Charakterizácia žalúdočných bunkové línie adenokarcinómu naviazaných z /SV40 T antigén u myší transgénnych CEA424 s alebo bez ľudských CEAtransgene

Charakteristika žalúdočných bunkových línií adenokarcinóme naviazaných z CEA424 /SV40 T antigénu
-transgenic myši s alebo bez ľudského CEA
transgénne
abstraktné
pozadia
karcinómu žalúdka je jedným z najčastejších nádorových ochorení na celom svete , U pacientov s karcinómom žalúdka v pokročilom štádiu choroby majú zlú prognózu, vzhľadom k obmedzenej účinnosti dostupných terapií. Preto je vývoj nových terapií, ako imunoterapia pri liečbe rakoviny žalúdka, je nanajvýš dôležité. Vzhľadom k tomu, využiteľnosť existujúcich predklinických modeloch pre hodnotenie imunoterapiou pre žalúdočných adenokarcinómu je obmedzená, cieľom tejto štúdie bolo stanoviť myšiach in vivo
modely, ktoré umožňujú postupné zlepšenie imunoterapiou rakoviny žalúdka.
Metódy
Vzhľadom k tomu, žiadne myší adenokarcinóm bunkové línie žalúdočnej sú k dispozícii sme založili štyri bunkové línie (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) zo spontánne rozvojových nádorov CEA424 /SV40 T antigénu (CEA424 /deň) u myší a troch bunkových línií odvodených z dvojito transgénnych potomkovia CEA424 /Tag myši dali po krížení s ľudským karcinoembryonální antigén (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) myší (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /deň je transgénne C57BL /6 myší kmeň nesúci značku pod kontrolou -424 /-8 CEA bp promótorom génu, ktorá vedie k rozvoju invazívneho adenokarcinómu v žalúdočných žliaz. Línia nádorových buniek, ktoré vznikli z CEA424 /Tag-CEA myší exprimujú dobre definované tumor antigén CEA pod kontrolou jeho prirodzených regulačných elementov.
Výsledky
epiteliálneho pôvodu nádorových buniek bola preukázaná pomocou morfologických kritérií, vrátane prítomnosti mucín v bunkách a expresie adhézie molekúl EpCAM a CEACAM1. Všetky bunkové línie dôsledne vyjadrujú transgénov CEA a /alebo tagu a Class I molekuly MHC čo vedie k ich náchylnosť k lýze Tag-špecifické CTL in vitro
. Aj napriek prezentáciu CTL epitopov odvodených z transgénnych produktov Bunkové línie nádoru boli tumorigénny zakorenených do C57BL /6, CEA424 /deň alebo CEA424 /Tag-CEA-transgénne hostitelia a žiadne významné rozdiely v nádoru sa a rast nádorov boli pozorované u rôzne hostitelia. Hoci žiadne spontánne odmietnutie nádoru bol pozorovaný, vakcinácia myší C57BL /6 s lyzáty z karcinómu žalúdka bunkových línií chránených C57BL /6 myší z nádorových výzva, demonštrujúcich tumorigeničnosti z nádorových bunkových línií v netransgénnou myšou na H-2 B haplotypu.
Záver
Tieto nádorové bunkové línie naočkované v rôznych syngenních hostiteľov by sa ukázalo byť veľmi užitočné pre optimalizáciu imunoterapia režimy, ktoré majú byť definitívne testované v transgénnych zvierat rozvojových primárne žalúdočné karcinómy.
pozadí
karcinóm žalúdka je druhým najčastejším nádorovým ochorením po celom svete [1]. To je často nie je zistená až v pokročilom štádiu; v dôsledku toho miera prežitia 5-ročnej nízka (10-20%). Vzhľadom k miestnemu invázie a metastáz, radiačná terapia alebo chemoterapia nijako významne predlžujú dĺžku alebo kvalitu života pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka. Je preto potrebné vývoj nových neoadjuvantnej a adjuvantnej spôsoby liečby. Imunoterapia by mohla byť sľubná alternatívna možnosť. Rad imunoterapeutické prístupy, ako tomu prenos tumor-špecifických T-lymfocytov, a vakcináciu za použitia buď nedefinované nádorové antigény odvodené od nádorových lyzátov a nádorových bunkových línií alebo definovaným nádorovým antigénom obvykle prezentované dendritickými bunkami sú hodnotené z hľadiska rôznych druhov rakoviny [2, 3] , U karcinómov žalúdka, imunoterapia nebol braný vážne do úvahy vzhľadom k predstave, že rakovina žalúdka je zle imunogénna. Preto len malý počet klinických štúdií imunoterapia boli popísané [4-7]. Okrem toho, len obmedzený počet nádorom spojených antigénov, s potenciálne použitie pre imunoterapiu boli označené [8-11]. V dôsledku toho je schopnosť imunitného systému rozpoznávať a odstránenie karcinómov žalúdka, je do značnej miery neznámy. Získať prehľad o účinnosti rôznych imunoterapie pri liečbe rakoviny žalúdka a na objasnenie základného mechanizmu indukovaných imunitných odpovedí sú nevyhnutné zvieracie modely adenokarcinóme žalúdka.
Na tento účel, niekoľko skupín vrátane tej našej nedávnej dobe založená transgénne alebo knock odhlásenie myšiach kmeňov, ktoré vyvinú žalúdočné adenómov alebo adenokarcinómy v rôznych častiach žalúdku po rôznych čakacích dôb [12]. Vyvinuli sme transgénne rakovina žalúdka C57BL /6 myší model založený na SV40 veľký T antigén (SV40 Tag) transgénu riadená promótorom génu ľudský karcinoembryonální antigén (CEA) (od -424 do -8 translačného štartového miesta) [13 ]. U 100% zvierat, dysplastické krypta formácie v žalúdočnej sliznici je pozorovaná pylorických regiónu už v 30. deň staré CEA424 /SV40 Tag-transgénnych myší. Dysplázia postupuje k invazívnych karcinómov a do 50 dní po celý pyloru žalúdočnú sliznicu bola nahradená bunkách karcinómu. Vo veku medzi 90 až 110 dní transgénne myši stávajú umierajúce a umierajú na podvýživu pravdepodobne kvôli zápche pyloru [13]. Kontrola Tag expresia minimálnym promótorom génu CEA umožňuje expresiu nádoru riadené CEA krížením CEA424 /SV40 Tag-transgénnych myší s ľudským CEA
-transgenic myší C57BL /6, ktoré exprimujú transgén CEA v podobnej spatiotemporal výraz vzorka, ako sa zistilo u ľudí [13, 14]. Ľudský nádorový marker CEA je exprimovaný v mnohých ľudských adenokarcinómov, vrátane viac ako 50% karcinómov žalúdka [15, 16]. CEA sa stále viac používa ako cieľový antigén pre rôzne protilátkami a bunkami sprostredkované tumor imunoterapeutické prístupy [17-19]. CEA a štítky sú vhodné imunoterapia cieľové antigény, pretože rad T bunkových epitopov týchto antigénov boli identifikované v C57BL /6 myší [20-22]. Aj keď sa tieto kmene transgénnych myší zrkadlo veľmi úzko žalúdočné rozvoj adenokarcinómu u ľudí, experimentovanie s týchto myší je pomerne časovo náročné a nákladné vzhľadom na ťažkosti pri stanovení rastu nádoru a požiadavka chovu transgénnych myší. Z tohto dôvodu je žiaduce, aby sa syngenní nádorové transplantovateľných systém žalúdočných adenokarcinómy u imunokompetentných myší pre optimalizáciu danej imunoterapia protokolu pred tým, než sa hodnotí u transgénnych myší. Tu popíšeme myšieho adenokarcinóme žalúdka bunkové línie zistené spontánne rozvojových nádorov SV40 Tag transgénnych myší, ktoré sú tumorogénnu v oboch syngenní divokého typu a transgénnych myší.
Metódy
myších kmeňov a bunkových línií
CEA424 /Tag- transgénnych myší (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgénnych myší (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm, CEA2682) a F1 myší z kríženia CEA424 /Tag-transgénne a CEA-transgénnych myší boli popísané skôr [13, 14]. Medzitým transgénnej línie boli spätne krížené do myší C57BL /6 (H-2 b) viac ako 15 generácií. Tieto transgénnej línie, rovnako ako C57BL /6 myší (Charles River, Sulzfeld, Nemecko) boli chované a udržiavané za štandardných podmienok bez patogénov v živočíšnej zariadení Ústavu pre chirurgické výskum, Ludwig-Maximilians-univerzite v Mníchove. Pokusy na zvieratách boli vykonávané po schválení miestnym dobrých životných podmienok zvierat výboru. Pre karcinogenity a Imunogenicita Testy myši boli použité v 8-12 týždňov veku. Africké zelené opice obličiek Cos7L bunková línia bola získaná z American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). BALBI /c odvodené fibrosarkómu Meth-A láskavo poskytol W. Deppert (Heinrich-Pretajte-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA bunky boli získané transfekcia meth-A buniek s PRC /CMV-CEA expresné plazmidy za použitia Fügen ™ 6 transfekčního činidla (Roche Molecular Biochemicals, Švajčiarsko) podľa inštrukcií výrobcu. Meth-A-cTag a RBL5 /T transfektanty boli predtým popísané [23].
Vznik karcinómu žalúdka bunkových línií
žalúdočné karcinómy používané na stanovenie nádorových bunkových línií boli získané z 8 rôznych, 13 týždňov starých myší. Štyri odvodený od CEA424 /deň transgénnych myší a 4 od CEA424 /tag-CEA-dvojlôžkových transgénnych myší. Mená bunkové línie odvodené z druhej myší sú označené indexom "CEA". Všetky kultúry boli vykonané v RPMI1640 doplnenom 10% tepelne inaktivovaného fetálneho teľacieho séra (FCS "Gold"; PAA Laboratories, Cölbe, Nemecko), 2 mM L-glutamínom, 100 U /ml penicilínu, 100 ug /ml streptomycínu, neesenciálna aminokyselín a 1 mM pyruvátu sodného (Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Nemecko), ďalej len nádoru média (TM). Nádorové tkanivá boli dôkladne premyté vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) doplnenom 200 ug /ml gentamycínu a 2,5 ug /ml amfotericínu B (GIBCO /Invitrogen), rezané do 1 mm 3 ks skalpelom a umiestnené do tkanivové kultúry banky obsahujúcej TM. Kultivačné médium bolo menené každé 3-4 dni. Epitelové bunky a fibroblasty vyrastajúce z fragmentov tkaniva boli oddelené od buniek škrabacie, selektívne trypsinizace a selektívne pasážováním s 1000 U /ml kolagenázy a 500 U /ml hyaluronidázy (Biochrom, Berlin, Germany). Počas disociácia, banky boli sledované pod inverzným mikroskopom a štiepenie bolo zastavené keď fibroblasty, ale nie epitelové bunky boli oddelené (trypsín) alebo naopak (kolagenáza /hyaluronidázy). Tento postup sa opakuje raz týždenne, kým sa všetky fibroblasty boli odstránené z nádorových bunkových kultúr. V priebehu tvorby bunkovej línie 424GC, je Fibroblast kultúra bola založená z cudzorodých fibroblastov (424 fibroblastov). Sféroidy vytvorený počas 5-7 dní po naočkovaní 0,5 x 10 3 mGC8 bunky do Noble agaru (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Nemecko) -coated 96-jamkových doštičiek (TPP-Biochrom, Berlin, Germany) v 200 ul TM, ktoré sa nahradí čerstvým médiom každé dva dni. Aby bolo možné posúdiť životaschopnosť buniek na povrchu sféroidov, sféroidy boli inkubované s FITC-značeným annexinu V (annexin V FITC Apoptosis Detection Kit; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Nemecko) na detekciu apoptotických buniek alebo propidiumjodidom k identifikácii nekrotické bunky podľa odporúčaní výrobcu.
Prietoková cytometria analýzy
na farbenie buniek na povrchu boli trypsinizovány, premyté PBS a suspendované v PBS /0,5% hmotnosť /objem hovädzieho sérového albumínu (BSA) s prídavkom 0,02% w /v sodík azid. Pre indukciu MHC molekúl, boli bunky inkubované s 20 ng /ml interferónu-gama (IFNy; Peprotec, London, UK) počas 24 hodín pred zberom. Nešpecifická väzba protilátok na Fc receptory bola blokovaná preinkubací buniek s 1 ug /10 6 buniek anti-CD16 /CD32 monoklonálne protilátky (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Nemecko) počas 15 minút , Následne boli bunky inkubovali s 0,5 ug /10 6 buniek mAb záujmu po dobu 30 min pri teplote 4 ° C, premyje sa dvakrát, a kde je to vhodné, následne sa nechá reagovať s druhou kroku protilátkou počas 15 minút pri teplote 4 ° C , Bunky boli dvakrát premyté a analyzované pomocou FACScan (bd, Mountain View, CA). Mŕtve bunky boli vylúčené propidium jodidu farbenie. Boli použité nasledujúce činidlá a monoklonálne protilátky proti myšiam antigénom od BD Pharmingen: fykoerytrín (PE) konjugovaným myšiam IgG 2 a anti-IA b, biotinylizované myšou IgG 2 a anti-H-2D b , PE-konjugovaná myšou IgG 2aanti-H-2K b, PE-konjugovaný anti-myšou CD80 /B7-1, PE konjugovanou potkania IgG 2 a anti-myšou CD40, PE konjugovanou potkania IgG 2 a anti-myšou CD86 /B7-2, fluorescein izotiokyanát (FITC) konjugovaným, arménsky škrečok IgG 2 anti-myšou CD80 /B7-1. FITC-konjugovanou potkania IgG 1 mAb R3-34, PE konjugovanou potkania IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugovaná myšou IgG 2 a anti-potkania Sirpa, FITC-konjugovaná škrečkov arménsky IgG 2anti-KLH a PE konjugovanou potkania IgG 2amAb slúžila ako kontrolná izotypovo. Mouse anti-myšou mAb CEACAM1 CC1, potkania anti-myšou CEACAM1 AgB10 [24] a potkania anti-myšou E-cadherinu a anti-myšou monoklonálne protilátky EpCAM boli láskavým darom od K. Holmes, University of Colorado, BB Singer, Charité v Berlíne, a P. Ruf, Trion Research, Mníchov, v danom poradí. Cross-reaktívny myšou anti-ľudskej mAb CEACAM 4.3.17 (špecifický pre ľudský CEA /CEACAM5 u myší) boli zakúpené od GENOVAC (Freiburg, Nemecko). Myšou protilátky boli detekované kozí PE-konjugovaným anti-myším IgG, krysích protilátok s FITC-konjugovanej oslie anti-potkania IgG (DAKO).
Detekcia CEA a SV40 Tag pomocou Western blot
Exponenciálne rastúce bunky karcinómu žalúdka , Cos7L bunky, Cos7L-CEA transfektanty, bunky Meth-a a Meth-a-cTag transfektanty, ktoré exprimujú skrátený cytoplazmatickej umiestnené SV40 Tag zozbieraného trypsinizací. Bunky boli trikrát premyté v PBS a lyžovanie v hustote 10 6 buniek /ml v lyzačním pufri. Koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Bunkové extrakty, ktoré zodpovedajú 10 ug proteínu boli oddelené elektroforézou na 10% SDS polyakrylamidovom gélu (Invitrogen, Karlsruhe, Nemecko), prevedených na polyvinylidénfluorid membrány a inkubované s 10 ug /ml anti-ľudskej mAb CEACAM 4/3/17 alebo jeho 1: 100 zriedený škrečok anti-SV40 Tag antisérum (láskavý dar od K.-H. Scheidtmann, University of Bonn). Naviazané protilátky boli podrobené reakcii s chrenom peroxidázy značené sekundárne protilátky a vizualizované za použitia chemiluminiscenčného on-line systém detekcie. (ECL, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Nemecko)
Cell stanovenie zdvojnásobenie času
In vitro
zdvojnásobenie doby bunkových línií bola stanovená nanesením karcinomové bunky žalúdočnej v 24-jamkových doštičkách v TM v uvedených číslach východiskových buniek a evidencia vzoriek buniek z troch jamiek po miernom trypsinizací každé 3 dni po dobu 21 dní. In vivo
zdvojnásobenie doby boli vypočítané z meraní nádorového objemu (pozri nižšie), po inokulácii s tromi rôznymi číslami východiskovým buniek (tri myši na skupinu). Zdvojnásobenie doby boli vypočítané z log fázy rastových kriviek.
Karcinogenity a imunogenita bunkových línií
pre nádorové bunky posudzovanie karcinogenity boli trikrát premyté v PBS a 50 ul bunkovej suspenzie s uvedeným počtom buniek podali podkožne do oholené pravého boku myší. Na stanovenie imunogenity, 10 7 nádorových buniek /ml boli Lyžovanie pomocou dvoch po sebe idúcich zmrazení a rozmrazení. Myši imunizovaných štyrikrát v týždenných intervaloch s 10 6 lyžovaných nádorových buniek do pravého boku. O tri týždne neskôr boli myši napádaný subkutánne 3 x 10 6 životaschopných nádorových buniek do ľavého boku. Experimentálne skupiny sa skladala z 4-6 myší. Vývoj nádoru nasledovala sériová merania veľkosti nádoru a objemu nádoru bola vypočítaná podľa rovnice: Objem nádoru (mm 3) = d 2 x D /2, kde d a D sú najkratšie a najdlhší priemer nádoru, v danom poradí. Zvieratá boli zabité, kedy nádory dosiahli objem 300 mm 3.
Generácia cytotoxických T-lymfocytov špecifických pre Tag (CTL) a stimuláciu karcinómu žalúdka bunkové línie
CTL boli vytvorené ako bolo opísané skôr [23] , Krátko, myši boli Inokulované intradermálne 1 um častice zlata potiahnutých Tag expresným plazmidom (BMG /CT-Ag.1 [23]) do oholené kože brucha za použitia tlaku hélia (200 psi) poháňané Biolistic zariadenia (Helios génové delo; bio-Rad Laboratories GmbH, Mníchov, Nemecko). Slezinnej bunky získané 14 dní po očkovaní boli v týždňových intervaloch restimulovány ožiareným RBL5 /T transfektantů v RPMI-1640/10% FCS, doplnenom 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T je vírus-transformované T-bunková línia lymfómu Rauscher odvodená z C57BL6 (H-2b) myši transfekované s SV40 Tag expresného plazmidu. Pre generovanie epitop-špecifické CTL, slezinnej bunky odobraté 10 dní po očkovaní boli opätovne stimulované in vitro ožiareným, Tag RBL5 buniek peptidy pulzný. T1, T2 /3 a T4 epitop špecifita CTL bola kontrolovaná stanovením obsahu IFNT médiá po stimulácii s cieľovými bunkami peptid-pulzný s použitím testu ELISA.
Detekciu cytokínov ELISA
pre zachytenie a detekcie IFNy v supernatant konvenčnými sendvičovej ELISA, sme použili mAb R4-6A2 a biotinylizované mAb XMG1.2, v uvedenom poradí (BD Pharmingen). Zánik bola analyzovaná pri 405/490 nm na Tecan mikrodoštičiek ELISA čítačke (TECAN Crailsheim, Nemecko) so softvérom EasyWin (Tecan). Detekčný limit testu ELISA pre IFNr bol 20 pg /ml.
Výsledky
Vznik a fenotyp karcinómu žalúdka bunkové línie predaj z vzorkách 8 karcinómu žalúdka mohlo byť zavedených 7 bunkové línie. Štyri bunkové línie boli odvodené z CEA424 /Tag-transgénnych myší (424GC, z mužského myši; mGC3, samicu, mGC5, pohlavie; a mGC8 zásuvka) a tri riadky z CEA424 /Tag-CEA-transgénnych myší (mGC2 CEA, samec; mGC4 CEA, samec; mGC11 CEA, samice). Doba potrebná na získanie čistých epitelové bunkové kultúry značne líšila (priemer 6 mesiacov, rozmedzie 3-16 mesiacov). Aj keď nádorové bunky rastú ako adherentní bunky v kultúre, majú tendenciu tvoriť agregáty, ako šíri cez kultivačné substrát (Obr. 1A). Epiteliálne pôvod nádorových buniek bola preukázaná pomocou morfologických kritérií, vrátane prítomnosti mucínu v bunkách (Obr. 1A) a analýzu expresie proteínu zvyčajne vyjadrená v epiteliálnych buniek (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (obr. 2A) , Zníženým obsahom mucínu bol nájdený vo všetkých bunkových líniách v porovnaní s obsahom v normálnej žalúdočnej epiteliálne bunky, ale podobný tomu, ktorý našiel v nádorových bunkách v karcinómu žalúdka v transgénnych myší (obr. 1A a [13]). Všetky bunkové línie zobrazená CEACAM1 a EpCAM na svojom povrchu, s výnimkou mGC11 CEA, žiadny z nich sa vyjadrila E-cadherin (viď obr. 2A a dáta nie sú ukázaná). Všetky bunkové línie vyjadrená MHC triedy I H-2K a, a na oveľa nižšej úrovni, H-2D molekuly (obr. 2B). Expresia oboch proteínov bola výrazne zvýšená IFNT stimuláciu. Bola zistená žiadna expresia molekúl MHC triedy II (I-Ab) (obr. 2B a dáta nie sú ukázaná). CD54, CD80, CD86 alebo CD95 boli na akejkoľvek bunkové línie nie je detekovaný (dáta nie sú uvedené). Obrázok 1 Morfológia bunkových línií karcinómu žalúdka pestovaných ako jednovrstvové kultúry alebo trojrozmerných sféroidy. (A), bunkové línie vykazujú nepatrne odlišnú epiteliálne morfológiu. Väčšina buniek všetkých bunkových línií obsahovať charakteristický vnútrobunkovej vakuol (šípky), ktorý pravdepodobne obsahuje mucinózního materiál sfarbený na červeno metódou PAS (posledný obrázok vpravo v spodnom paneli). (B) sféroidy tvorený kultiváciou nádorové bunky mGC8 na mäkkom agare: ľavá, fázového kontrastu; Dobre, fluorescenčné farbenie odumretých buniek propidium jodidu (červená) a apoptotických buniek s FITC-značeným AnnexinV (zelená, označených šípkami), ako je popísané v časti "Materiál a metódy". Zväčšenie: pruhov zodpovedá 10 um. MGC, myší karcinóm žalúdka.
Obrázok 2 bunkovom povrchu expresiu epitelových markerov (A) a MHC triedy I a II molekúl (B). Karcinóm žalúdka bunkové línie sa nechá reagovať buď s PE-značené (H-2 kB, H-2 dB, I-Ab) alebo neznačených mAb (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM), s následnou inkubáciou s PE-značený anti-myším IgG alebo FITC značená anti-potkania IgG a analyzované prietokovou cytometriou. Histogramy zobrazí výsledky získané s protilátkami proti antigénom s príslušnými (otvorené sivá) alebo bez (open black) pred stimuláciou IFNT nerelevantné antigén (sivá plné krivky).
Na stanovenie potenciálu bunkových línií, ktoré majú byť použité pre generovanie trojrozmerných modelov nádoru sme analyzovali nádorových buniek guľovitý tvorbu in vitro. Ako je znázornené na Obr. 1B bunkové línie tvorili kompaktný nádorových buniek sféroidov po 8 dňoch kultivácie, keď boli bunky vrúbľovať do 103 mäkkom agare potiahnuté 96-jamkové doštičky. Bolo pozorované len minoritnou vnútri experimentálne variácie týkajúce sa veľkosti guličiek. Farbením propidium jodidom a FITC-značeného annexinu V ukázali, že aspoň povrchová vrstva týchto guličiek sa skladala z životaschopných buniek s veľmi málo mŕtvych buniek k nej pripojených (Obr. 1B).
Expresia transgénu pomocou bunkovej línie karcinómu žalúdka
CEA a štítky môžu slúžiť ako antigény špecifické pre nádory (TSA) alebo s nádorom spojených antigénov (TAA) po transplantácii novo vzniknutých nádorových bunkových línií v imunokompetentných syngenních myší C57BL /6 a CEA- alebo Tag-transgénnych myší, v danom poradí. Aj keď napomáha tvorbe nádorov, Tag expresie transgénov, nie je vždy v nádorových bunkových líniách, odvodených z Tag-transgénnych myší, rovnako ako v TRAMP nádorových bunkových líniách [25]. To nás viedlo k analýze I-obmedzené prezentáciu prejavu a MHC tagu transgénu, rovnako ako expresia CEA vytvorených bunkových línií karcinómu žalúdka. CEA expresie na povrchu buniek bola analyzovaná v bunkových líniách odvodených z nádorov žalúdka z dvojitého transgénnych myší pomocou prietokovej cytometrie a Western blot analýzou. Kým expresie transgénu CEA je regulovaný kompletný promotorové oblasti ľudského CEA génu expresie Tag je riadená minimálna -424 /-8 CEA bp promótorom (obr. 3A). Všetky tri dvojito transgénne bunkové línie vyjadrené CEA na bunkovom povrchu (obr. 3B). V žalúdočnej bunkovej línii karcinómu mGC2 CEA transgén exprimovaný CEA vykazuje molekulovú hmotnosť 180 kDa podobný tomu, ktorý našiel v afrických mačiakov obličkových buniek SV40-transformovaných stabilne transfekciou s CEA expresného vektora a na CEA nájdené u ľudí. Ako sa dalo očakávať, nie je CEA bola detekovaná u 424GC bunkách, ktoré boli stanovené z CEA-negatívne Tag-transgénne myši (Obr. 3C). Bolo zistené, značka byť vyjadrený metódou Western blot a imunofluorescenčné analýzy vo všetkých bunkových líniách odvodených z jedinej a dvakrát transgénnych myší (obr. 3D a dáta nie sú ukázaná). Toto zistenie tiež podporuje vznik bunkových línií zo žalúdka karcinómy. Okrem toho 424GC bunková línia účinne prezentované endogénne spracovaných peptidov Tag odvodené, najmä T1 epitop, v MHC-I obmedzeným spôsobom, ako je stanovené podľa indukciou sekrécie IFNT byTag špecifických CTL (obr. 4A). Okrem toho, že bunkové línie boli účinne zabití Tag-špecifické CTL cytotoxických stanoveniach (Obr. 4B). Obrázok 3 Expresia CEA a Tag žalúdočnými karcinómu bunkových línií odvodených z CEA424 /Tag- alebo CEA424 /deň × CEA-transgénnych myší. (A) Štruktúra CEA a CEA424 /Tag transgénov. Exóny 1-10 ľudského génu CEA obsiahnuté v inzertu klonu kozmid cosCEA1 [14] sú uvedené v podobe farebných polí (svetlo modrá, červená, vedúci; IGV-podobné domény, modrý IGC doména, podobná, šedá, transmembránovú doménu ,., biela, 5 'a 3'- netranslatované oblasti exóny sprievodné vektorové sekvencie sú označené ako čierne skrinky umiestnenie CEA minimálneho promotora prítomného v SV40 Tag génového transgénu je označená prerušovanou čiarou, názvy transgénnych línií sú uvedené na ľavom okraji. (B) Prietoková cytometria bola vykonaná na označenie z uvedených buniek, a to buď s CEA-špecifické mAb 26/3/13 (plné krivky) alebo izotypovo uzavreté protilátkou (otvorené krivky) a následne kozie PE-značený anti-myšou IgG protilátky. (C, D) pre Western analýzu, 10 ug celkového proteínu z extraktov buniek 424GC alebo mGC8 naviazaná z CEA424 /deň transgénnych myší a mGC2CEA a mGC4CEA buniek z CEA424 /deň x CEA-transgénnych myší boli veľkosť separované SDS elektroforéza na polyakrylamidovom gélu, prenesená na membránu a nechá sa reagovať s CEA-špecifické mAb 26/3/13 (C) alebo škrečkov polyklonálne anti-Tag protilátky (D). Extrakty z Cos7L-CEA a buniek Meth-A stabilne transfekovány expresné vektory kódujúce CEA alebo tagu chýba oblasť s jadrovým lokalizačným signálom (cTag) slúžil ako pozitívna kontrola. Veľkosti proteínových markerov sú uvedené v ľavom okraji.
Obrázok 4 MHC triedy I-obmedzené prezentáciu Tag epitopov pomocou myších bunkových línií karcinómu žalúdka. (A) epitop špecifické CTL generované v C57BL /6 myší pomocou DNA imunizácie s Tag expresným vektorom a následné expanzie in vitro stimuláciou s Tag RBL5 bunkami peptid vložený boli inkubované s ožiarených 424GC, 424 fibroblastov, RBL5 a značiek T1, T2 /3 alebo T4 peptid-pulzný RBL5 bunky po dobu 24 hodín a ich vylučovanie IFNy do kultivačného média bola stanovená pomocou ELISA. Sekrécia IFNT CTL stimulovanej 424GC buniek, naznačuje, že tieto bunky prítomné SV40Tag-špecifické peptidy vo MHCI-obmedzeným spôsobom. (B) kultivácia z 424GC a 424 fibroblasty boli ošetrené 107 Tag-špecifické CTL v Petriho miske po dobu 48 hodín. Potom, neadherentní (mŕtve bunky) boli odstránené. Left, kultivácia pred liečbou CTL; Dobre, kultivácia po liečbe. Šípky označujú pozíciu nádorových buniek pred pridaním CTL
karcinogenity z bunkových línií karcinómu žalúdka
Na určenie karcinogenity bunkových línií, rôzne čísla (1 x 10 5;. 3 x 10 5, 1 x 10 6) buniek bolo subkutánne podali do C57BL /6 myší. Všetky bunkové línie boli schopné tvoriť nádory u 100% zvierat, ak je aspoň 3 x 10 5 Nádorové bunky boli injikované (Obr. 5A). Nádory narástli takmer exponenciálne bez akéhokoľvek oneskorenia, kým dosiahli objem 300 mm 3. Počas doby pozorovania by mohli byť detekované žiadne vzdialené metastázy. Western blot analýza vykonaná na transplantovaných nádorov preukázala, že oba transgény boli vyjadrené pomocou bunkových línií in vivo
(dáta nie sú uvedené). Zdvojnásobenie časy nádorových buniek in vivo na východiskovú
nádoru zaťažením 10 6 buniek sa pohybovala medzi 7,2 (mGC8) a 13,8 dní (mGC3) (obr. 5A). In vitro
, všetky bunkové línie vykazovali podobné časy zdvojnásobenie asi 3 dni (obr. 5B). Ďalej v porovnaní podkožnej tvorbu nádorov bunkových línií v divokého typu (C57BL /6) a transgénnych myší. Žiadne významné rozdiely sa nepozorovali v nádorovom odberu a rastu nádoru pre bunkové línie 424GC, keď injekčne podkožne do divokého typu alebo CEA424 /Tag-transgénnych myší (Obr. 6A) a pre mGC11 CEA bunky po injekcii do divokého typu a CEA424 /Tag-CEA-transgénnych myší (obr. 6B). Obrázok 5 in vivo (A) a v charakteristikách vitro rastu (B) myšiach bunkových línií karcinómu žalúdka. každé tri myši boli injikované v uvedených dávkach nádorových buniek. Rast nádoru bol kvantifikovaný pomocou dvoch kolmých meraní priemeru nádoru a výpočet objemu, ako je popísané v časti Materiály a metódy. Pre stanovenie in vitro rastové charakteristiky boli bunky pestované v 24-jamkových doštičkách, počnúc číslami označených buniek. V rôznych časových bodoch boli bunky z troch jamiek zozbierané a spočítané. Výsledky sú uvedené ako priemer +/- štandardná odchýlka (SD). Najlepší fit krivky, ako aj časy delenia v dňoch (v zátvorkách) boli vypočítané s použitím software GraphPad.
Obrázok 6 Rast karcinómu žalúdka bunkových línií v divokého typu a transgénnych myší. 3 x 105 424GC bunky boli injikované subkutánne do myší C57BL /6 a CEA424 /Tag-transgénnych myší (A) alebo 3 x 105 mGC11CEA bunky boli injikované do myší C57BL /6 a CEA424 /deň x CEA-double transgénnych myší (B). Rast nádoru bol kvantifikovaný pomocou dvoch kolmých meraní priemeru nádoru a výpočet objemu, ako je popísané v časti Materiály a metódy. Výsledky sú uvedené ako priemer +/- SD (n = 3).
Imunogenita karcinómu žalúdka bunkové línie
obdobný rast nádorových bunkových línií v divokého typu a transgénnych myší indikuje, že žiadne významné imunitnú odpoveď na buď tumor antigén (Tag, CEA) sa vyskytla u myší nádorových ložísk. V skutočnosti, bez Tag-špecifické CTL by mohol byť identifikovaný v slezine myší nesúcich nádor divokého typu na základe postupného subkutánnej rast buniek karcinómu žalúdka Tag exprimujúcich (dáta nie sú uvedené). Avšak, keď dvojité transgénne bunkové línie rástli u myší, CEA-špecifické protilátky by mohli byť uvedené v C57BL /6 myší divokého typu, ale nie v CEA-transgénnych myší (Obr. 7A). Okrem toho, tri imunizácie myší C57BL /6 myší s 106 Mrázová rozmrazené nádorových buniek v týždňových intervaloch mGC8 buď zabraňuje rastu subkutánne živých mGC8 bunky úplne injekčne alebo tumor následok meškal skoro tri týždne v závislosti na dávke injekcií nádorových buniek (obr. 7B , C). Tieto pokusy ukazujú, že nádorové bunkové línie sú imunogénna za určitých podmienok. Avšak, C57BL /6 myší sa spontánne pripojiť účinné nádor progresie obmedzenie imunitnej reakcie na oboch nádorového antigénu pri subkutánnom rastu nádoru. Obrázok 7 imunogenecita MGC buniek. (A) anti-CEA protilátky boli stanovované v sére C57BL /6 a CEA-transgénnych myší s použitím prietokovej cytometrie. Všetky myši sa postupne rastúce nádory bez zjavnej nekrózy po transplantácii a rast uvedených bunkových línií pre 35-40 dní. mGC4CEA boli bunky inkubované s sére uvedených myší v rôznych riedeniach a viazaných primárne protilátky boli detekované pomocou anti-myšou protilátkou konjugovanou s PE. (B, C) tri C57BL /6 myšiach boli injikované subkutánne trikrát v týždenných intervaloch s 1 x 106 mGC8 usmrtených buniek pomocou dvoch cyklov zmrazenie-rozmrazenie. Dva týždne po poslednej vakcinácii boli myši napádaný injekciou 1 x 106 (B) a 3 x 106 (C), živé bunky mGC8, respektíve (vyplnené kruhy). Ako kontrola, nádorové bunky boli injikované v neimunizovaných myší (prázdne krúžky). Nádorové objemy boli vypočítané, ako je popísané v hmotnej a metódy úseku. Výsledky sú uvedené ako priemerné hodnoty +/- SD.
Diskusia
Hlavným cieľom tejto štúdie bolo stanoviť terapeutický model rakovinou žalúdka u imunokompetentných myší, ktoré by poskytovalo zvierací model pre vyhodnotenie protinádorovej imunity a imunoterapeutické stratégie.

• Primárna žalúdočné non-Hodgkinov lymfóm v čínskych pacientov: klinickými charakteristikami a prognostický factors
• GASTRICHIP: resekcia D2 a hyperthermic intraperitoneálnej chemoterapie u lokálne pokročilého karcinómu žalúdka: randomizovaná a multicentrická štúdia fázy III study