Jellemzése gyomor adenokarcinóma sejtvonal létre CEA424 /SV40 T antigén-transzgenikus egerek vagy anélkül emberi CEAtransgene

Jellemzése gyomor adenokarcinóma sejtvonal létre CEA424 /SV40 T antigén
transzgenikus egerek vagy anélkül humán CEA
transzgént
Abstract
alapon
gyomor karcinóma egyike a leggyakoribb rák világszerte . Gyomorrákos betegeknél az előrehaladott betegség stádiuma rossz a prognózisa, mert a hatékonysága korlátozott a rendelkezésre álló terápiák. Ezért az új terápiák kifejlesztésére, mint immunterápiás kezelésére gyomorrák rendkívül fontos. Mivel a használhatóságát meglévő preklinikai modellek értékeléséhez immunterápiás gyomor adenocarcinoma korlátozott, a cél a jelen tanulmány megállapítása rágcsáló in vivo katalógusa modell, amely lehetővé teszi a fokozatos javulás immunterápiás gyomorrák. Katalógusa Módszerek
Mivel nem rágcsáló gyomor adenokarcinóma sejtvonalak állnak hoztuk létre négy sejtvonalat (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) származó spontán fejlődő daganatok CEA424 /SV40-T-antigén (CEA424 /Tag) egereket és három származó sejtvonalakban duplán transzgenikus utódjait CEA424 /Tag egerek párosodott humán karcinoembrionális antigén (CEA) transzgenikus (CEA424 /Tag-CEA) egerek (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /címke egy transzgenikus C57BL /6 egér törzs megtelepedését a Tag ellenőrzése alatt egy -424 /-8 bp CEA gén promoter, amely ahhoz vezet, hogy a fejlesztés a invazív adenocarcinoma a mirigyes gyomorban. Tumorsejtvonalak létre CEA424 /Tag-CEA egerek expresszálják a jól meghatározott tumor antigén CEA szabályozása alatt a természetes szabályozó elemekkel.
Eredmények
Az epiteliális eredetű tumorsejtek igazoltuk morfológiai kritériumokat, beleértve a jelenlétét mucin a sejtekben, és a kifejezés a sejtadhéziós molekulák EpCAM és CEACAM1. Minden sejtvonalak következetesen expresszálják a transzgént CEA és /vagy a Tag és az MHC I. osztályú molekulák vezető érzékenységüket a lízis által Tag-specifikus CTL in vitro katalógusa. Annak ellenére, hogy a bemutatása CTL-epitópok származnak a transzgén termékek a daganatos sejtvonalakat tumorkeltő amikor oltva C57BL /6, CEA424 /Tag vagy CEA424 /Tag-CEA-transzgenikus hosts és nincs jelentős különbség a tumor venni, és a tumor növekedését figyelték meg a különböző gépek. Bár nem spontán tumorkilökődési volt megfigyelhető, oltási C57BL /6 egerek lizátumát gyomor karcinóma sejtvonalakban védett C57BL /6 egerek tumor kihívás, bizonyítva a tumorképző a tumor sejtvonalak nem transzgenikus egerekben a H-2 b haplotípus.
Következtetés
Ezek tumor sejtvonalak oltott különböző szingenikus házigazdák kell bizonyítania, hogy nagyon hasznos, hogy optimalizálja az immunterápia rendek, hogy végül vizsgált transzgénikus állatokban fejlődő primer gyomor carcinoma. katalógusa Háttér katalógusa gyomorrák a második leggyakoribb rákos világszerte [1]. Ez gyakran nem mutatható ki, amíg egy előrehaladott szakaszában; Következésképpen az 5 éves túlélési aránya alacsony (10-20%). Köszönhetően a helyi invázió és metasztázis, sugárkezelés vagy kemoterápia nem növeli jelentősen a hosszát vagy életminőségét betegek előrehaladott gyomorrák. Ezért az új neoadjuváns és adjuváns kezelés módozatokra van szükség. Immunterápia lehet egy ígéretes alternatív lehetőség. Számos immunterápiás megközelítések, mint adoptív transzfer a tumor-specifikus T-sejtek, és a vakcinázás segítségével akár meghatározatlan tumor származó antigéneket a tumor lizátumot valamint tumorsejtvonalak vagy meghatározott tumor antigének általánosan által bemutatott dendrites sejteket értékelik különböző rákok [2, 3] . Gyomor rák immunterápia nem vették komolyan venni, mivel a koncepció, hogy a gyomorrák gyengén immunogén. Ezért csak egy kis számú klinikai immunterápia vizsgálatok számoltak [4-7]. Ezen kívül, csak korlátozott számú tumor-asszociált antigének potenciális felhasználási immunterápia azonosítottak [8-11]. Következésképpen a képességét az immunrendszer felismerni és felszámolására gyomor rák nagyrészt ismeretlen. Hogy betekintést nyerjünk a hatékonyságát különböző immunterápiás kezelésére gyomorrák és megvilágítására szolgáló mechanizmus által kiváltott immunválasz állatmodelljeinek gyomor adenokarcinóma nélkülözhetetlen.
E célból számos csoportok, köztük a miénk a közelmúltban létrehozott transzgenikus vagy kopogás kijelentkezés egértörzsek, amelyek fejlesztése gyomor- adenomák vagy adenokarcinómák különböző részein után a gyomor különböző látenciákat [12]. Kifejlesztettünk egy transzgenikus gyomor karcinóma C57BL /6 egér modell alapján egy SV40 nagy T-antigént (SV40 Tag) transzgén által irányított humán karcinoembrionális antigén (CEA) gén promoter (az -424 -8 a transzlációs starthely) [13 ]. 100% -ban az állatok, diszpláziás kripta kialakulását a gyomornyálkahártya figyelhető meg a pylorus régióban már 30 napos CEA424 /SV40-Tag-transzgenikus egerekben. Diszplázia előrehaladtával az invazív karcinóma és 50. napra az egész pylorus gyomornyálkahártya váltotta karcinóma sejtekben. Éves kor között 90 és 110 napos a transzgenikus egerek válik a haldokló és meghalni valószínűleg az alultápláltság miatt elzáródása a pylorus [13]. Az ellenőrzés a Tag kifejezés egy minimális CEA gén promoter lehetővé teszi, hogy a tumor-irányított expresszió a CEA által átkelés CEA424 /SV40-Tag-transzgenikus egerek humán CEA
transzgenikus C57BL /6 egerekben, amelyek expresszálják a CEA transzgén hasonló tér- és időbeli expressziós mintázat, mint az emberen [13, 14]. Az emberi tumor marker CEA expresszálódik sok humán adenokarcinóma beleértve a több mint 50% -át a gyomor-karcinómák [15, 16]. CEA egyre gyakrabban használják, mint megcélzott antigén a különböző antitest és sejt-közvetített tumor immunterápiás megközelítések [17-19]. CEA és a Tag alkalmas immunterápia célantigének mivel számos T-sejt-epitópok ilyen antigént azonosítottak C57BL /6 egerekben [20-22]. Bár ezek a transzgenikus egértörzs tükör szorosan gyomor adenokarcinóma fejlesztés emberekben, kísérletezés ezek az egerek viszonylag időigényes és költséges, mivel a nehézségek, hogy meghatározza a tumor növekedését, és a követelmény tenyésztési transzgenikus egerekben. Ezért kívánatos, hogy egy szingén transzplantálható tumor rendszer gyomor adenokarcinómák immunrendszerű egerek optimalizálása egy adott immunterápia protokoll, mielőtt azt értékeltük a transzgenikus egerekben. Itt leírjuk rágcsáló gyomor adenokarcinóma sejtvonalak spontán daganatok kialakulása SV40 Tag-transzgenikus egerek, amelyek daganatkelto a szingeneikus vad típusú és transzgenikus egerekben. Katalógusa módszerek katalógusa egér törzsek és sejtvonalak
CEA424 /címke- transzgenikus egereket (C57BL /6-Tg (CEACAM5-toldalékkal) L5496Wzm), a CEA-transzgenikus egereket (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) és F1 egereket egy kereszt között CEA424 /Tag-transzgenikus és CEA-transzgenikus egerekben korábban már leírták [13, 14]. Eközben a transzgénikus vonalak kerültek visszakereszteztünk C57BL /6-egereket (H-2 b) több mint 15 generáción. A transzgenikus vonal, valamint a C57BL /6 egereket (Charles River, Sulzfeld, Németország) tartják és szaporítják standard kórokozóktól mentes körülmények között a állatházában Intézet Sebészeti Műtéttani, Ludwig-Maximilian Egyetem, München. Az állat kísérleteket végeztünk jóváhagyását követően a helyi állatjóléti bizottság. A tumorképző és immunogenitási vizsgálatokat egereket alkalmaztunk 8-12 hetes korban. Afrikai zöld majom vese Cos7L sejtvonalat az American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). A BALB /c eredetű fibrosarcoma Meth-A volt szíves rendelkezésünkre W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA sejteket nyert transzfekciójával Meth-A sejteket a pRc /CMV-CEA expressziós plazmidok FuGENE ™ 6 transzfekciós reagens (Roche Molecular Biochemicals, Svájc), a gyártó előírásainak megfelelően. Meth-A-cTag és RBL5 /T transzfektánsokat korábban leírt [23].
Létrehozása gyomor karcinóma sejtvonalak
A gastricus karcinómák megállapítására alkalmazott tumorsejtvonalak kaptuk 8 különböző, 13 hetes egerekben. Négy származó CEA424 /Tag-transzgenikus egerek és a 4. CEA424 /tag-CEA-kettős transzgenikus egerekben. A nevét a származó sejtvonalakban az utóbbi egerek vannak jelölve a felső index "CEA". Minden tenyészetet végeztünk RPMI1640, kiegészítve 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS "Gold" PAA Laboratories, Coelbe, Németország), 2 mM L-glutamint, 100 U /ml penicillinnel, 100 ug /ml sztreptomicinnel, nem esszenciális aminosavak és 1 mM nátrium-piruváttal (Gibco /invitrogen, Karlsruhe, Németország), a további nevezik tumor közepes (TM). Tumorszövetekben alaposan mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), kiegészítve 200 ug /ml gentamicint és 2,5 ng /ml amfotericin B-vel (GIBCO /Invitrogen), vágjuk 1 mm 3 db egy szikével és szélesztjük szövettenyészetben tartalmazó lombikokat TM. A táptalajt 3-4 naponként cseréltük. Az epiteliális sejtek és fibroblasztok nőnek ki a szövet töredékek voltak elválasztva sejt kaparás, szelektív tripszinezést és szelektív passzálással a 1000 U /ml kollagenáz és 500 U /ml hialuronidázt (Biochrom, Berlin, Németország). Során disszociáció, a lombikokat nyomon inverziós mikroszkóp alatt, és az emésztés leállítjuk, amikor a fibroblasztok, de nem epiteliális sejteket leválasztottuk (tripszin) vagy fordítva (kollagenáz /hialuronidáz). Ezt az eljárást megismételtük hetente, amíg az összes fibroblasztokat eltávolították a tumor sejtkultúrákban. Előállítása közben a 424GC sejtvonal egy fibroblaszt tenyészet alakult szennyezze fibroblaszt (424 fibroblasztok). Szferoidok képződött 5-7 napon belül az ojtást követően 0,5 × 10 3 mGC8 sejtek Noble-agart (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország) bevont 96 lyukas lemezeken (TPP-Biochrom, Berlin, Németország) 200 ul TM amely helyettesítettük friss közeg minden második nap. Annak megállapítására, sejtek életképességét a felszínen a szferoidok, szferoidok inkubáltuk FITC-vel jelölt Annexin V (Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Németország) kimutatására apoptotikus sejtek vagy propidium-jodiddal azonosítani nekrotikus sejtek szerint a gyártó ajánlásainak.
Áramlási citometria elemzést katalógusa a felszíni festés sejteket tripszinizáltuk, mostuk PBS-sel és PBS-ben szuszpendáltuk /0,5 tömeg /térfogat% szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) kiegészített 0,02 tömeg /térfogat% nátrium- azid. Indukálására MHC molekulákat, sejteket inkubáltunk 20 ng /ml interferon-γ (IFNg; Peprotec, London, Egyesült Királyság) előtt 24 órán át a betakarítás. A nem-specifikus kötődését antitestek Fc-receptorok által blokkolt előinkubálása a sejteket 1 ng /10 6 sejtek anti-CD16 /CD32 monoklonális antitest (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Németország) 15 percig . Ezt követően a sejteket 0,5 ug /10 6 sejtek a mAb az érdeklődés, 30 percen át 4 ° C-on, kétszer mossuk, és adott esetben ezt követően reagáltatjuk egy második lépésben antitesttel 15 percig, 4 ° C-on . A sejteket kétszer mostuk, és analizáltuk FACScan (bd, Mountain View, CA). Az elpusztult sejteket kizárt propidium jodid festés. Az alábbi reagenseket és monoklonális ellenanyagok rágcsáló antigének a BD Pharmingen használtuk: fikoeritrinnel (PE) konjugált egér IgG 2a anti-IA b biotinilált egér IgG 2a anti-H-2D b , PE-konjugált egér IgG 2aanti-H-2k b, PE-konjugált anti-egér CD80 /B7-1, PE-konjugált patkány IgG 2a anti-egér CD40, PE-konjugált patkány IgG 2a anti-egér-CD86 /B7-2, fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugált, örmény hörcsög IgG 2 anti-egér CD80 /B7-1. FITC-konjugált patkány IgG 1 monoklonális R3-34, PE-konjugált patkány IgG 1 monoklonális R3-34, PE-konjugált egér IgG 2a anti-patkány SIRP, FITC-konjugált örmény hörcsög IgG 2anti-KLH és PE-konjugált patkány IgG 2amAb szolgált izotípus kontroll. Egér anti-egér CEACAM1 mAb CC1, patkány anti-egér CEACAM1 AgB10 [24] és a patkány anti-egér E-kadherin és anti-egér-EpCAM mAb-ket egyfajta ajándék K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité Berlin, és P. Ruf, Trion Research, München, ill. A kereszt-reaktív egér anti-humán CEACAM mAb 4/3/17 (specifikus a humán CEA /CEACAM5 az egér) vásároltunk a GENOVAC (Freiburg, Németország). Rágcsáló antitesteket PE-konjugált kecske anti-egér IgG, patkány ellenanyagok FITC-vel konjugált szamár anti-patkány-IgG-t (DAKO).
Kimutatása CEA és SV40 Tag Western blot
Exponenciálisan növekedő gyomor karcinóma sejtek , Cos7L sejtek Cos7L-CEA transzfektánsok, Meth-a sejteket és a Meth-a-cTag transzfektánsok amelyek kifejezik egy csonkolt citoplazmatikusan elhelyezkedő SV40 Tag tripszinezéssel. A sejteket háromszor mostuk PBS-ben és lizáltuk sűrűségben 10 6 sejt /ml lízis-pufferben. A fehérje koncentrációját határozzuk meg a BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Sejtkivonatokat megfelel 10 ug fehérje elektroforézissel elkülönítjük keresztül 10% -os SDS poliakrilamid gélen (Invitrogen, Karlsruhe, Németország), átvittük polyvinyliden fluorid membránok, és inkubáltuk 10 ng /ml anti-humán CEACAM mAb 4/3/17, vagy egy 1: 100 hígításban hörcsög anti-SV40 Tag antiszérum (egyfajta ajándék K.-H. Scheidtmann, University of Bonn). A kötött antitesteket reagáltatunk tormaperoxidázzal jelölt másodlagos antitesteket, és láthatóvá tettük egy kemilumineszcenciás-alapú detekciós rendszerhez (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Németország).
Sejtosztódási időt meghatározás
In vitro
megduplázva időpontokban a sejtvonalak által meghatározott plating a gyomor karcinóma sejteket 24 lyukú lemezekre TM a jelzett kiindulási sejtszám és a számolás a sejt származó minták három párhuzamos lyukból után enyhe tripszinezéssel 3 naponta 21 napig. Az in vivo
kétszeresére számoltuk tumor térfogat mérése (lásd alább) a beoltás után három különböző kiindulási sejtszám (három egér csoportonként). A megkettőződési időt számoltuk a log fázisban a növekedési görbék.
Tumorképző és immunogenitását a sejtvonalak
daganatkeltő hatás értékelését tumor sejteket megmostuk háromszor PBS-ben és 50 ul sejtszuszpenziók a jelzett sejtek számát injektáltunk szubkután borotvált jobb szárnyon az egerek. Annak megállapításához, a immunogenitási, 10 7 tumor sejt /ml lizáltuk két egymást követő fagyasztva és olvadás ciklusok. Egereket immunizáltunk négy alkalommal hetente 10 6 lizált tumorsejtek a jobb szárnyat. Három héttel később, az egereket szubkután injekcióval 3 × 10 6 életképes tumorsejtek a bal oldalról. A kísérleti csoportok 4-6 egerekben. A tumor fejlődését követte sorozatos mérése a tumor mérete és a tumor térfogatát kiszámítottuk a következő egyenlet szerint: tumor térfogatát (mm 3) = D 2 × D /2, ahol D és D volt a legrövidebb és a a leghosszabb tumor átmérőjét, ill. Az állatokat leöltük, amikor a tumor elérte a térfogata 300 mm 3.
Generálása Tag-specifikus citotoxikus T-limfociták (CTL), és stimuláció gyomor karcinóma sejtvonalak katalógusa CTL generáltunk a korábban leírtak [23] . Röviden, az egereket intradermálisan beoltottunk 1 um arany részecskéket bevonjuk egy címke expressziós plazmiddal (BMG /CT-Ag.1 [23]) A leborotvált hasi bőr alkalmazásával hélium nyomás (200 psi) hajtott biolisztikus készülék (Helios gén pisztoly; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Németország). Lép kapott sejteket 14 nappal a vakcináció után újrastimuláltuk hetenként besugárzott RBL5 /T transzfektánsok RPMI-1640/10% FCS-sel kiegészített 30 NE /ml IL-2-. RBL5 /T egy Rauscher-vírussal transzformált T-limfóma sejtvonal származik C57BL6 (H-2b) egér transzfektált egy SV40 Tag expressziós plazmid. A generál epitóp-specifikus CTL lépsejteket hozott 10 nappal a vakcináció után újrastimuláltuk in vitro besugárzott, jelölő peptid-pulzáló RBL5 sejteket. A T1, T2 /3 és T4 epitóp specificitását CTL által ellenőrzött meghatározása IFNg média tartalmára upon stimulálás peptiddel pulzált célsejtek alkalmazásával ELISA-val.
Citokin detektálási ELISA
befogásra és felderítése IFNg felülúszójában hagyományos szendvics ELISA, használtuk mAb R4-6A2 és biotinilezett mAb XMG1.2 rendre (BD Pharmingen). Kihalás végezte a 405/490 nm-en TECAN microplate ELISA leolvasó (TECAN Crailsheim, Németország) a EasyWin szoftver (TECAN). A kimutatási határ az ELISA IFNg volt 20 pg /ml. Katalógusa Eredmények katalógusa létrehozása és fenotípusa gyomorrák sejtvonalak
8-tól gyomorrák mintákat 7 sejtvonalak nem lehetett megállapítani. Négy sejtvonalat származó CEA424 /Tag-transzgenikus egerek (424GC, egy férfi egér mGC3, női, mGC5, férfi és mGC8, női), valamint három sort CEA424 /Tag-CEA-transzgenikus egerek (mGC2 CEA, hím, mGC4 CEA, férfi; mGC11 CEA, nő). A szükséges idő, így kapjuk a tiszta hámsejt tenyészetekben igen változó (átlag 6 hónap, tartomány 3-16 hónap). Bár a tumor sejtek növekedését, mint letapadó sejtek tenyészetben, hajlamosak aggregátumokat képezni helyett terjed át a tenyészet szubsztrátot (1A.). Az epiteliális eredetű tumorsejtek igazoltuk morfológiai kritériumok jelenlétében mucin a sejten belül (1A.), És az expressziós analízise fehérje általánosan expresszált hámsejtekben (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (2A.) . Csökkentett tartalmát mucin találtak valamennyi sejtvonalban összehasonlítva a tartalom normál gyomornyálkahártya sejtek, de hasonló található a tumor sejtek a gyomorkarcinóma transzgenikus egerekben (1A. És [13]). Az összes sejtvonalat mutatja CEACAM1 és EpCAM a felszínükön kivéve mGC11 CEA, egyikük sem kifejezett E-kadherin (2A. És az adatokat nem mutatjuk). Az összes sejtvonalat expresszált MHC I. osztályú H-2k, és és egy sokkal alacsonyabb szinten, H-2d-molekulák (ábra. 2b). Mindkét fehérje expressziója erősen fokozott IFNg stimulációt. Expressziója nem MHC-II molekulák (I-AB) detektáltuk (ábra. 2B és az adatokat nem mutatjuk). CD54, CD80, CD86 vagy CD95 nem voltak kimutathatók bármelyik sejtvonal (az adatokat nem mutatjuk). 1. ábra morfológiája gyomorrák sejtvonalak nőtt egyrétegű tenyészetek vagy háromdimenziós gömböcskéket. (A) A sejtvonalakat mutatnak némileg eltérő epiteliális morfológiáját. A legtöbb sejt minden sejtvonalak jellegzetes intracelluláris vacuole (nyilak), amely valószínűleg tartalmaz mucinosus anyag festett vörös a PAS módszerrel (utolsó kép jobb alsó panel). (B) szferoidtenyészeteket kialakított tenyésztésével mGC8 tumorsejteket lágyagarban: balra, fáziskontraszt; jobbra, fluoreszcens festéssel nekrotikus sejteket propidium-jodiddal (piros) és az apoptotikus sejtek FITC-jelölt Annexin V (zöld, jelölt nyílhegyek), ahogyan az "Anyagok és módszerek". Nagyítás: bár megfelelnek az 10 um. MGC, rágcsáló gyomor karcinóma.
2. ábra sejtfelszíni expresszálódását epithelialis markerek (A) és az MHC I. osztályú és II molekulák (B). Gyomor karcinóma sejtvonalakat reagáltatunk vagy PE-jelzett (H-2Kb-re, H-2Db, I-Ab) vagy jelöletlen mAb (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM), majd inkubálás PE-jelölt anti-egér IgG-t vagy FITC -jelzett anti-patkány IgG-t és áramlási citometriával elemezzük. Hisztogramok megjeleníti a kapott eredmények elleni antitestek releváns antigéneket (nyitott szürke) vagy anélkül (nyitott fekete színűre) IFNy stimuláció és irreleváns antigéneket (szürke töltve görbék).
Annak meghatározása érdekében, a lehetséges az sejtvonalak használandó a generációs háromdimenziós tumor modellekben elemeztük tumorsejt szferoid képződést in vitro. Amint az ábrán látható. 1B a sejtvonalak képződött kompakt tumorsejt szferoidok 8 nap után a kultúra, amikor 103 sejteket oltottunk lágy agar-bevont 96 mérőhelyes lemezeken. Csak kisebb belüli kísérleti variáció volt megfigyelhető vonatkozó a méret a szferoidok. Festési propidium-jodiddal és FITC-jelölt annexin V kimutatták, hogy legalább a felületi réteg a szferoidok állt életképes sejtek nagyon kevés az elhalt sejteket a hozzá csatolt (ábra. 1B).
Transzgén expresszióját a gyomor karcinóma sejtvonalak
CEA és a Tag szolgálhat tumorspecifikus antigének (TSA) vagy a tumor-asszociált antigének (TAA) a transzplantáció után az újonnan létrehozott tumorsejtvonalak immunkompetens szingenikus C57BL /6 és CEA- vagy Tag-transzgenikus egerekben, ill. Bár műszeres a tumor kialakulását, Tag transzgén-expresszió nem mindig található meg a tumor származó sejtvonalakban Tag-transzgenikus egerek, mint a TRAMP tumorsejtvonalak [25]. Ez arra ösztönzött bennünket, hogy elemezze a kifejezés és az MHC I. osztályra korlátozott bemutatásához a Tag transzgén valamint a kifejezés a CEA, a létrehozott gyomor karcinóma sejtvonalakban. CEA sejtfelszíni expresszióját analizáltuk származó sejtvonalakban gyomor tumorok kettős transzgenikus egerek áramlási citometriával és Western blot analízissel. Míg a kifejezés a CEA transzgén szabályozza a teljes promoter régió a humán CEA gén expresszióját a címke által ellenőrzött minimális -424 /-8 bp CEA promoter (ábra. 3A). Mind a három kettős transzgénikus sejtvonalak kifejezve CEA a sejt felszínén (ábra. 3B). A gyomor karcinóma sejtvonal mGC2 CEA transzgén expresszálódik CEA mutatott a molekulatömege 180 kDa hasonló a talált SV40-transzformált afrikai zöld majom vese sejtek stabilan transzfektált CEA expressziós vektort és a CEA talált emberekben. Ahogy az várható volt, nem CEA volt kimutatható 424GC sejtek, amelyek hoztak létre egy CEA-negatív Tag-transzgenikus egér (3C.). Tag találták által kifejezett Western blot és immunfluoreszcens analízis minden származó sejtvonalakban szimpla és dupla-transzgenikus egerekben (ábra. 3D és az adatokat nem mutatjuk). Ez a megállapítás is támogatja az eredete a sejtvonalak a gyomorból carcinoma. Továbbá a 424GC sejtvonal hatékonyan bemutatott endogén úton feldolgozott Tag-eredetű peptidek, különösen a T1 epitóp, egy MHC-I-korlátozott módon által meghatározott indukció IFNy szekréciója byTag-specifikus CTL (ábra. 4A). Továbbá a sejtvonalak hatékonyan megölte Tag-specifikus CTL citotoxikus vizsgálati eljárásokban (ábra. 4B). 3. ábra expressziója a CEA és a Tag által gyomor karcinóma származó sejtvonalakban CEA424 /címke- vagy CEA424 /Tag × CEA-transzgenikus egerekben. (A) szerkezete a CEA és CEA424 /Tag transzgén. Az exon 1-10 humán CEA gén tartalmazza a betét kozmid klón cosCEA1 [14] jelennek színkóddal dobozok (világoskék, vezető, piros, IGV-szerű domén; kék IGC-szerű domén; szürke, transzmembrán domént , fehér, 5 'és 3'-nem transzlálódó régió exont. szegélyező vektor szekvenciákban vannak feltüntetve, mint fekete dobozok. a helyszín a CEA minimális promotert jelen az SV40 Tag gén transzgén-vonallal jelölt, a nevét, a transzgenikus vonalak jelennek a bal margón. (B) Áramlási citometria végeztük címkézése a jelzett sejtek vagy a CEA-specifikus monoklonális 26/3/13 (kitöltött ívek), vagy egy izotípusú antitest (nyitott görbék), majd PE-jelölt kecske anti-egér IgG antitestek. (C, D) a Western-analízis, 10 ug teljes fehérje kivonatok 424GC vagy mGC8 sejtek létre CEA424 /Tag-transzgenikus egerek és mGC2CEA és mGC4CEA sejtek CEA424 /Tag × CEA-transzgenikus egerek méret elválasztottuk SDS-poliakrilamid gél-elektroforézis, átvittük egy membrán és reagáltatjuk a CEA-specifikus mAb 26/3/13 (C) vagy hörcsög poliklonális anti-Tag antitestek (D). Kivonat Cos7L-CEA és Meth-A sejteket stabilan transzfektált kódoló expressziós vektorok CEA vagy címke hiányzik a régióban a nukleáris lokalizációs szignál (cTag) szolgált pozitív kontrollként. A méretek a fehérje markerek szerepelnek a bal margó.
4. ábra MHC-I-korlátozott bemutatása Tag epitópok rágcsáló gyomor karcinóma sejtvonalakban. (A) epitóp specifikus CTL generált C57BL /6 egerekben DNS immunizálás egy Tag expressziós vektorba, és azt követő expanzió által in vitro stimulálás Tag pepiiddel feltöltött RBL5 sejteket inkubáltunk besugárzott 424GC, 424 fibroblasztok, RBL5 és Tag T1, T2 /3 vagy T4 peptid-pulzáló RBL5 sejteket 24 órán és IFNy szekrécióját a táptalajok ELISA-val meghatároztuk. Szekréciója IFNy által CTL stimulált 424GC sejtek azt jelzi, hogy ezek a sejtek jelen SV40Tag-ot-specifikus peptidek egy MHCI-korlátozott módon. (B) tenyészetét a 424GC és 424 fibroblasztok kezeltük 107 Tag-specifikus CTL egy Petri-csészében 48 órán át. Ezt követően a nem adherens (halott) sejteket eltávolítottuk. Bal, kokultivációt előtt CTL kezelés; jobb, együttenyésztéssel kezelés után. Nyilak jelzik a helyzet a tumorsejtek hozzáadása előtt CTL.
Tumorképző a gyomor karcinóma sejt vonalak
Annak megállapításához, a tumorképző sejtvonalak, a különböző számok (1 × 10 5; 3 × 10 5; 1 × 10 6) sejtet injektáltunk szubkután C57BL /6 egerekben. Az összes sejtvonalat képesek alkotni tumorok 100% az állatok, ha legalább 3 × 10 5 tumorsejteket injektáltunk (ábra. 5A). A tumorok növekedése szinte exponenciálisan késedelem nélkül, amíg elérték a térfogat 300 mm 3. Nem távoli áttét nem mutatható alatt a megfigyelési idő. Western-blot-analízist a transzplantált daganatok bizonyították, hogy mindkét transzgének fejeztük a sejtvonalak in vivo katalógusa (az adatokat nem mutatjuk be). Megduplázódása szer a tumorsejtek in vivo
kiindulási tumor terhelés 10 6 sejt között változott 7,2 (mGC8) és 13,8 nap (mGC3) (ábra. 5A). In vitro katalógusa, az összes sejtvonalban hasonló megduplázása idő körülbelül 3 nap (ábra. 5B). Mi tovább képest szubkután tumor kialakulását a sejtvonalak a vad típusú (C57BL /6) és transzgenikus egerekben. Nem volt szignifikáns különbség a daganatbeviteli és tumornövekedés a sejtvonal 424GC amikor szubkután injektáltunk vad típusú vagy CEA424 /Tag-transzgenikus egerek (6a.), Valamint a mGC11 CEA sejtek injekció után a vad típusú és CEA424 /Tag-CEA-transzgenikus egerek (6B.). 5. ábra In vivo az (A) és az in vitro növekedési jellemzőit a (B) a rágcsáló gyomor karcinóma sejtvonalakban. Három egérből injektáltunk a jelzett tumorsejt dózisban. A tumornövekedést mennyiségileg két merőleges mérés a tumor átmérőjét és mennyiségének kiszámításával leírt Anyagok és módszerek részben. Annak meghatározására, az in vitro növekedési jellemzőket, sejteket 24 lyukú lemezeken kezdve a jelzett sejtek számát. Különböző időpontokban a sejteket a három párhuzamos lyukból összegyűjtöttük és megszámoltuk. Az eredményeket átlag +/- standard deviáció (SD). A legjobb illeszkedést görbék valamint kétszeresére napokban (zárójelben) alkalmazásával számoltuk a GraphPad Software.
6. ábra A növekedés a gyomor karcinóma sejtvonalak a vad típusú és a transzgenikus egerekben. 3 × 105 424GC sejtet injektáltunk szubkután C57BL /6 és CEA424 /Tag-transzgenikus egereket (A) vagy a 3 × 105 mGC11CEA sejtet injektáltunk C57BL /6 és CEA424 /Tag × CEA-kettős transzgenikus egereket (B). A tumornövekedést mennyiségileg két merőleges mérés a tumor átmérőjét és mennyiségének kiszámításával leírt Anyagok és módszerek részben. Az eredményeket átlag +/- SD (n = 3).
Immunogenitása gyomor karcinóma sejtvonalak
hasonló növekedés a tumorsejtvonalak a vad típusú és a transzgenikus egerekben azt jelzi, hogy nincs szignifikáns immunválaszt sem a tumor antigén (Tag, CEA) történt tumoros egerek. Valóban, nem Tag-specifikus CTL lehetett azonosítani a lépben a tumor hordozó vad típusú egerekben upon progresszív szubkután növekedését Tag-expresszáló gyomor karcinóma sejteket (nem közölt adatok). Azonban, amikor kettős transzgenikus sejtvonalak nőtt egerekben, a CEA-specifikus antitestek lehetett azonosítani a vad típusú C57BL /6 egerekben, de nem CEA-transzgenikus egerekben (ábra. 7a). Ezenkívül három immunizálás C57BL /6 egerek 106 fagyasztva-felolvasztott mGC8 tumorsejtek hetenként vagy meggátolta A szubkután beadott élő mGC8 sejtek teljesen vagy tumor kinövés késett közel három hétig függően az injektált tumorsejtek dózis (ábra. 7B , C). Ezek a kísérletek azt bizonyítják, hogy a tumor sejtvonalak immunogén bizonyos feltételek mellett. Azonban, C57BL /6 egerekben nem spontán szerelhető egy hatékony tumor progresszió-korlátozó immunválaszt vagy tumor antigén alatt szubkután tumor növekedését. 7. ábra immunogenitása MGC sejteket. (A) Az anti-CEA antitestek meghatároztuk a szérumban a C57BL /6 és CEA-transzgenikus egerekben áramlási citométer segítségével. Minden egerek progresszíven növekvő tumorok nélkül nyílt nekrózis transzplantáció után, és a növekedés a jelzett sejtvonalak 35-40 napig. mGC4CEA sejteket inkubáltunk szérumban a jelzett egerek különböző hígításait és kötött primer antitesteket egy PE-konjugált anti-egér antitest. (B, C) Három C57BL /6 egerekben mindegyik szubkután háromszor egyhetes időközönként 1 × 106 mGC8 leölt sejtek által két fagyás-olvadás ciklusok. Két héttel az utolsó vakcinálás után, az egereket injekciójával 1 × 106 (B) és 3 × 106 (C) élő mGC8 sejtek, illetve (betöltött körök). Kontrollként tumorsejteket injektáltunk nem-immunizált egerek (üres körök). A tumor térfogatát leírt módon számított Anyagok és módszerek részben. Az eredményeket középértékek +/- SD.
Megbeszélés
A fő cél a jelen tanulmány volt, hogy létrehoz egy terápiás modellben gyomorrák immunrendszerű egereken, amely biztosítja egy állat modell, hogy értékelje az anti-tumor immunitás és immunterápiás stratégiák.

• Elsődleges gyomor non-Hodgkin limfóma kínai betegek: klinikai jellemzők és prognosztikai factors
• GASTRICHIP: D2 reszekció és hyperthermiás hasüregbe kemoterápia lokálisan előrehaladott gyomorrák: randomizált és multicentrikus fázis III study