Caratterizzazione di linee cellulari di adenocarcinoma gastrico stabiliti da /SV40 T topi transgenici antigene-CEA424 con o senza un essere umano CEAtransgene

Caratterizzazione di linee cellulari di adenocarcinoma gastrico stabiliti da CEA424 /SV40 antigene T
topi -transgenic con o senza CEA umana
transgene
Abstract
sfondo
carcinoma gastrico è uno dei tumori più frequenti in tutto il mondo. I pazienti con cancro gastrico in una fase avanzata di malattia hanno una prognosi sfavorevole, a causa della limitata efficacia delle terapie disponibili. Pertanto, lo sviluppo di nuove terapie, come immunoterapia per il trattamento del cancro gastrico è della massima importanza. Dal momento che l'usabilità dei modelli preclinici esistenti per la valutazione delle immunoterapie per adenocarcinoma gastrico è limitata, l'obiettivo del presente studio è stato quello di stabilire murini in vivo
modelli che permettono il miglioramento graduale delle immunoterapie per cancro gastrico.
Metodi
Poiché non linee cellulari di adenocarcinoma gastrico murini sono disponibili abbiamo stabilito quattro linee cellulari (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) da spontaneamente in via di sviluppo tumori CEA424 /SV40 antigene T topi (CEA424 /Tag) e tre linee cellulari derivate da doppio transgenico discendenti di topi CEA424 /Tag accoppiati con l'antigene carcinoembrionario umano (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) topi (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag è un transgenici C57BL /6 ceppo di topi ospitare il tag sotto il controllo di un -424 /-8 bp CEA promotore del gene che porta allo sviluppo di adenocarcinoma invasivo nello stomaco ghiandolare. linee cellulari tumorali stabiliti da topi CEA424 /Tag-CEA esprimere l'antigene tumorale CEA ben definito sotto il controllo dei suoi elementi regolatori naturali
. Risultati
L'origine epiteliale delle cellule tumorali è stato dimostrato da criteri morfologici compresa la presenza di mucina all'interno delle cellule e l'espressione della adesione cellulare molecole EpCAM e CEACAM1. Tutte le linee di cellule costantemente esprimono la CEA transgeni e /o Tag e di classe di molecole MHC I che porta alla loro suscettibilità alla lisi da specifici tag CTL in vitro
. Nonostante la presentazione di CTL-epitopi derivati ​​dai prodotti transgenici le linee di cellule tumorali erano oncogeno quando innestati in C57BL /6, CEA424 /tag o CEA424 host /Tag-CEA-transgenici e nessuna differenza significativa nel tumore prendono e la crescita del tumore sono stati osservati in i diversi host. Anche se è stato osservato alcun rifiuto tumore spontanea, la vaccinazione di C57BL 6 topi /con lisati di linee cellulari di carcinoma gastrico protette C57BL /6 topi sfida del tumore, che dimostrano la tumorigenicità delle linee cellulari del tumore nei topi nontransgenic della H-2 b aplotipo.
Conclusione
Queste linee cellulari tumorali trapiantate in host differenti singenici dovrebbero rivelarsi molto utile per ottimizzare i regimi di immunoterapia per essere infine testati in animali transgenici in via di sviluppo carcinomi gastrici primarie.
Sfondo
cancro gastrico è il secondo tumore più comune in tutto il mondo [1]. Non è spesso rilevato fino uno stadio avanzato; Di conseguenza, i tassi di sopravvivenza a 5 anni sono bassi (dal 10 al 20%). A causa di invasione locale e metastasi, la radioterapia o la chemioterapia non aumenta in modo significativo la durata o la qualità della vita dei pazienti con carcinoma gastrico avanzato. Pertanto, sono necessari allo sviluppo di nuove modalità di trattamento neoadiuvante e adiuvante. L'immunoterapia potrebbe essere una soluzione alternativa promettente. Un certo numero di immunoterapia approcci come trasferimento adottivo di cellule T tumore-specifiche, e la vaccinazione con antigeni tumorali non definiti derivati ​​da lisati tumorali e linee di cellule tumorali o antigeni tumorali definiti comunemente presentati dalle cellule dendritiche sono in corso di valutazione per vari tipi di cancro [2, 3] . Per i tumori gastrici, l'immunoterapia non è stata presa seriamente in considerazione a causa del concetto che il cancro gastrico è scarsamente immunogenico. Pertanto, sono stati segnalati solo un piccolo numero di studi clinici di immunoterapia [4-7]. Inoltre, sono stati identificati solo un numero limitato di antigeni associati al tumore con l'uso potenziale di immunoterapia [8-11]. Di conseguenza, la capacità del sistema immunitario di riconoscere e sradicare tumori gastrici è in gran parte sconosciuta. Al fine di conoscere l'efficacia di vari immunoterapie per il trattamento del cancro gastrico e per chiarire il meccanismo alla base della risposta immunitaria indotta modelli animali di adenocarcinoma gastrico indispensabili.
A tal fine, diversi gruppi hanno compreso il nostro recente costituzione transgenici o battere ceppi di topi -out che si sviluppano adenomi gastriche o adenocarcinoma in varie parti dello stomaco dopo diverse latenze [12]. Abbiamo sviluppato un carcinoma gastrico transgenici C57BL /6 topo modello basato su un grande antigene T di SV40 (SV40 Tag) transgene controllato da un gene promotore dell'antigene carcinoembrionario umano (CEA) (da -424 a -8 del sito di inizio traslazionale) [13 ]. In 100% degli animali, la formazione cripta displastica nella mucosa dello stomaco si osserva nella regione pilorica vecchio CEA424 /SV40 topi Tag-transgenici già nel 30 al giorno. Displasia progredisce a carcinomi invasivi e di giorno 50 l'intero pilorica mucosa gastrica è stata sostituita da cellule di carcinoma. Tra l'età di 90 a 110 giorni, i topi transgenici diventano moribondo e muoiono probabilmente di denutrizione a causa del blocco del piloro [13]. Il controllo dell'espressione Tag da un minimo gene promotore CEA permette l'espressione tumorale diretto del CEA attraversando /SV40 topi transgenici Tag-CEA424 con il CEA umano
-transgenic /6 topi C57BL, che esprimono il transgene CEA in un simile spazio-temporale pattern di espressione come si trova nell'uomo [13, 14]. Il marcatore tumorale CEA umana è espressa in molti adenocarcinomi umani tra cui più del 50% dei carcinomi gastrici [15, 16]. CEA è sempre più utilizzato come antigene bersaglio per una varietà di approcci di immunoterapia del tumore anticorpo e cellulo-mediata [17-19]. CEA e Tag sono adatti antigeni bersaglio immunoterapia da un certo numero di epitopi delle cellule T di questi antigeni sono stati identificati in C57BL /6 topi [20-22]. Sebbene questi ceppi di topi transgenici specchio sviluppo adenocarcinoma strettamente gastrico nell'uomo, sperimentazione di questi topi è relativamente lunga e costosa a causa della difficoltà di determinare la crescita tumorale e il requisito di allevamento topi transgenici. Pertanto, è desiderabile avere un sistema tumorale trapiantabile singenici degli adenocarcinomi gastrici in topi immunocompetenti per l'ottimizzazione di un determinato protocollo immunoterapia prima di essere valutata in topi transgenici. Qui si descrivono le linee cellulari di adenocarcinoma gastrico murine stabiliti dal spontaneamente in via di sviluppo di tumori di SV40 topi Tag-transgenici che sono oncogeno sia wild type singenici e topi transgenici.
Metodi
ceppi di topi e linee cellulari
CEA424 /Tag- topi transgenici (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-topi transgenici (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) e F1 topi da un incrocio tra topi CEA424 /Tag-transgenico e CEA-transgenico sono state descritte in precedenza [13, 14]. Nel frattempo le linee transgeniche sono state reincrociata a C57BL 6 topi /(H-2 b) per più di 15 generazioni. Le linee transgeniche così come topi C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Germania) sono stati allevati e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni standard, nella struttura degli animali dell'Istituto per la Ricerca chirurgica, Ludwig-Maximilians-Universität di Monaco. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti dopo l'approvazione da parte del comitato di benessere degli animali locale. Per i saggi di cancerogenicità e immunogenicità topi sono stati utilizzati a 8-12 settimane di età. linea cellulare Cos7L africano verde rene di scimmia è stato ottenuto dal tessuto americano Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Il BALB /c-derivato fibrosarcoma Meth-A è stato gentilmente fornito da W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Amburgo). cellule Meth-A-CEA sono stati ottenuti mediante trasfezione di cellule Meth-A con i plasmidi di espressione PRC /CMV-CEA utilizzando FuGENE ™ reagente 6 trasfezione (Roche Molecular Biochemicals, Svizzera), secondo le istruzioni del produttore. transfettanti Meth-A-CTAG e RBL5 /T sono state precedentemente descritte [23]
. Istituzione di linee cellulari di carcinoma gastrico
I carcinomi gastrici utilizzati per stabilire linee di cellule tumorali sono stati ottenuti da 8 differenti, 13 settimane di età topi. Quattro derivate da topi CEA424 /tag-transgenico e 4 da CEA424 /Tag-CEA-doppie topi transgenici. I nomi delle linee cellulari derivate da quest'ultima topi sono contrassegnati dal apice "CEA". Tutte le culture sono stati eseguiti in RPMI1640 supplementato con 10% di calore inattivato vitello siero fetale (FCS "Gold", PAA Laboratories, Coelbe, Germania), 2 mM L-glutammina, 100 U /ml di penicillina, 100 ug /ml di streptomicina, non essenziale aminoacidi e piruvato di sodio 1 mm (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Germania), di seguito denominati medio del tumore (TM). tessuti tumorali sono state ampiamente lavate in tampone fosfato salino (PBS) integrato con 200 mg /gentamicina ml e 2,5 ug /ml di amfotericina B (GIBCO /Invitrogen), tagliato a 1 mm 3 pezzi con un bisturi e placcato in coltura tissutale recipienti contenenti TM. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni 3-4 giorni. Le cellule epiteliali e fibroblasti che crescono fuori dei frammenti di tessuto sono stati separati dalla raschiatura delle cellule, tripsinizzazione selettivo e passaging selettiva con 1.000 U /ml di collagenasi e 500 U /ml ialuronidasi (Biochrom, Berlino, Germania). Durante la dissociazione, i palloni sono stati monitorati sotto un microscopio invertito e la digestione è stato fermato quando i fibroblasti, ma non le cellule epiteliali sono state staccate (tripsina) o viceversa (collagenasi /ialuronidasi). Questa procedura è stata ripetuta settimanalmente fino tutti fibroblasti sono stati eliminati dalle culture di cellule tumorali. Durante la generazione della linea cellulare 424GC, una coltura di fibroblasti è stato stabilito da fibroblasti contaminanti (424 fibroblasti). Spheroids formate entro 5-7 giorni dopo la semina 0,5 × 10 3 mGC8 cellule in Noble agar (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania) Rivestiti piastre a 96 pozzetti (TPP-Biochrom, Berlino, Germania) in 200 ml TM che è stato sostituito con terreno fresco ogni due giorni. Per valutare la vitalità delle cellule sulla superficie degli sferoidi, sferoidi sono stati incubati con FITC-marcato annessina V (Annessina V FITC Apoptosis Detection Kit, Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Germania) per la rilevazione di cellule apoptotiche o con ioduro di propidio per identificare necrotico cellule secondo le raccomandazioni del costruttore.
citometria a flusso
le analisi per le cellule di marcatura della superficie sono stati tripsinizzati, lavate con PBS e sospese in PBS /0.5% w /v di albumina sierica bovina (BSA) integrato con 0,02% w /v di sodio azide. Per l'induzione di molecole MHC, le cellule sono state incubate con 20 ng /ml di interferone-γ (IFNγ, Peprotec, Londra, Regno Unito) per 24 ore prima della raccolta. Legame non specifico di anticorpi anti recettori Fc è stato bloccato da una preincubazione delle cellule con 1 mg /10 6 celle di anti-CD16 /CD32 anticorpo monoclonale (MAB) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Germania) per 15 min . Successivamente le cellule sono state incubate con 0,5 mg /10 6 cellule del mAb di interesse per 30 min a 4 ° C, lavate due volte, ed eventualmente successivamente fatto reagire con un anticorpo secondo passaggio per 15 minuti a 4 ° C . Le cellule sono state lavate due volte e analizzati utilizzando un FACScan (BD, Mountain View, CA). Le cellule morte sono stati esclusi da ioduro di propidio colorazione. I seguenti reagenti e anticorpi monoclonali diretti contro antigeni murini da BD Pharmingen sono stati utilizzati: ficoeritrina (PE) coniugata IgG di topo 2 bis anti-IA b, mouse biotinilato IgG 2 bis anti-H-2D b , mouse PE-coniugato IgG 2aanti-H-2K B, PE-coniugato anti-topo CD80 /B7-1, PE-coniugato ratto IgG 2 bis anti-topo CD40, ratto PE-coniugato IgG 2 bis anti-topo CD86 /B7-2, isotiocianato di fluorescina (FITC) coniugata, criceto armeno IgG 2 anti-topo CD80 /B7-1. topo FITC-coniugato IgG 1 mAb R3-34, ratto PE-coniugato IgG 1 mAb R3-34, mouse PE-coniugato IgG 2 bis anti-ratto SIRP, coniugato con FITC armeno criceto IgG 2anti-KLH e ratto PE-coniugato IgG 2amAb serviti come controlli isotipo. Mouse anti-topo CEACAM1 mAb CC1, ratto anti-topo CEACAM1 AgB10 [24] e ratto anti-topo E-caderina e anti-topo EpCAM anticorpi monoclonali sono stati un gentile dono da K. Holmes, dell'Università del Colorado, BB Singer, Charité di Berlino, e P. Ruf,, Trion Research, Monaco di Baviera, rispettivamente. Il mouse cross-reattivi anti-umano CEACAM mAb 4/3/17 (specifiche per l'uomo CEA /CEACAM5 nel topo) sono stati acquistati da GENOVAC (Friburgo, Germania). Gli anticorpi murini sono stati rilevati con capra PE-coniugato anti-topo IgG, anticorpi di ratto con asino FITC-coniugato anti-topo-IgG Rilevamento di CEA e SV40 Tag mediante Western blotting (DAKO).

crescita esponenziale cellule di carcinoma gastrico , le cellule Cos7L, transfettanti Cos7L-CEA, le cellule Meth-a e transfettanti Meth-a-CTAG che esprimono un troncato Tag SV40 cytoplasmically situato sono state raccolte da tripsinizzazione. Le cellule sono state lavate tre volte in PBS e lisate ad una densità di 10 6 cellule /ml in tampone di lisi. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando il kit Protein Assay BCA (Pierce, Rockford, Illinois, Stati Uniti d'America). Gli estratti cellulari corrispondenti a 10 mg di proteine ​​sono state separate mediante elettroforesi attraverso 10% gel di SDS poliacrilammide (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), trasferiti al polyvinyliden membrane fluoruro e incubate con 10 ug /ml anti-umano CEACAM mAb 4/3/17 o una 1: 100 criceto diluito anti-SV40 Tag antisiero (un gentile dono da K.-H. Scheidtmann, Università di Bonn). Gli anticorpi legati sono stati reagito con anticorpi secondari perossidasi di rafano e visualizzati utilizzando un sistema di rilevazione chemiluminescenza-based. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germania)
cellulare tempo di raddoppio determinazione
in vitro
cicli di raddoppio delle linee cellulari sono state determinate mediante placcatura le cellule di carcinoma gastrico in piastre da 24 pozzetti in TM ai numeri cellulari partire indicati e conteggio dei campioni cellulari da pozzetti in triplicato dopo lieve tripsinizzazione ogni 3 giorni per 21 giorni. L'in vivo
cicli di raddoppio sono stati calcolati da misure volume del tumore (vedi sotto) dopo l'inoculazione con tre diversi numeri di cellule di partenza (tre topi per gruppo). cicli di raddoppio sono stati calcolati dalla fase di log delle curve di crescita.
tumorigenicità e immunogenicità della cella linee Compra di cellule tumorali di valutazione tumorigenicità sono state lavate tre volte in PBS e 50 ml di sospensioni cellulari con i numeri di cellulare indicati sono stati iniettati sottocutanea nel fianco rasata destra dei topi. Per determinare l'immunogenicità, 10 7 cellule tumorali /ml sono stati lisati da due cicli di gelo e disgelo consecutivi. I topi sono stati immunizzati per quattro volte ad intervalli settimanali con 10 6 cellule tumorali lisati nel fianco destro. Tre settimane più tardi, i topi sono stati sfidati da iniezione sottocutanea di 3 × 10 6 cellule tumorali vitali nel fianco sinistro. Gruppi sperimentali consistevano di 4-6 topi. sviluppo del tumore è stata seguita da misurazioni seriali della dimensione del tumore e il volume del tumore è stato calcolato secondo l'equazione: volume del tumore (mm 3) = d 2 × D /2, dove d e D erano più breve e il diametro del tumore più lungo, rispettivamente. Gli animali sono stati sacrificati quando i tumori hanno raggiunto un volume di 300 mm 3.
Generazione di linfociti specifici tag T citotossici (CTL) e la stimolazione da parte gastrici linee cellulari di carcinoma
CTL sono stati generati come descritto in precedenza [23] . In breve, i topi sono stati inoculati con intradermica 1 micron particelle d'oro rivestite con un plasmide di espressione Tag (BMG /TC-Ag.1 [23]) nella pelle addominale rasata con una pressione di elio (200 psi) alimentato dispositivo biolistic (gene pistola Helios; Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco di Baviera, Germania). splenociti ottenuti 14 giorni dopo la vaccinazione sono stati restimolati ad intervalli settimanali con RBL5 irradiato /trasfettanti T in RPMI-1640/10% FCS addizionato di 30 IU /ml di IL-2. RBL5 /T è una linea cellulare Rauscher virus-trasformati T-linfoma derivato da un (H-2b) Mouse C57BL6 transfettate con un plasmide SV40 Tag espressione. Per generare specifici epitopi CTL, cellule della milza prese 10 giorni dopo la vaccinazione sono stati restimolato in vitro con cellule RBL5 peptide-impulsi irradiati, Tag. Il T1, T2 /3 e T4 epitopi specificità del CTL è stata controllata dalla determinazione del contenuto IFNγ dei media su di stimolazione con cellule bersaglio peptide-pulsato con ELISA.
Rilevamento di citochine da parte ELISA network per la cattura e il rilevamento di IFNγ in surnatanti di sandwich tradizionale ELISA, abbiamo utilizzato mAb R4-6A2 e biotinilato mAb XMG1.2, rispettivamente (BD Pharmingen). L'estinzione è stata analizzata a 405/490 nm su un lettore ELISA TECAN micropiastra (TECAN Crailsheim, Germania) con il software Easywin (TECAN). Il limite di rilevazione del test ELISA per IFNγ era di 20 pg /ml.
Risultati
Istituzione e fenotipo del carcinoma gastrico linee cellulari
da campioni di carcinoma gastrico 8 7 linee di cellule potrebbero essere stabiliti. Quattro linee di cellule sono stati ottenuti da CEA424 topi /Tag-transgenico (424GC, da un topo maschio, mGC3, femminile, mGC5, di sesso maschile, e mGC8, femminile) e tre linee da topi CEA424 /Tag-CEA-transgenico (mGC2 CEA, di sesso maschile; mGC4 CEA, di sesso maschile; mGC11 CEA, femmina). Il tempo necessario per ottenere puri colture di cellule epiteliali variava notevolmente (media di 6 mesi, range 3-16 mesi). Anche se le cellule tumorali crescono come cellule aderenti in coltura, tendono a formare aggregati piuttosto che diffondere sul substrato di coltura (Fig. 1A). L'origine epiteliale delle cellule tumorali è stata provata da criteri morfologici compresa la presenza di mucina all'interno delle cellule (Fig. 1A) e l'analisi di espressione di proteine ​​comunemente espressa in cellule epiteliali (EpCAM, E-caderina, CEACAM1) (Fig. 2A) . Un ridotto contenuto di mucina è stato trovato in tutte le linee cellulari rispetto al contenuto in normali cellule epiteliali gastriche ma simile a quella presente nelle cellule tumorali nel carcinoma gastrico in topi transgenici (Fig. 1A e [13]). Tutte le linee cellulari visualizzati CEACAM1 e EpCAM sulla loro superficie tranne mGC11 CEA, nessuno di loro ha espresso E-caderina (Fig. 2A e dati non mostrati). Tutte le linee cellulari esprimono MHC classe I H-2K e, e ad un livello molto inferiore, molecole H-2D (Fig. 2B). L'espressione di entrambe le proteine ​​è stata fortemente potenziata dalla stimolazione IFNγ. è stata rilevata alcuna espressione di MHC di classe II molecole (I-Ab) (Fig. 2B e dati non mostrati). CD54, CD80, CD86 o CD95 non sono stati rilevati su una linea cellulare (dati non riportati). Figura 1 Morfologia di linee cellulari di carcinoma gastrico coltivate come colture monostrato o come tre sferoidi tridimensionali. (A) Le linee cellulari mostrano una leggermente diversa morfologia epiteliale. La maggior parte delle cellule di tutte le linee cellulari contengono una caratteristica vacuolo intracellulare (frecce) che probabilmente contiene materiale mucinoso macchiato rosso con il metodo PAS (ultima foto a destra nel pannello inferiore). (B) Spheroid formata da coltura di cellule tumorali mGC8 su agar morbido: a sinistra, contrasto di fase; a destra, la fluorescenza colorazione delle cellule necrotiche con ioduro di propidio (rosso) e cellule apoptotiche con coniugati con fluoresceina annexinV (verde, segnate da punte di freccia), come descritto in "Materiali e Metodi". Ingrandimento: barre corrispondono a 10 micron. MGC, murino carcinoma gastrico.
forma della superficie espressione 2 cellulare di marcatori epiteliali (A) e MHC di classe I e II molecole (B). linee cellulari di carcinoma gastrico sono stati reagito sia con PE-marcato (H-2Kb, H-2db, I-Ab) o con anticorpi monoclonali senza etichetta (CEACAM1, E-caderina, EpCAM), seguita da incubazione con PE-marcato anti-topo IgG o FITC -labeled IgG anti-ratto e analizzate mediante citometria di flusso. Gli istogrammi mostrano i risultati ottenuti con anticorpi contro antigeni rilevanti con (grigio aperto) o senza (nero aperto) stimolazione IFNγ prima e antigeni irrilevanti (grigio curve piene).
Al fine di determinare il potenziale delle linee cellulari da utilizzare per la generazione di modelli tumorali tridimensionali abbiamo analizzato formazione sferoide cellule tumorali in vitro. Come illustrato in Fig. 1B linee cellulari formano sferoidi tumorali compatte dopo 8 giorni di coltura in cui 103 cellule sono state seminate in morbide piastre a 96 pozzetti agar-rivestita. è stata osservata solo lievi variazioni intra-sperimentale riguardante la dimensione degli sferoidi. La colorazione con ioduro di propidio e marcata con FITC annessina V dimostrato che almeno lo strato superficiale di sferoidi consisteva di cellule vitali con pochissime cellule morte collegato ad esso (Fig. 1B). Espressione del transgene
dalle linee cellulari di carcinoma gastrico
CEA e tag può servire come antigeni tumore-specifici (TSA) o antigeni associati al tumore (TAA) dopo il trapianto delle linee cellulari tumorali di recente costituzione in immunocompetenti C57BL singenici /6 e CEA o topi transgenici Tag-, rispettivamente. Anche se strumentale nella formazione del tumore, l'espressione del transgene tag non è sempre trovata in linee cellulari tumorali derivate da topi TAG-transgenici, come in TRAMP linee cellulari tumorali [25]. Questo ci ha spinto ad analizzare la presentazione I-restricted espressione e MHC classe del transgene Tag nonché l'espressione di CEA nelle linee cellulari di carcinoma gastrico stabiliti. CEA espressione di superficie delle cellule è stata analizzata in linee cellulari derivate da tumori gastrici dal doppio topi transgenici mediante citometria di flusso e analisi Western Blot. Mentre l'espressione del transgene CEA è regolata dalla regione completa promotore del gene CEA umana l'espressione del tag è controllato da un minimo -424 /-8 bp CEA promotore (Fig. 3A). Tutte e tre le linee di cellule doppio transgenici espressi CEA sulla superficie cellulare (Fig. 3B). Nella linea cellulare di carcinoma gastrico mGC2 CEA transgene-espressi CEA esposto un peso molecolare di 180 kDa simile a quella trovata in cellule di rene di scimmia verde africana SV40 trasformata stabilmente trasfettate con un vettore di espressione CEA e CEA trova negli esseri umani. Come previsto, non CEA è stata rilevata nelle cellule 424GC, che sono stati stabiliti da un topo transgenico Tag-CEA-negativi (Fig. 3C). Tag è risultato essere espressa mediante Western blotting e immunofluorescenza in tutte le linee cellulari derivate da topi singolo e doppio transgenico (Fig. 3D e dati non mostrati). Questa scoperta supporta anche l'origine delle linee cellulari di carcinomi stomaco. Inoltre, la linea cellulare 424GC presentato efficiente peptidi Tag-derivato endogeno trasformati, in particolare l'epitopo T1, in un MHC-I limitai modo determinato dalla induzione della secrezione di IFNγ specifici byTag CTL (Fig. 4A). Inoltre, le linee cellulari sono stati efficacemente uccisi da specifici Tag CTL in saggi di citotossicità (Fig. 4B). Figura 3 L'espressione di CEA e Tag da linee cellulari di carcinoma gastrico derivati ​​da CEA424 /Giorno- o CEA424 /Tag × topi CEA-transgenici. (A) Struttura del CEA e transgeni /Tag CEA424. Gli esoni 1-10 del gene CEA umana contenuta all'interno dell'inserto di cosmid clone cosCEA1 [14] sono mostrati come scatole di codice colore (azzurro, leader, rosso, dominio IGV-simili; blu dominio IGC simili; grigio, dominio transmembrana ,.. bianchi, 5 'e esoni regione 3'-non tradotte sequenze fiancheggianti vettoriali sono indicate come scatole nere la posizione del CEA minimal promotore presenti nel SV40 Tag gene transgene è indicato da linee tratteggiate, i nomi delle linee transgeniche sono mostrate nel margine sinistro. (B) citometria a flusso è stata eseguita mediante l'etichettatura delle celle indicate sia con il mAb CEA-specifica 26/3/13 (curve piene) o un anticorpo isotipo-abbinato (curve aperte), seguita da capra PE-marcato Gli anticorpi anti-topo IgG. (C, D) Per l'analisi occidentale, 10 mg di proteine ​​totali da estratti di cellule 424GC o mGC8 stabiliti dai topi CEA424 /tag-transgenici e cellule mGC2CEA e mGC4CEA da CEA424 /Tag × topi CEA-transgenici sono stati dimensioni separate mediante SDS gel poliacrilamide, trasferite su una membrana e reagito con il CEA-specifica mAb 26/3/13 (C) o di criceto policlonali anticorpi anti-Tag (D). Estratti dalle cellule Meth-A Cos7L-CEA e stabilmente trasfettate con vettori di espressione che codifica CEA o un tag privo di una regione con il segnale di localizzazione nucleare (CTAG) servito come controllo positivo. Le dimensioni dei marcatori proteici sono indicate a margine sinistro.
Figura 4 MHC di classe I-presentazione limitato di epitopi Tag da linee cellulari di carcinoma gastrico murini. (A) epitopi specifici CTL generata in C57BL /6 topi mediante immunizzazione DNA con un vettore di espressione tag e successiva espansione mediante stimolazione in vitro con cellule RBL5 peptide-caricato Tag, incubate con 424GC irradiato, 424 fibroblasti, RBL5 e Tag T1, T2 /3 o T4 cellule RBL5 peptide pulsato per 24 h e loro secrezione IFNγ nel mezzo di coltura è stata determinata mediante ELISA. La secrezione di IFNγ da CTL stimolato con cellule 424GC indica che queste cellule presenti peptidi SV40Tag-specifici in modo MHCI limitato. (B) co-coltura di 424GC e 424 fibroblasti sono stati trattati con 107 Tag-specifica CTL in una capsula di Petri per 48 ore. Da allora in poi, non aderenti cellule (morte) sono stati rimossi. Sinistra, co-coltura prima del trattamento CTL; a destra, co-coltura dopo il trattamento. Le frecce indicano la posizione delle cellule tumorali prima aggiunta di CTL
tumorigenicità delle linee cellulari di carcinoma gastrico
Per determinare la tumorigenicità delle linee cellulari, vari numeri (1 × 10 5;. 3 × 10 5; 1 × 10 6) di cellule sono state iniettate per via sottocutanea in topi C57BL /6. Tutte le linee cellulari erano in grado di formare tumori in 100% degli animali, se almeno 3 × 10 5 cellule tumorali sono state iniettate (Fig. 5A). I tumori sono cresciuti in modo esponenziale quasi senza alcun ritardo fino a raggiungere un volume di 300 mm 3. Non ci sono metastasi a distanza possono essere rilevati durante il tempo di osservazione. Analisi Western blot eseguita su tumori trapiantati dimostrato che entrambi i transgeni sono stati espressi dalle linee cellulari in vivo
(dati non mostrati). I tempi di raddoppio delle cellule tumorali in vivo
a un carico tumorale iniziale di 10 6 celle varia tra 7,2 (mGC8) e 13,8 giorni (mGC3) (Fig. 5a). In vitro
, tutte le linee cellulari esposti simili cicli di raddoppio di circa 3 giorni (Fig. 5B). Abbiamo inoltre confrontato la formazione del tumore sottocutaneo delle linee cellulari di wild-type (C57BL /6) e topi transgenici. Non sono state osservate differenze significative nella presa del tumore e la crescita tumorale per la linea cellulare 424GC quando iniettato per via sottocutanea nella wild-type o topi CEA424 /Tag-transgenico (Fig. 6A) e per mGC11 cellule CEA dopo l'iniezione in wild-type e CEA424 /Tag-CEA-transgenici topi (Fig. 6b). Figura 5 In vivo (A) e in caratteristiche di crescita in vitro (B) di linee cellulari di carcinoma gastrico murini. Tre topi ciascuno sono stati iniettati con le dosi indicate cellule tumorali. La crescita tumorale è stata quantificata due misurazioni perpendicolari del diametro del tumore e calcolo del volume come descritto nella sezione Materiali e Metodi. Per determinare in vitro caratteristiche di crescita, le cellule sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti a partire dai numeri di cella indicata. In diversi momenti cellule da pozzi triplice copia sono state raccolte e contate. I risultati sono riportati come media +/- deviazione standard (SD). Le migliori curve in forma così come cicli di raddoppio in giorni (indicati tra parentesi) sono state calcolate utilizzando il software GraphPad.
Figura 6 crescita di linee cellulari di carcinoma gastrico in wild-type e topi transgenici. 3 × 105 cellule sono state iniettate per via sottocutanea 424GC in C57BL /6 e CEA424 /Tag-topi transgenici (A) o 3 × 105 cellule mGC11CEA sono state iniettate in topi C57BL /6 e CEA424 /Tag × topi transgenici CEA-doppia (B). La crescita tumorale è stata quantificata due misurazioni perpendicolari del diametro del tumore e calcolo del volume come descritto nella sezione Materiali e Metodi. I risultati sono riportati come media +/- SD (n = 3).
Immunogenicità del carcinoma gastrico linee cellulari
Il simile crescita delle linee cellulari tumorali in wild-type e topi transgenici indica che nessuna risposta immunitaria significativa o antigeni tumorali (Tag, CEA) si è verificata in topi portatori di tumore del cuscinetto. Infatti, nessun CTL specifici tag potrebbe essere identificato nella milza di tumore cuscinetto topi wild-type sulla crescita per via sottocutanea progressiva delle cellule di carcinoma gastrico tag che esprimono (dati non riportati). Tuttavia, quando doppie linee cellulari transgeniche è cresciuto nei topi, gli anticorpi CEA-specifici potrebbero essere identificati in wild-type C57BL 6 topi /ma non nei topi CEA-transgenici (Fig. 7A). Inoltre, tre vaccinazioni di C57BL /6 topi con 106 cellule tumorali mGC8 freeze-scongelati a intervalli settimanali o prevenire la crescita dei sottocutanea iniettate cellule mGC8 vive completamente o tumore conseguenza è stata ritardata di quasi tre settimane a seconda della dose di cellule tumorali iniettata (Fig. 7B , C). Questi esperimenti dimostrano che le linee cellulari tumorali sono immunogenici in determinate condizioni. Tuttavia, C57BL /6 topi non spontaneamente montare un tumore efficiente progressione limitativo risposta immunitaria a uno antigene tumorale durante la crescita del tumore sottocutaneo. Figura 7 immunogenicità di cellule MGC. anticorpi (A) Anti-CEA sono stati determinati nel siero di topi C57BL /6 e CEA-transgenici citometria a flusso. Tutti i topi avevano progressivamente crescente tumori senza necrosi palese dopo il trapianto e la crescita delle linee cellulari indicate per 35-40 giorni. cellule mGC4CEA sono state incubate con il siero dei topi indicati per varie diluizioni e anticorpi primari legati sono stati rilevati con un anticorpo anti-topo PE-coniugato. (B, C) Tre C57BL /6 topi ciascuno sono stati iniettati per via sottocutanea tre volte a intervalli settimanali, con 1 × 106 mGC8 cellule uccise da due cicli di gelo-disgelo. Due settimane dopo l'ultima vaccinazione, i topi sono stati sfidati da iniezione con 1 × 106 (B) e 3 × 106 (C) vivono cellule mGC8, rispettivamente (compilati nei circoli). Come controllo, le cellule tumorali sono state iniettate in topi non immunizzati (cerchi aperti). volumi del tumore sono stati calcolati come descritto nella sezione Materiali e Metodi. I risultati sono mostrati come valori medi +/- SD.
Discussione
L'obiettivo principale del presente studio è stato quello di stabilire un modello terapeutico del cancro gastrico in topi immunocompetenti che fornirebbe un modello animale per valutare l'immunità anti-tumorale e strategie di immunoterapia.

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