Karakterizacija želučani staničnih linija adenokarcinoma utvrđenih CEA424 /SV40 T antigen miševa transgenih sa ili bez ljudske CEAtransgene

Karakterizacija želučanih staničnih linija adenokarcinoma utvrđenih CEA424 /SV40 T antigen pregled -transgenic miševi sa ili bez ljudskog CEA pregled transgena koji pregled apstraktne pregled pozadine
karcinom želuca je jedan od najčešćih oblika raka u svijetu , Pacijenti s rakom želuca u poodmakloj fazi bolesti imaju lošu prognozu, s obzirom na ograničenu učinkovitost dostupnih terapija. Dakle, razvoj novih terapija, kao što je imunoterapija u liječenju karcinoma želuca je od najveće važnosti. Budući da je iskoristivost postojećih pretkliničkim modelima za procjenu imunoterapije za želučanog adenokarcinoma je ograničen, cilj ovog istraživanja bio je utvrditi mišja in vivo
modela koji omogućuju stupnjevitog poboljšanje imunoterapije za rak želuca.
Metode
Kako nema mišje želučani adenokarcinom stanične linije dostupne su uspostavili smo četiri stanične linije (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) iz spontano u razvoju tumora CEA424 /SV40 T antigen (CEA424 /oznaka) miševa i tri stanične linije izvedene iz double-transgcnski izbojima CEA424 /Tag miševa parili s ljudskim karcinoembrijski antigen (CEA) -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) miševi (mGC2 HUP, mGC4 HUP, mGC11 HUP). CEA424 /Tag je transgena C57BL /6 mišji soj koji nose oznaku pod kontrolom -424 /-8 bb CEA gena promotora što dovodi do razvoja invazivnog adenokarcinoma u žljezdanog želuca. Tumorskih staničnih linija uspostavljena od CEA424 /Tag-AZO miševa izražavaju dobro definiranu CEA tumorski antigen pod kontrolom svojih prirodnih regulacijskih elemenata pregled. Rezultati
epitelnog porijekla tumorskih stanica dokazuje morfološkim kriterijima, uključujući prisutnost mucina u stanicama i ekspresiju stanične adhezije molekula EpCAM i CEACAM1. Sve stanične linije dosljedno izražavaju transgene CEA i /ili oznaka i molekule MHC klase I dovodi do osjetljivosti na lize TAG-specifičan CTL in vitro pregled. Usprkos predstavljanju CTL-epitopa izvedenih iz transgena proizvodima stanične linije tumora bili tumore kada cijepljen u C57BL /6, CEA424 /Tag ili CEA424 /Tag-HUP-genetski promijenjene domaćini i nema značajne razlike u tumoru se i zabilježene su rast tumora u različite domaćini. Mada nije opažena odbijanju spontano tumora, cijepljenje C57BL /6 miševa pomoću lizatima iz želuca stanične linije karcinoma zaštićene C57BL /6 miševa od inokulacije tumora, koji pokazuju tumorogenosti od tumorskih stanica u transgenskih miševa u H-2 b haplotip. pregled Zaključak
Ove tumorske stanice usađena u različitim singeničnih domaćini trebali dokazati da bude vrlo korisno za optimizaciju imunoterapija režim kako bi se konačno testirati u transgenim životinjama u razvoju primarne želučanog karcinoma.
Pozadina pregled želuca rak drugi najčešći rak u svijetu [1]. Često se ne otkrije dok poodmakloj fazi; prema tome, stope preživljavanja 5-godišnje niska (10-20%). Zbog lokalne invazije i metastaza, radioterapije ili kemoterapije se ne povećava značajno duljine ili kvalitetu života bolesnika s uznapredovalim karcinomom želuca. Dakle, razvoj novih neoadjuvant i pomoćno sredstvo metoda liječenja su potrebne. Imunoterapija može biti obećavajući alternativna opcija. Broj imunoterapije pristupa kao adoptivnog transfera tumor-specifičnih T stanica, te vakcinaciji koja koristi bilo nedefinirane tumorskih antigena koji su izvedeni iz tumora lizata i tumorskih staničnih linija ili definiranih antigene tumora obično predlože dendritičke stanice su procijenjeni različitih karcinoma [2, 3] , Za želučanog karcinoma, imunoterapija nije uzeta ozbiljno u obzir s obzirom na koncept da je rak želuca slabo imunogeni. Prema tome, samo mali broj kliničkih ispitivanja imunoterapije su izvijestili [4-7]. Osim toga, samo ograničeni broj antigena povezanih s tumorom s potencijalnom upotrebom za imunoterapiju su identificirani [8-11]. Prema tome, sposobnost imunološkog sustava da prepozna i iskorjenjivanja želučanog raka je u velikoj mjeri nepoznanica. Da bi dobio uvid u djelotvornost raznih imunoterapije u liječenju raka želuca i da se razjasni temeljni mehanizam izazvanih imunološkog odgovora životinjski modeli želučanog adenokarcinoma su neophodna.
U tu svrhu, nekoliko skupina, uključujući naše nedavno osnovana transgeničnih ili kucati -out mišjih sojeva koji se razvijaju želučane adenoma ili adenokarcinome u raznim dijelovima želuca nakon različitim latencijama [12]. Razvili smo transgenične karcinom želuca C57BL /6 miša Model se temelji na SV40 veliki T antigen (SV40 Tag) transgen kontrolom promotora gena humanog karcinoembrionski antigen (CEA) (od -424 do -8 od početnog mjesta translacije) [13 ]. U 100% životinja, displastični kripte u sluznicu želuca promatra u pyloric regiji već u 30 dana star CEA424 /SV40 tag-transgenskih miševa. Displazija napreduje do invazivnih karcinoma i danju 50 cijeli pilorisa želučane sluznice zamijenjen je stanica karcinoma. U dobi od 90 do 110 dana, genetski promijenjenih miševa postali umrtvljeni i umiru vjerojatno pothranjenosti zbog blokade piloms [13]. Kontrola Tag ekspresiju minimalnom promotora CEA gena omogućuje tumora usmjerena izraz HUP križanjem CEA424 /SV40 Tag-transgenih miševa s ljudskim HUP
-transgenic C57BL /6 miševa koji eksprimiraju CEA transgena na sličan prostorno-vremenske ekspresije kao u ljudi [13, 14]. Ljudski tumorski biljeg CEA je izražena u mnogim humanim adenokarcinomima, uključujući više od 50% karcinoma želuca [15, 16]. CEA se sve više koristi kao ciljni antigen za razne protutijelo-i staničnim pristupa tumor imunoterapija [17-19]. CEA i oznake su pogodni imunoterapija ciljnih antigena jer broj T-staničnim epitopima tih antigena su identificirani u C57BL /6 miševa [20-22]. Iako su ti genetski promijenjene mišjih sojeva ogledalo vrlo blisko želučane razvoj adenokarcinom kod ljudi, eksperimentiranje s tim miševima je relativno dugotrajan i skup je zbog poteškoća utvrditi rast tumora i zahtjev za uzgoj transgeničnih miševa. Stoga, poželjno je imati singeneičnog transplantaciju sustav tumora želučanog adenokarcinoma kod imunokompetentnih miševa za optimizaciju danog imunoterapije protokol prije nego što se procjenjuje u transgenih miševa. Ovdje ćemo opisati mišja linija stanica želučanog adenokarcinoma uspostavljene od spontano u razvoju tumora SV40 Tag-transgena miševa koji su tumore u oba singenskih divljeg tipa i transgenskih miševa.
Metode pregled Miš soja i stanične linije pregled CEA424 /Tag- transgeni miševi (C57BL /6-Tg (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgeni miševi (C57BL /6-Tg (CEACAM5) 2682Wzm, CEA2682) i F1 miševa s križanca CEA424 /Tag-transgenih i CEA-transgeničnih miševa prethodno opisano [13, 14]. U međuvremenu su genetski promijenjene linije su povratno križaju na C57BL /6 miševa (H-2 b) više od 15 generacija. Genetski promijenjene linije, kao i C57BL /6 miševa (Charles River, Sulzfeld, Njemačka) uzgojeni su i držati pod standardnim uvjetima bez patogena u životinjskom objektu Instituta za Kirurška istraživanja, Ludwig-Maximilians-University u Münchenu. Pokusi na životinjama su izvedena nakon odobrenja od strane Odbora za lokalnu dobrobiti životinja. Za tumorogenosti i imunogenosti pokusa miševi su korišteni 8-12 tjedana starosti. Bubrega afričkog zelenog majmuna Cos7L stanična linija je dobivena od American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). BALB /c-izvedene fibrosarkom Meth-A ljubazno je ustupio W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg). Meth-A-CEA stanice dobivene su transfekcijom met-A stanica sa PRC /CMV-AZO ekspresije plazmida uporabom Fugene ™ 6 reagensa za transfekciju (Roche Molecular Biochemicals, Švicarska) u skladu s uputama proizvođača. Metil-A-cTag i RBL5 /T transfektanti su prethodno opisani [23]. Pregled Uspostavljanje želučanih stanične linije karcinoma
želučanog karcinoma koji se koriste za uspostavljanje tumorske stanične linije dobivene su od 8 različitih, površine od 13 tjedana starih miševa. Četiri izvedeni iz CEA424 /tag-transgena miševa i 4 iz CEA424 /Tag-HUP-double transgenskih miševa. Imena staničnih linija izvedenih od kasnije miševi su u znaku iznad teksta "AZO". Sve kulture su provedena u RPMI1640 uz dodatak 10% toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (FCS "zlata"; PAA Laboratories, Coelbe, Njemačka), 2 mM L-glutamina, 100 U /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina, sporedne amino kiselina i 1 mM natrijevog piruvata (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Njemačka), u daljnjem tekstu kao medij za tumor (TM). Tumorsko tkivo dobro ispere u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (PBS), uz dodatak 200 ug /ml gentamicina i 2.5 ug /ml amfotericina B (GIBCO /Invitrogen), izreže u 1 mm 3 komada sa skalpelom, te nasađene u kulturi tkiva tikvice sadrže TM. Medij za kulturu mijenja svakih 3-4 dana. Epitelne stanice i fibroblasti raste iz fragmenata tkiva su bili razdvojeni stanica struganje, selektivna tipizacije i selektivno pasaža s 1000 U /ml kolagenazom i 500 U /ml hijalourinidazom (Biochrom, Berlin, Njemačka). Tijekom disocijacije, boce su praćene u obrnutom mikroskopom i probava je zaustavljen Kada bi fibroblasti, ali ne i epitelne stanice su odvojene (tripsin) ili obrnuto (kolagenaza /antibiotik). Ovaj postupak se ponavlja sve dok svi tjedni fibroblasti su uklonjene iz staničnih kultura. Za generiranje stanične linije 424GC, fibroblasta kultura je uspostavljen od kontaminiranih fibroblasta (424 fibroblasti). Sferoidi formirana u roku od 5-7 dana nakon sadnje 0,5 x 10 3 mGC8 stanica u Noble agaru (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Njemačka) obložene s 96 jažica (TE-Biochrom, Berlin, Njemačka) u 200 ul TM koji je zamijenjen sa svježim medijem svaka dva dana. Procijeniti vijabilnosti stanica na površini sferoida, kuglice su inkubirane s FITC-obilježenim Annexin V (Annexin V FITC Apoptoza Detection Kit, Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Njemačka) za detekciju apoptičkih stanica ili s propidij jodidom kako bi se identificirali nekrotično stanice u skladu sa preporukama proizvođača.
protočnom citometrijom analize
za površinski obojanih stanica su tripsinizirane, isprane s PBS-om i suspendirane u PBS /0,5% w /v goveđeg serumskog albumina (BSA) uz dodatak 0.02% w /v natrijeva azid. Za indukciju MHC molekula, stanice se inkubira s 20 ng /mL interferona-gama (IFNy, Peprotec, London, UK) za 24 sata prije sakupljanja. Nespecifično vezanje antitijela na Fc receptore bio blokiran preinkubacije stanica sa 1 ug /10 6 stanice anti-CD16 /CD32 monoklonsko antitijelo (mAb) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Njemačka) tijekom 15 min , Nakon toga su stanice inkubirane s 0,5 ug /10 6 stanice mAb interesa za 30 min na 4 ° C, isprani dva puta, i ako je potrebno, zatim reagira s drugom koraku antitijela za 15 min na 4 ° C , Stanice su dvaput isprane i analizirane pomoću FACScan (bd, Mountain View, CA). Mrtve stanice su isključeni propidij jodida bojanjem. Korišteni su sljedeći reagensi i mAbs protiv mišjih antigena iz BD Pharmingen: fikoeritrin (PE), koje je konjugirano mišji IgG 2a protiv IA b, biotinilirano mišje IgG 2a anti-H-2d b PE-konjugiranim mišjim IgG 2aanti-H-2K b, PE-konjugiranog anti-mišjim CD80 /B7-1, PE-konjugiranom štakorskog IgG 2a anti-mišji CD40, PE-konjugiranom štakorskog IgG 2a anti-miš CD86 /B7-2, fluorescein izotiocijanat (FITC) konjugirano, armenski hrčak IgG 2 anti-miš CD80 /B7-1. FITC-konjugirani štakor IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugirani štakor IgG 1 mAb R3-34, PE-konjugirani mišji IgG 2a anti-štakor SIRP, FITC-konjugirani armenski hrčak IgG 2anti-KLH i PE-konjugirani štakor IgG 2amAb služio kao kontrola izotipova. Miš anti-mišji CEACAM1 mAb CC1, štakora anti-mišja CEACAM1 AgB10 [24] i štakora anti-mišja E-kadherina i anti-miš EpCAM uzorci su ljubazni dar K. Holmes Sveučilištu Colorado, BB Singer, Charite Berlin, i P. Ruf, Trion istraživanja, München, respektivno. Unakrsno reaktivno mišji antihumani CEACAM mAb 4/3/17 (specifična za humani CEA /CEACAM5 u miša) su nabavljeni od Genovac (Freiburg, Njemačka). Mišja antitijela su otkrivena sa PE-konjugiranim kozjim anti-mišjim IgG, protutijela štakora FITC-konjugirani magareći anti-štakor IgG pregled (Dako). Određivanje KD i SV40 oznaka metodom Western blot
Eksponencijalno rastuće stanice karcinoma želuca , Cos7L stanice Cos7L-CEA transfektanti, Meth-a stanice i Meth-a-cTag transfektanti koje eksprimiraju skraćene citoplazmatski nalazi SV40 oznake su sakupljene tripsinizacijom. Stanice su isprane tri puta u PBS-u, te lizira u gustoći od 10 6 stanica /ml pufera za lizu. Koncentracija proteina je određena pomoću BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, Illinois, SAD). Stanični ekstrakti odgovara 10 ug proteina razdvoji elektroforezom preko 10% SDS-poliakrilamidnim gelovima (Invitrogen, Karlsruhe, Njemačka), prenosi na polyvinyliden fluorid membrane i inkubirane s 10 ug /ml anti-humanog CEACAM mAb 4/3/17 ili njegove 1: 100 razrijeđenog hrčak anti-SV40 Tag antiserum (poklon od K.-H. Scheidtmann Sveučilišta u Bonnu). Vezana protutijela reagira s hren peroksidaza-obilježeni sekundarnih antitijela i vizualizirati primjenom hemiluminiscenciju bazi sustava za detekciju. (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Njemačka) pregled stanica određivanje vremena udvostručavanja pregled In vitro
Vrijeme udvostručenja staničnih linija određena nanošenjem stanica karcinoma želuca u 24 jažica u TM na naznačenim polaznih broja stanica i brojanjem uzoraka stanica iz trostrukih komorica nakon nježnog tripsinizacijom svaka 3 dana 21 dana. In vivo pregled udvostručena vremena izračunate su iz mjerenja volumena tumora (vidi dolje) nakon inokulacije sa tri različite brojeve početna stanica (tri miša po skupini). Vrijeme udvostručenja izračunate su iz faze log krivulja rasta. Pregled tumorogenosti i imunogenost staničnih linija pregled za tumorske stanice procjenu tumorogenosti su isprane tri puta u PBS-u i 50 ul suspenzije stanica s naznačenim brojem stanica su injicirani supkutano u desni bok obrijanom miševa. Za utvrđivanje imunogenosti 10 7 tumorskih stanica /ml su lizirane u dva uzastopna zamrznuti i otapanja. Imunizirani su četiri puta u tjednim intervalima sa 10 6 lizirane stanice tumora u desni bok. Tri tjedna kasnije, miševi su izazvani supkutanom injekcijom 3 × 10 6 viabilnih stanica tumora u lijevom boku. Eksperimentalne skupine su se sastojale od 4-6 miševa. razvoj tumora je zatim serijski mjerenjem veličine tumora, a volumen tumora izračunat je prema formuli: Volumen tumora (mm 3) = d 2 × D /2, gdje D i D su najkraći i najveći promjer tumora, respektivno. Životinje su eutanazirane kad je tumor dosegao volumen 300 mm 3, pregled Stvaranje Tag specifičnih citotoksičnih T-limfocita (CTL) i stimulaciju karcinom želuca staničnih linija
CTL dobiveni su kao što je prethodno opisano [23] , Ukratko, miševi su inokulirani s 1 intradermalno um čestice zlata obložene s oznake ekspresijskog plazmida (BMG /CT-Ag.1 [23]) u obrijanu abdominalne kože pomoću pritiska helij (200 psi) napaja biolistnom Uređaj (Helios genskog pištolja; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Njemačka). Stanice slezene dobivene od 14 dana nakon cijepljenja su ponovno stimulirane tjedno sa ozračene RBL5 /T transfektanti u RPMI-1640/10% FCS dopunjen s 30 IU /ml IL-2. RBL5 /T je Rauscher virus transformira T-limfoma stanične linije izvedene iz C57BL6 (H-2b), miša transficirane sa SV40 Tag plazmida ekspresije. Za generiranje epitopa specifičnih CTL, stanice slezene uzima 10 dana nakon cijepljenja su ponovno stimulirane in vitro ozračivanja Tag peptidnih pulsirajuće RBL5 stanica. T1, T2 /3 i T4 specifičnost epitopa CTL kontrolirano je određivanjem sadržaja IFNy medija nakon stimulacije s peptidne pulsirajuće ciljnih stanica pomoću ELISA. Pregled citokina detekcija pomoću ELISA
Za izdvajanje i detekciju IFNy u supernatantima konvencionalnim sendvič ELISA, koristili smo mAb R4-6A2 biotinilirani mab XMG1.2, odnosno (BD Pharmingen). Ekstinkcija je analizirana na 405/490 nm na TECAN mikroploče ELISA čitaču (TECAN crailsheim, Njemačka) s EasyWin softvera (Tecan). Granica detekcije ELISA za IFNy bila je 20 pg /ml.

• Primarni želuca ne-Hodgkinov limfom u kineskim bolesnika: klinički karakteristikama i prognostički factors
• GASTRICHIP: D2 resekcija i Hipertermija u trbušnu šupljinu kemoterapije u lokalno uznapredovalim želučanog karcinoma: randomizirano i multicentrično ispitivanje faze III study