeenin sekä ilmentymistä CEA vakiintuneiden mahalaukun sinoomasolulinjoja. CEA ilmentyminen solun pinnalla analysoitiin solulinjoissa, jotka ovat peräisin mahalaukun kasvaimet kaksinkertainen siirtogeenisten hiirten virtaussytometrialla ja Western blot-analyysi. Vaikka ilmentyminen CEA siirtogeenin säätelee koko promoottorialueen ihmisen CEA-geenin ilmentymisen Tag ohjataan minimaalinen -424 /-8 bp CEA-promoottori (Fig. 3A). Kaikki kolme double-siirtogeenisiä solulinjat ilmensivät CEA solun pinnalla (kuvio. 3B). Mahan karsinoomasolulinja mGC2 CEA siirtogeeni ekspressoidaan CEA osoitti molekyylipaino 180 kDa samanlainen kuin löytyy SV40-transformoitu Afrikkalainen vihreän apinan munuaissolut stabiilisti transfektoitu CEA ekspressiovektoriin ja CEA todettu ihmisillä. Kuten odotettua, ei CEA havaittu 424GC soluissa, jotka on perustettu peräisin CEA-negatiivinen Tag-siirtogeenisen hiiren (Fig. 3C). Tag havaittiin ilmaistaan ​​Western blotting ja immunofluoresenssianalyysillä kaikissa solulinjoissa, jotka ovat peräisin yhden ja kahden hengen hiiret (Fig. 3d ja tietoja ei ole esitetty). Tämä havainto tukee myös alkuperä solulinjojen mahasta karsinoomat. Lisäksi 424GC solulinja tehokkaasti esitetty endogeenisesti käsitelty Tag-peptidit, erityisesti T1 epitoopin, joka MHC-I rajoitetulla tavalla määritettynä induktio IFNy eritystä byTag CTL (Fig. 4A). Lisäksi solulinjoja tehokkaasti tappoi Tag-spesifisten CTL sytotoksisia määrityksissä (Fig. 4B). Kuvio 3 ilmentäminen CEA ja Tag mahalaukun karsinooma johdetut solulinjat CEA424 /Tag- tai CEA424 /Tag x CEA-transgeenisiä hiiriä. (A) rakenne CEA ja CEA424 /Tag siirtogeenien. Eksonit 1-10 ihmisen CEA-geenin sisällä insertti kosmidikloonista cosCEA1 [14] esitetään värikoodattuja laatikot (vaaleansininen, johtaja, punainen, IGV kaltainen domeeni, sininen HVK kaltaisen domeenin, harmaa, transmembraanidomeeni , valkoinen, 5 'ja 3'-eksonit. Rinnakkaistoimenpiteillä vektorin sekvenssit on merkitty mustat laatikot. sijainti CEA minimaalisen promoottorin läsnä SV40 Tag-geeni siirtogeeni katkoviivoin, nimet transgeenisissä linjoissa on esitetty vasemmassa marginaalissa. (B) Virtaussytometria suoritettiin merkinnöissä ilmoitettu solujen joko CEA-spesifinen mAb 26/3/13 (täytetty käyrät) tai isotyyppiyhteensopivan vasta-aineella (avoimet käyrät) ja sen jälkeen PE-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineita. (C, D) Western-analyysiä varten 10 ug kokonais-proteiinin uutteita 424GC tai mGC8 solujen perustetaan CEA424 /Tag-siirtogeenisiä hiiriä ja mGC2CEA ja mGC4CEA soluja CEA424 /Tag x CEA-transgeeniset hiiret olivat koko erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, siirrettiin membraanille ja annettiin reagoida CEA-spesifisten mAb 26/3/13 (C) tai hamsterin polyklonaalista anti-Tag-vasta-aineita (D). Otteet Cos7L-CEA ja Meth-A-solut transfektoitiin stabiilisti ekspressiovektoreilla, jotka koodaavat CEA: ta tai Tag puuttuu alueen kanssa tumalokalisaatiosignaalin (cTag) toimi positiivisena kontrollina. Koot proteiinimarkkereita osoitetaan vasemmassa marginaalit.
Kuva 4 MHC-luokka I-rajoittunut esittely Tag epitooppien hiiren mahan sinoomasolulinjoja. (A) Epitooppi-spesifinen CTL C57BL /6-hiirten DNA-immunisaation Tag ekspressiovektoriin ja sen jälkeen laajeneminen in vitro stimuloitaessa Tag peptidin ladattu RBL5 soluja inkuboitiin säteilytettyjen 424GC, 424 fibroblastit, RBL5 ja Tag T1, T2 /3 tai T4 peptidilisätyt RBL5 solujen kanssa 24 tunnin ajan ja niiden IFNy erittymiseen viljelyalustaan ​​määritettiin ELISA: lla. Eritystä IFNy CTL stimuloidaan 424GC solujen osoittaa, että nämä solut läsnä SV40Tag peptideillä käytettäessä MHCI-rajoitetusti. (B) yhteisviljelmä 424GC ja 424 fibroblasteja käsiteltiin 107 Tag-spesifisiä CTL-petrimaljaan 48 tuntia. Tämän jälkeen tarttumattomat (kuolleet) solut poistettiin. Vasen, yhteisviljelmä ennen CTL hoitoa; oikea, yhteisviljelmä hoidon jälkeen. Nuolet osoittavat asemaa kasvainsolujen ennen lisäämistä CTL.
Tuumorigeenisyyden mahalaukun sinoomasolulinjoja
määrittämiseksi tuumorigeenisyyden solulinjat, erilaiset numerot (1 x 10 5; 3 x 10 5; 1 x 10 6) soluja injektoitiin ihonalaisesti C57BL /6-hiiristä. Kaikki solulinjat pystyivät muodostamaan kasvaimia 100% eläimistä, jos ainakin 3 x 10 5 kasvainsoluja injektoitiin (Fig. 5A). Kasvaimet kasvoivat lähes eksponentiaalisesti ilman viivettä, kunnes ne saavuttivat tilavuuden 300 mm 3. Ei etäispesäkkeitä voitu havaita aikana havainnon ajan. Western blot-analyysi suoritettiin siirrettyjen kasvainten osoitti, että molemmat siirtogeenit ilmaistiin solulinjoja in vivo
(tuloksia ei ole esitetty). Kahdentumisajoista kasvainsolujen in vivo
alku-kasvain kuormitus 10 6 solua vaihteli välillä 7,2 (mGC8) ja 13,8 päivää (mGC3) (Fig. 5A). In vitro
, kaikki solulinjat osoittivat samanlaisia ​​kaksinkertaistuminen kertaa noin 3 päivää (kuvio. 5B). Olemme edelleen verrattuna ihonalainen kasvain muodostumista solulinjojen villityypin (C57BL /6), ja siirtogeeniset hiiret. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu kasvaimen ottaa ja kasvaimen kasvua solulinjan 424GC, kun injektoitiin subkutaanisesti villityypin tai CEA424 /Tag-siirtogeenisiä hiiriä (Fig. 6A) ja mGC11 CEA-solujen injektion jälkeen villityypin ja CEA424 /Tag-CEA-transgeenisiä hiiriä (Fig. 6B). Kuvio 5 In vivo (A) ja in vitro kasvuominaisuudet (B) hiiren vatsan sinoomasolulinjoja. Kolme hiirtä kussakin injektoitiin ilmoitetun kasvainsolujen annosta. Kasvaimen kasvu määritettiin kvantitatiivisesti kahden kohtisuorassa mittaukset kasvaimen halkaisija ja määrän laskentaa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Määrittää in vitro kasvua ominaisuudet, soluja kasvatettiin 24-kuoppalevyillä alkaen osoitetun solujen määrä. Eri ajankohtina solujen kolminkertaisista kuopista otettiin talteen ja laskettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona +/- standardipoikkeama (SD). Best fit käyrät sekä kaksinkertaistaa kertaa päivässä (suluissa) laskettiin GraphPad ohjelmistoa.
Kuva 6 Growth mahalaukun sinoomasolulinjoja villityypin ja siirtogeeniset hiiret. 3 x 105 424GC solua injektoitiin ihonalaisesti C57BL /6 ja CEA424 /Tag-siirtogeenisiä hiiriä (A) tai 3 x 105 mGC11CEA solua injektoitiin C57BL /6 ja CEA424 /Tag x CEA-double siirtogeenisiä hiiriä (B). Kasvaimen kasvu määritettiin kvantitatiivisesti kahden kohtisuorassa mittaukset kasvaimen halkaisija ja määrän laskentaa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Tulokset on esitetty keskiarvona +/- SD (n = 3).
Immunogeenisyys mahalaukun sinoomasolulinjoja
samanlainen kasvaimen kasvun solulinjojen villityypin ja siirtogeeniset hiiret osoittavat, että mitään merkittävää immuunivastetta joko kasvaimen antigeeni (Tag, CEA) esiintyi kasvaimen hiirille. Itse asiassa ei ole Tag-spesifiset CTL: t voidaan tunnistaa pernassa kasvaimen omaavien villityypin hiiriin etenevä ihon alle kasvua Tag-ilmentävien mahakarsinooman soluista (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, kun kaksinkertainen siirtogeenisiä solulinjoja kasvoi hiirillä, CEA-spesifiset vasta-aineet voidaan tunnistaa villityypin C57BL /6-hiiret, mutta ei CEA-transgeenisiä hiiriä (Fig. 7A). Lisäksi kolme immunisaatiota C57BL /6-hiirissä, joilla on 106 jäädytys-sulatettiin mGC8 kasvainsoluja viikon välein joko estivät kasvun injektoidaan subkutaanisesti elävien mGC8 soluja kokonaan tai kasvaimen kasvulta viivästyi lähes kolme viikkoon riippuen injektoidun kasvainsoluannosta (Fig. 7B , C). Nämä kokeet osoittavat, että kasvain solulinjat ovat immunogeenisiä tietyissä olosuhteissa. Kuitenkin, C57BL /6-hiiret eivät spontaanisti asentaa tehokas kasvaimen etenemistä-rajoittavia immuunivasteen joko tuumoriantigeeni aikana ihonalaisen kasvaimen kasvun. Kuva 7 immunogeenisyys MGC soluja. (A) Anti-CEA-vasta-aineet määritettiin seerumin C57BL /6 ja CEA-transgeeniset hiiret virtaussytometriaa käyttämällä. Kaikki hiiret olivat progressiivisesti kasvava kasvaimia ilman avointa kuolion elinsiirron jälkeen ja kasvun ilmoitettu solulinjojen 35-40 päivää. mGC4CEA soluja inkuboitiin seerumissa osoitti hiirillä eri laimennoksina ja sitoutuneet ensisijainen vasta-aineet havaittiin PE-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aine. (B, C) Kolme C57BL /6-hiirten kukin, injektoitiin ihon alle kolme kertaa viikon välein ja 1 x 106 mGC8 soluja kuoli kaksi jäädytys-sulatus-sykliä. Kaksi viikkoa viimeisen rokotuksen jälkeen hiiret altistettiin injektoimalla 1 x 106 (B) ja 3 x 106 (C) elävät mGC8 soluja, vastaavasti (täytetyt ympyrät). Kontrollina, kasvaimen solut injektoidaan ei-immunisoiduissa hiirissä (avoimet ympyrät). Kasvaintilavuudet laskettiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät osassa. Tulokset esitetään keskiarvoina +/- SD.
Keskustelu
päätavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli luoda terapeuttinen malli mahasyövän immunokompetenteilla hiirillä, joka tarjoaisi eläinmallissa arvioida kasvaimen vastaisen immuniteetin ja immuuniterapeuttista strategioita.

• Ensisijainen mahalaukun non-Hodgkin-lymfooman Kiinan potilaat: kliiniset ominaisuudet ja ennustavat tekijät
• GASTRICHIP: D2 resektio ja hypertermistä vatsaonteloon kemoterapiaa paikallisesti edenneessä mahakarsinoo-: satunnaistettu ja monikeskustutkimus vaiheen III tutkimuksessa