Characterization vun gastric Zeilen aus CEA424 /SV40 T antigen-transgenic Mais etabléierten Zell adenocarcinoma mat oder ouni e Mënsch CEAtransgene

Characterization vun gastric Zeilen aus CEA424 /SV40 T antigen etabléierten Zell adenocarcinoma VerfÜgung -transgenic Mais mat oder ouni e Mënsch CEA VerfÜgung transgene VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric carcinoma eent vun den heefegsten Cancers ass weltwäit . Patienten mat gastric Kriibs bei Diplôme Krankheet Etapp hunn eng schlecht hätt, wéinst der limitéierter Efficacitéit vun sinn Therapien. Also, ass d'Entwécklung vun neie Therapien, wéi immunotherapy fir d'Behandlung vun gastric Kriibs vun ënnerhuele Wichtegkeet. Zënter der Benotzerfrëndlechkeet vun bestehend preclinical Modeller fir d'Evaluatioun vun immunotherapies fir gastric adenocarcinomas limitéiert ass, war d'Zil vun der presentéieren Etude murine zu VIVO VerfÜgung Modeller ze wëssen, a wat déi stepwise Verbesserung vun immunotherapies fir gastric Kriibs erlaben. VerfÜgung Method
Well keen murine gastric adenocarcinoma Zell Leitungen sinn mir véier Zell Linnen etabléiert (424GC, mGC3, mGC5, mGC8) aus spontan entwéckelen erhéijen vun CEA424 /SV40 T antigen (CEA424 /Tag) Mais an dräi Zell Linnen ofgeleet vun double-transgenic offsprings vun CEA424 /Tag Mais mat mënschlechen carcinoembryonic antigen (CEA) mated -transgenic (CEA424 /Tag-CEA) Mais (mGC2 CEA, mGC4 CEA, mGC11 CEA). CEA424 /Tag ass eng transgenic C57BL /6 Maus Deformatioun vum Tag ënnert der Kontroll vun engem Promoteur -424 /-8 BP CEA Gentherapie, ausser déi an der glandular Mo. zu der Entwécklung vun invasiv adenocarcinoma féiert. Entholl Zell Linnen etabléierten aus CEA424 /Tag-CEA Mais ausdrécklech de gutt definéiert entholl antigen CEA ënnert der Kontroll vu sengem natierlechen reglementaresche Elementer. VerfÜgung Resultater VerfÜgung D'epithelial Urspronk vun der entholl Zellen war vun morphological Critèren bewisen, dorënner d'Präsenz vun mucin bannent den Zellen an den Ausdrock vun der Zell Haftung Molekülle EpCAM an CEACAM1. All Zell Linnen auszedrécken konsequent der transgenes CEA an /oder Tag a MHC Klass ech Molekülle fir hir waat fir lysis vun Tag-spezifesch CTL Virwaat kënschtlech VerfÜgung. Trotz der Presentatioun vun CTL-epitopes aus der transgene ofgeleet Produiten der entholl Zell Linnen tumorigenic sech wann an C57BL näischt Bäigeprafftes /6, CEA424 /Tag oder CEA424 /Tag-CEA-transgenic Lëntgen a keng Differenze zu entholl huelen an entholl Wuesstem goufen observéiert an déi verschidden Lëntgen. Obwuel keng spontan entholl Ofleenung huet observéiert, Impfpass vun C57BL /6 Mais mat lysates aus gastric carcinoma Zell Linnen geschützt C57BL /6 Mais aus entholl Erausfuerderung, déi tumorigenicity vun der entholl Zell Linnen an nontransgenic Mais vun den H-2 b Musiktherapie- haplotype. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Dës entholl Zell Linnen an verschidden syngeneic dorophin näischt Bäigeprafftes solle beweisen, ganz nëtzlech gin immunotherapy regimens optimiséieren endlech zu transgenic Déieren entwéckelen Primärschoul gastric carcinomas getest gin. VerfÜgung Background VerfÜgung gastric Kriibs ass déi zweet Équipe gemeinsam Kriibs weltwäit [1]. Et ass oft net bis en fortschrëttlechen Etapp fonnt; doduercher, sinn de 5-Joer Iwwerliewe Tariffer niddereg (10 zu 20%). Wéint lokal Invasioun an Metastasen, Bestrahlungen Chimiotherapie Erhéijung net vill der Längt oder Liewensqualitéit vun de Patiente mat fortgeschratt gastric Kriibs. Dofir, si Entwécklung vun neie neoadjuvant an adjuvant Behandlung Aberuffung waren. Immunotherapy kéint eng villverspriechend alternativ Optioun ginn. Eng Zuel vun immunotherapy Approche wéi maach Transfert vun entholl-spezifesch T Zellen, an Impfpass entweder ondefinéiert entholl antigens aus entholl lysates an entholl Zell Linnen oder definéiert entholl antigens vun dendritic Zellen Toast ginn ofgeleet benotzt gi fir verschidde Cancers bewäert [2, 3] . Fir gastric Cancers, war immunotherapy net eescht an allem wéinst dem Konzept dass gastric Kriibs ass schlecht immunogenic geholl. Dofir, nëmmen eng kleng Zuel vu Krankheete immunotherapy Prozesser gemellt ginn [4-7]. Zousätzlech, hunn nëmmen eng limitéiert Zuel vun entholl-verbonne antigens mat Potential benotzen fir immunotherapy identifizéiert ginn [8-11]. Doduercher d'Méiglechen stoussen vun der immun System ze erkennen an gastric Cancers z'encouragéieren ass haaptsächlech bekannt. Fir Abléck an d'Efficacitéit vun verschiddenen immunotherapies fir d'Behandlung vun gastric Kriibs Mosconi an der Basisdaten Mechanismus vun entschlof immun Äntwerte Déier Modeller vun gastric adenocarcinoma, fir onverzichtbar sinn. VerfÜgung zu dësem Schluss, hunn verschidden Gruppen dorënner mäin kuerzem etabléierten transgenic oder hummeren -OUT Maus analyséieren déi gastric adenomas oder adenocarcinomas zu verschiddenen Deeler vun der Mo no verschiddene latencies [12] entwéckelen. Mir hunn e transgenic gastric carcinoma C57BL /6 Maus Modell vun engem Mënsch carcinoembryonic antigen (CEA) Gentherapie Promoteur (aus -424 zu -8 vun der respektiv Ufank Site) [13 kontrolléiert baséiert op engem SV40 grouss T antigen (SV40 Tag) transgene entwéckelt ]. Zu 100% vun den Déieren, dysplastic Krypta Équipe am Mo. mucosa ass am pyloric Regioun schonn am 30. Dag al CEA424 /SV40 Tag-transgenic Mais observéiert. Dysplasia Verlaf zu invasiv carcinomas a vum Dag 50 ganzt pyloric gastric mucosa huet vun carcinoma Zellen ersat ginn. Tëscht der Alter vun 90 bis 110 Deeg ginn d'transgenic Mais Kreativitéit a stierwen wahrscheinlech vun undernourishment wéinst Baustau vun der pylorus [13]. Der Kontroll vun Tag Ausdrock vun engem Minimum Gentherapie Promoteur CEA erlaabt der entholl-Direkter Ausdrock vun CEA vun CEA424 /SV40 Tag-transgenic Mais mat mënschlechen CEA Kräizung VerfÜgung -transgenic C57BL /6 Mais, deen der CEA transgene zu engem ähnlechen auszedrécken spatiotemporal Ausdrock Muster wéi am Mënschen [13, 14] fonnt. De Mënsch entholl Bewaacher CEA ass an vill mënschlech adenocarcinomas dorënner méi wéi 50% vun gastric carcinomas [15, 16] ausgedréckt. CEA ass ëmmer méi als Zil antigen fir eng Varietéit vun antibody- an Zell-mediated entholl immunotherapy Approche benotzt [17-19]. CEA an Tag Photonen immunotherapy Zil- antigens zënter enger Rei vu T Zell epitopes vun dësen antigens hunn zu C57BL /6 Mais [20-22] identifizéiert ginn. Obwuel dës transgenic Maus analyséieren an Mënsche ganz enk gastric adenocarcinoma Entwécklung Spigel, trotzdeem mat deene Mais ass relativ vill Zäit an deier wéinst de Schwieregkeeten ze entholl Wuesstem an d'Noutwendegkeete vun der Südhallefkugel transgenic Mais bestëmmen. Dofir ass et wënschenswäert, e syngeneic transplantable entholl System vun gastric adenocarcinomas zu immunocompetent Mais fir Akeef vun enger bestëmmter immunotherapy Protokoll ze hunn, ier et zu der transgenic Mais bewäert gëtt. Hei schwätze mer gastric adenocarcinoma Zell Linnen murine etabléierten aus spontan entwéckelen erhéijen vun SV40 Tag-transgenic Mais dass zu souwuel syngeneic Typ wëll tumorigenic sinn an transgenic Mais. VerfÜgung Method VerfÜgung Mouse analyséieren an Zell Linnen VerfÜgung CEA424 /Tag- transgenic Mais (C57BL /6-TG (CEACAM5-Tag) L5496Wzm), CEA-transgenic Mais (C57BL /6-TG (CEACAM5) 2682Wzm; CEA2682) an F1 Mais vun engem Kräiz tëscht CEA424 /Tag-transgenic an CEA-transgenic Mais virdru beschriwwen hunn [13, 14]. Mëttlerweil der transgenic Linnen goufen zu C57BL /6 Mais (H-2 b) fir méi wéi 15 Generatiounen backcrossed. D'transgenic Linnen souwéi C57BL /6 Mais (Charles River, Sulzfeld, Däitschland) waren flegelhaft an huet ënner normale pathogen-gratis Konditiounen an d'Déier Gebei vum Institut fir Surgical Fuerschung, Ludwig-Maximilians-Universitéit vu München. D'Déier Experiment nom Akraafttriede vun der lokal Déiereschutz Comité gesuergt. Fir tumorigenicity an immunogenicity assays Mais sech op 8-12 Wochen vun Alter benotzt. Afrikanesch gréng Af Nier Cos7L Zell Linn war vun der American Ray Kultur Collection (ATCC, Rockville, MD) kritt. D'BALB /c-ofgeleet fibrosarcoma gesot-A war Audit vun W. Deppert (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg) gëtt. Gesot-A-CEA Zellen sech duerch transfection vun gesot-A Zellen mat der pRc /CMV-CEA Ausdrock plasmids benotzt FuGENE ™ 6 transfection reagent (Roche cuisine Biochemicals, Schwäiz) kritt laut den Uweisunge vum Produzent. Gesot-A-cTag an RBL5 /T transfectants sech beschriwwe virdrun [23]. VerfÜgung Grënnung vun gastric carcinoma Zell Linnen VerfÜgung D'gastric carcinomas benotzt entholl Zell Zeilen ze etabléieren aus 8 verschiddene, 13. Woch ale Mais kritt huet. Véier ofgeleet vun CEA424 /Tag-transgenic Mais a 4 vun CEA424 /Tag-CEA-double transgenic Mais. D'Nimm vun der Zell Linnen vum Fonds Mais ofgeleet sinn déi superscript "CEA" markéiert. (; PAA Laboratoiren, Coelbe, Däitschland FCS "Gold"), 2 mm L-glutamine, 100 U /ml penicillin, 100 μg /ml streptomycin, Net-essentiel All Kulturen sech zu RPMI1640 mat 10% Hëtzt inactivated An et Kallef serum nà gesuergt Héicht Saieren an 1 mm Natrium pyruvate (GIBCO /Invitrogen, Karlsruhe, Däitschland), bezeechent weider un den entholl mëttelfristeg (TM). Entholl Stoffer sech an phosphate-gefiermt Salins (PBS) ergänzt mat 200 μg /ml gentamicin an 2,5 μg /ml amphotericin B (GIBCO /Invitrogen), Géigewier an 1 mm 3 Stécker mat engem scalpel an plated an Otemschwieregkeeten Kultur extensiv Katakombe Kréi mat TM. D'Kultur mëttel- huet all 3-4 Deeg geännert. Epithelial Zellen a Här iwert mech selwer aus der Otemschwieregkeeten Fragmenter wuessen sech duerch Zell Dat well, selektiv trypsinization a selektiv passaging mat 1.000 U /ml collagenase an 500 U /ml hyaluronidase (Biochrom, Berlin, Däitschland) getrennt. Während dissociation, goufen d'Kréi ënnert en Inverted microscope iwwerwaacht a unzereegen war den Här iwert mech selwer gestoppt awer net epithelial Zellen sech ugebauten (trypsin) oder vice versa (collagenase /hyaluronidase). Dës Prozedur war Wochenzeitung widderholl bis all Här iwert mech selwer aus der entholl Zell Kulturen éliminéiert goufen. Während Generatioun vun der 424GC Zell Linn, war e fibroblast Kultur aus contaminating Här iwert mech selwer etabléiert (424 Här iwert mech selwer). Spheroids bannent 5-7 Deeg aleng no Morden 0,5 × 10 3 mGC8 Zellen an Noble Agar (Fläch-Aldrich, Taufkirchen, Däitschland) -coated 96-gutt Placke (TPP-Biochrom, Berlin, Däitschland) an 200 μl TM déi all zwee Deeg war mat frëschen mëttelfristeg ersat. (; Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Däitschland Annexin V FITC Apoptosis Detektioun Kit) fir ze erkennen apoptotic Zellen oder mat propidium Kaliumiodid zu necrotic identifizéieren ze Nuetsvolen vun Zellen op der Uewerfläch vun der spheroids bewäerten, goufen spheroids mat FITC-Label annexin V incubated Zellen no de Recommandatioune vum Produzent. VerfÜgung Analysë Flow cytometry VerfÜgung fir Uewerfläch staining Zellen trypsinized waren, mat PBS gewäsch a Spär vun PBS /0,5% w /v Bovine serum albumin (BSA) mat 0,02% w /v Natrium nà azide. (; Peprotec, London, UK IFNγ) fir 24 Stonnen virun Wäilies fir Aféierungs- vun MHC Molekülle, goufen Zellen mat 20 Dummeldéng /ml vun interferon-γ incubated. Non-spezifesch bindend vun antibodies zu Fc kenne sech mat 1 vun preincubation vun den Zellen blockéiert μg /10 6 Zellen vun Anti-CD16 /CD32 monoclonal antibody (MAB-) 2.4G2 (BD Pharmingen, Heidelberg, Däitschland) fir 15 min . Duerno goufen d'Zellen mat 0,5 incubated μg /10 6 Zellen vun der MAB- vun Interessi fir 30 min bei 4 ° C, zweemol zou, a wou ubruecht, dono reagéiert mat enger zweeter-Schrëtt antibody fir 15 min bei 4 ° C . Zellen sech zweemol zou an analyséiert engem FACScan (BD, Mountain View, CA) benotzt. Verstuerwen Zellen sech duerch propidium Kaliumiodid staining ausgeschloss. Déi folgend reagents an mAbs géint murine antigens aus BD Pharmingen benotzt goufen: phycoerythrin (PE) -conjugated Maus IgG 2a anti-IA b, b biotinylated Maus IgG 2a anti-H-2D , PE-conjugated Maus IgG 2aanti-H-2K b, PE-conjugated anti-Maus CD80 /B7-1, PE-conjugated Grenzwäerter IgG 2a anti-Maus CD40, PE-conjugated Grenzwäerter IgG 2a anti-Maus CD86 /B7-2, fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated, Armenian Hamster IgG 2 Anti-Maus CD80 /B7-1. FITC-conjugated Grenzwäerter IgG 1 MAB- R3-34, PE-conjugated Grenzwäerter IgG 1 MAB- R3-34, PE-conjugated Maus IgG 2a anti-Grenzwäerter SIRP, FITC-conjugated Armenian Hamster IgG 2anti-KLH an PE-conjugated Grenzwäerter IgG 2amAb als isotype Kontrollen. Mouse anti-Maus CEACAM1 MAB- CC1, Grenzwäerter anti-Maus CEACAM1 AgB10 [24] an Grenzwäerter anti-Maus E-cadherin an Anti-Maus EpCAM mAbs sech eng Zort Cadeau vum K. Holmes, Universitéit vu Colorado, BB Singer, Charité Berlin, an P. Ruf, Trion Fuerschung, München, bzw.. Kräiz-reaktiv Maus anti-Mënsch CEACAM MAB- 4/3/17 (speziell fir Mënscherechter CEA /CEACAM5 an der Maus) sech aus GENOVAC (Freiburg, Däitschland) kaaft. Murine antibodies sech mat PE-conjugated Geess anti-Maus IgG, Grenzwäerter antibodies mat FITC-conjugated Esel anti-Grenzwäerter-IgG (DAKO) fonnt. VerfÜgung Detektioun vun CEA an SV40 Tag vun Western blotting VerfÜgung Exponentially wuessen gastric carcinoma Zellen , Cos7L Zellen, Cos7L-CEA transfectants, gesot-a Zellen a gesot-a-cTag transfectants déi eng gekierzt cytoplasmically wellkomm SV40 Tag sech duerch trypsinization auszedrécken recoltéiert. Zellen sech dräi Mol am PBS gewäsch an op eng Dicht vu 10 6 Zellen /ml zu lysis gefiermt lysed. Protein Konzentratioun war mat der BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA) sech. Zell dovu bis 10 μg vun FAQ entspriechend sech duerch electrophoresis iwwer 10% SDS polyacrylamide gels (Invitrogen, Karlsruhe, Däitschland) getrennt, fluoride Schläimhait zu polyvinyliden transferéiert an incubated mat 10 μg /ml anti-Mënsch CEACAM MAB- 4/3/17 oder engem 1: 100 verdënntem Hamster anti-SV40 Tag antiserum (eng Zort Cadeau vun K.-H. Scheidtmann, Universitéit vu Bonn). Bound antibodies sech mat Päerd-banne peroxidase-Label Secondaire antibodies reagéiert an visualized engem chemiluminescence-baséiert erkennen System benotzt. (ECL; Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Däitschland) VerfÜgung Zell Verdueblung Zäit Determinatioun VerfÜgung An kënschtlech VerfÜgung all 3 Deeg fir 21 Deeg Verdueblung Zäite vun der Zell Linnen goufen duerch di d'gastric carcinoma Zellen am 24-och Telleren an TM um uginn ab Zell Zuelen an Zielen vun der Zell Echantillon vun triplicate Wells der sanft trypsinization alles. D'zu VIVO VerfÜgung Verdueblung mol goufen aus entholl Volumen Miessunge berechent (kuckt hei ënnendrënner) no inoculation mat dräi verschidden ab Zell Zuelen (dräi Mais pro Grupp). Verdueblung mol goufen aus dem Logbuch Phase vun der Wuesstem Kéiren berechent. VerfÜgung Tumorigenicity an immunogenicity vun der Zell Linnen VerfÜgung Fir tumorigenicity Foussgänger entholl Zellen sech dräi Mol am PBS gewäsch a 50 μl vun Zell suspensions mat der uginn Zell Zuelen goufen heijen subcutaneously an de Moment erliewen riets Ofwiersäit vun de Mais. Ze bestëmmen, goufen d'immunogenicity, 10 7 entholl Zellen /ml vun zwou Nuechten KHTML an Thaw Zykle lysed. Mais huet véiermol um Wochemaart Intervalle mat 10 6 lysed entholl Zellen an der rietser Säit immunized. Dräi Woche méi spéit, huet de Mais vun subcutaneous Sprëtz vun 3 × 10 6 liewensfäeg entholl Zellen an der rietser Ofwiersäit erausgefuerdert. Experimentell Gruppen bestoung vun 4-6 Mais. Entholl Entwécklung war duerno vun Serien Miessunge vun der entholl Gréisst an der entholl Volumen berechent gouf no der Equatioun: entholl Volumen (mm 3) = d 2 × D /2, wou d an D sech dem Korrespondent an de längste entholl Duerchmiesser, bzw.. Déieren euthanized sech wann d'erhéijen e Volume vun 300 mm erreecht 3. VerfÜgung Generation vun Tag-spezifesch cytotoxic T lymphocytes (CTL) an Stimulatioun vun gastric carcinoma Zell Linnen VerfÜgung CTLs sech entsteet wéi virdru beschriwwen [23] . Kuerz, Mais sech mat 1 μm Gold Deelchen mat engem Tag Ausdrock plasmid (BMG /CT-Ag.1 [23]) an de Moment erliewen postwendend misse Haut mat engem heliumräiche Drock (200 ass keng Gefor) ugedriwwen biolistic Apparat (Blobierg Gentherapie Pistoul Beschichtete intradermally inoculated; Bio-Rad Laboratoiren GmbH, München, Däitschland). Mëlz Zellen kritt 14 Deeg Post Impfpass sech um Wochemaart Intervalle mat irradiated RBL5 /T transfectants zu RPMI-1640/10% FCS ergänzt mat 30 IU /ml IL-2 restimulated. RBL5 /T ass eng RAUSCHER Virus-transforméiert T-lymphoma Zell Linn déi sech vun enger C57BL6 (H-2b) Maus mat engem SV40 Tag Ausdrock plasmid transfected. Fir epitope-spezifesch CTL, Mëlz Zellen geholl 10 Deeg Post Impfpass produzéiert goufen kënschtlech mat irradiated, Tag peptide-pulsed RBL5 Zellen restimulated. D'T1, T2 /3 an T4 epitope Spezifizitéit vun der CTL vun Determinatioun vun der IFNγ Inhalt vun Medien op Stimulatioun mat peptide-pulsed Zil- Zellen kontrolléiert gouf benotzt Elisa. VerfÜgung Cytokine Detectioun vum Elisa VerfÜgung Fir knipsen an ze erkennen IFNγ zu supernatants duerch konventionell Sandwich Elisa, déi mir MAB- R4-6A2 an biotinylated MAB- XMG1.2, bzw. (BD Pharmingen). Verschwannen war um 405/490 nm op engem s microplate Elisa Lieser (s Crailsheim, Däitschland) mat der EasyWin Software (s) analyséieren. Der Detektioun Limite vun der Elisa fir IFNγ war 20 PG /ml. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Grënnung an phenotype vun der gastric carcinoma Zell Linnen VerfÜgung Vun 8 gastric carcinoma Echantillon 7 Zell Linnen gegrënnt ginn hätt. Véier Zell Strecken ofgeleet vun CEA424 /Tag-transgenic Mais (424GC, aus engem männleche Maus; mGC3, weiblech; mGC5, männlech; an mGC8, weiblech) an dräi Zeilen aus CEA424 /Tag-CEA-transgenic Mais (mGC2 CEA, männlech; mGC4 CEA, männlech; mGC11 CEA, weiblech). Déi Zäit waren reng epithelial Zell Kulturen daitlech (mengen 6 Méint, Gamme 3-16 Méint) variéiert ze kréien. Obwuel d'entholl Zellen als Operstéiungszeen Zellen zu Kultur wuessen, éischter si Bodrum zu Form anstatt iwwer d'Kultur Realitéiten geréckelt (Figebam. 1A). D'epithelial Urspronk vun der entholl Zellen war vun morphological Critèren bewisen, dorënner d'Präsenz vun mucin am Zellen (Figebam. 1A) an den Ausdrock Analyse vun FAQ Toast an epithelial Zellen ausgedréckt (EpCAM, E-cadherin, CEACAM1) (Figebam. 2A) . Eng reduzéiert Inhalt vun mucin war an all Zell Linnen am Verglach mat den Inhalt vun normal gastric epithelial Zellen mee gläicht, datt zu entholl Zellen am gastric carcinoma zu transgenic Mais (Figebam. 1A an [13]) fonnt hunn. All Zell Linnen CEACAM1 an EpCAM op hir Uewerfläch ausser mGC11 CEA ugewisen, keent vun hinnen ausgedréckt E-cadherin (Figebam. 2A an Daten net gewisen). All Zell Linnen ausgedréckt MHC Klass ech H-2K an, an op eng vill méi déif Niveau, H-2D Molekülle (Figebam. 2B). Ausdrock vun zwou Proteinen war staark duerch IFNγ Stimulatioun gestäerkt. Keen Ausdrock vun MHC Klass II Molekülle (ech-Ab) ass fonnt (Figebam. 2B an Daten net gewisen). CD54, CD80, CD86 oder CD95 sech op all Zell Linn net fonnt (Donnéeën net gewisen). Figur 1 grousse Ganzen vun gastric carcinoma Zell Zeilen als monolayer Kulturen oder wéi dräi Dimensiounen spheroids ugebaut. (A) D'Zell Linnen weisen e bëssen anescht epithelial Wirklechkeet. Déi meescht Zellen vun all Zell Linnen enthält eng charakteristesch intracellular vacuole (Feiler) déi wahrscheinlech mucinous Material Kierchefënster rout vum Departement Pas Method (lescht Bild riets am ënneschten Rot) enthält. (B) Spheroid entstanen duerch mGC8 entholl Zellen op mëll Agar culturing: lénks, Phase Kontrast; Recht, fluorescence staining vun necrotic Zellen mat propidium Kaliumiodid (rout) an apoptotic Zellen mat FITC-Label annexinV (gréng, vun arrowheads markéiert) wéi am "Material a Methoden" beschriwwen. Vergréisserung: Baren sëlwecht fir 10 μm. MGC, murine gastric carcinoma. VerfÜgung 2 Zell Uewerfläch Ausdrock vun epithelial lues Dorënner (A) an MHC Klass I an II Molekülle (B). Gastric carcinoma Zell Strecken reagéiert entweder mat PE-Knäppchen (H-2Kb, H-2Db, ech-Ab) oder mat unlabeled mAbs (CEACAM1, E-cadherin, EpCAM) gefollegt vun incubation mat PE-Label anti-Maus IgG oder FITC -labeled anti-Grenzwäerter IgG an duerch onkontrolléiert cytometry analyséiert. Histograms Ecran de mat antibodies géint relevant antigens kritt Resultater mat (oppen gro) oder ouni (oppen schwaarz) virewech IFNγ Stimulatioun an onwichteg antigens (gefëllt Kéiren gro). VerfÜgung Fir d'Potential vun der Zell Zeilen ze bestëmmen ze ginn fir der Generatioun vun dräi-Dimensiounen entholl Modeller mir entholl Zell spheroid Opstellung kënschtlech analyséiert. Als zu Lalumi illustréiert. 1B der Zell Linnen kompakt entholl Zell spheroids aleng no 8 Deeg vun der Kultur wou 103 Zellen an mëll Agar-Beschichtete 96-gutt Placke rakommen goufen. Nëmmen minor Zollformalitéiten-experimentell Variant war wéinst der Gréisst vun de spheroids observéiert. Staining mat propidium Kaliumiodid an FITC-Label annexin V bewisen, datt d'Uewerfläch Layer vun der spheroids mannst vun liewensfäeg Zellen bestoung bis et verbonnen mat ganz wéineg dout Zellen (Figebam. 1B). VerfÜgung Transgene Ausdrock vun der gastric carcinoma Zell Linnen
CEA an Tag kann als entholl-spezifesch antigens (TSA) oder entholl-verbonne antigens (TAA) no Transplantatioun vun der nei gegrënnt entholl Zell Linnen an immunocompetent syngeneic C57BL /6 a CEA- oder Tag-transgenic Mais, bzw. déngen. Obwuel instrumental an entholl Équipe, ass Tag transgene Ausdrock net ëmmer an entholl Zell Linnen fonnt ofgeleet vun Tag-transgenic Mais, wéi zu entholl Zell Linnen TRAMP [25]. Dës Suite eis den Ausdrock an MHC Klass sin-limitéiert Presentatioun vun der Tag transgene souwéi den Ausdrock vun CEA vun der etabléierter gastric carcinoma Zell Zeilen ze analyséieren. CEA Zell Uewerfläch Ausdrock war zu Zell Linnen ofgeleet vun gastric erhéijen vum double transgenic Mais duerch onkontrolléiert cytometry a Western blot Analyse analyséiert. Während den Ausdrock vun der CEA transgene ass déi komplett Promoteur Regioun vun der mënschlecher CEA Gentherapie den Ausdrock vun der Tag reegelen vun engem Minimum vu -424 /-8 BP CEA Promoteur kontrolléiert ass (Figebam. 3A). All dräi double-transgenic Zell Linnen ausgedréckt CEA op der Zell Uewerfläch (Figebam. 3B). An der Linn gastric carcinoma Zell mGC2 CEA transgene-ausgedréckt CEA Schatzkummer engem molekulare Gewiicht vun 180 kDa ähnlech zu der eent zu SV40-transforméiert afrikanesch gréng Af Nier Zellen fonnt stably mat engem CEA Ausdrock Vecteure transfected an zu CEA fonnt Mënschen. Wéi erwaart, huet kee CEA zu 424GC Zellen fonnt, deen aus enger CEA-negativ Tag-transgenic Maus (Figebam. 3C) gegrënnt goufen. Markéierung gouf fonnt vun Western blotting an immunofluorescence Analyse vun all Zell Zeilen aus eenzeg an double-transgenic Mais (Figebam. 3D an Daten net gewisen) ofgeleet ausgedréckt gin. Dëst brengt ënnerstëtzt och den Ursprong vun der Zell Zeilen aus de Mo. carcinomas. Ausserdeem, d'424GC Zell Linn effizient endogenously Filteren Tag-ofgeleet peptides virgestallt, besonnesch d'T1 epitope, an engem MHC-ech Manéier ageschränkt wéi vun der Aféierungs- vun secretion IFNγ sech byTag-spezifesch CTL (Figebam. 4A). Ausserdeem, goufen d'Zell Linnen effizient vun Tag-spezifesch CTL zu cytotoxic assays (Figebam. 4B) ëmbruecht. Figur 3 Expression vun CEA an Tag vun gastric carcinoma Zell Linnen ofgeleet vun CEA424 /Tag- oder CEA424 /Tag × CEA-transgenic Mais. (A) Struktur vun der CEA an CEA424 /Tag transgenes. D'exons 1-10 vun der mënschlecher CEA Gentherapie am Text vun cosmid Klon cosCEA1 enthale [14] ginn als Faarf kodéiert Këschte gewisen (hell blo, Leader; rout, IgV-wëll Domän; blo CIG-wëll Domän; gro, transmembrane Domän;.. wäiss, 5 'an 3'-untranslated Regioun exons Vecteure Message Reliefsailen als schwaarz Këschte ugewise sinn d'Lag vun der CEA minimal Promoteur an de SV40 Tag Gentherapie transgene vun agekreest Linnen uginn ass, sinn d'Nimm vun de transgenic Linnen dës an der lénker Spillraum. (B) Flow cytometry vun Etikette vun der uginn Zellen Leeschtung war entweder mat der CEA-spezifesch MAB- 26/3/13 (gefëllt Kéieren) oder eng isotype-stemmt antibody (oppen Kéieren) gefollegt vun PE-Label Geess Anti-Maus IgG antibodies. (C, d) fir Western Analyse, 10 μg vun insgesamt FAQ aus dovu vun 424GC oder mGC8 aus CEA424 /Tag-transgenic Mais etabléierten Zellen an mGC2CEA an mGC4CEA Zellen aus CEA424 /Tag × CEA-transgenic Mais sech Gréisst vun SDS polyacrylamide gelies electrophoresis getrennt, zu enger Membran transferéiert an geklot mat der CEA-spezifesch MAB- 26/3/13 (C) oder Hamster polyclonal anti-Tag antibodies (d). Extraiten aus Cos7L-CEA a gesot-A Zellen stably transfected mat Ausdrock vectors Zeechesaatz CEA oder en Tag eng Regioun mat der Nuklearenergie Lokalisatioun Signal (cTag) fiert als eng positiv Kontroll subtil. D'Taille vun FAQ lues sinn an déi lénks Rand uginn. VerfÜgung gastric carcinoma Zell Verse murine 4 MHC Klass sin-limitéiert Presentatioun vun Tag epitopes Dorënner. (A) Epitope-spezifesch CTL generéiert an C57BL /6 Mais duerch DNA immunization mat engem Tag Ausdrock Vecteure a Kierzunge Ausbau vun kënschtlech Stimulatioun mat Tag peptide-iwwerlaascht RBL5 Zellen sech mat irradiated 424GC incubated, 424 Här iwert mech selwer, RBL5 an Tag T1, T2 /3 oder T4 peptide-pulsed RBL5 Zellen fir 24 h an hir IFNγ secretion an der Kultur Medien war vun Elisa alles. Secretion vun IFNγ vun CTL mat 424GC Zellen stimuléiert beweist, datt dës Zellen presentéieren SV40Tag-spezifesch peptides an eng MHCI-limitéiert täteg. (B) Coculture vun 424GC an 424 Här iwert mech selwer sech fir 48 h mat 107 Tag-spezifesch CTL zu engem Petri Plat behandelt. Duerno, Net-Operstéiungszeen (doud) Zellen goufen ofgegruewen. Lénks, coculture virun CTL behandelen; Recht, coculture der Behandlung. Feiler weg d'Positioun vun der entholl Zellen virun Zousätzlech vun CTL VerfÜgung Tumorigenicity vun der gastric carcinoma Zell Linnen VerfÜgung der tumorigenicity vun der Zell Linnen, verschidden Zuelen (1 × 10 5 ze bestëmmen;. 3 × 10 5: 1 × 10 6) vun Zellen sech subcutaneously an C57BL /6 Mais heijen. All Zell Strecken kënnen erhéijen zu 100% vun den Déieren ze Form, wann op d'mannst 3 × 10 5 entholl Zellen sech heijen (Figebam. 5A). D'erhéijen gewuess bal exponentially ouni Retard bis se e Volume vun 300 mm erreecht 3. konnt kee wäit Investitiounen während der Observatioun Zäit nogewise ginn. Western blot Analyse op transplantéiert erhéijen standing bewisen, dass souwuel transgenes vun der Zell Linnen ausgedréckt huet an VIVO VerfÜgung (Donnéeën net gewisen). D'Verdueblung Zäite vun der entholl Zellen zu VIVO VerfÜgung op engem Start entholl Laaschten vun 10 6 Zellen variéiert tëschent 7,2 (mGC8) an 13,8 Deeg (mGC3) (Figebam. 5A). Kënschtlech VerfÜgung, Schatzkummer all Zell Linnen ähnlech Verdueblung Zäite vun iwwer 3 Deeg (Figebam. 5B). Mir weider subcutaneous entholl Opstellung vun der Zell Linnen Verglach zu Wildwest-Typ (C57BL /6) an transgenic Mais. Keng Differenze waren am entholl huelen an entholl Wuesstem fir d'Zell Linn 424GC observéiert wann subcutaneously an Wëllschwäin-Typ oder CEA424 /Tag-transgenic Mais (Figebam. 6A) a fir mGC11 CEA Zellen der Sprëtz an Wëllschwäin-Typ heijen an CEA424 /Tag-CEA-transgenic Mais (Figebam. 6B). Figur 5 Am VIVO (A) an eng kënschtlech Wuesstem Charakteristiken (B) vun murine gastric carcinoma Zell Linnen. Dräi Mais all waren mat der uginn entholl Zell Schrëtt heijen. Entholl Wuesstem war vun zwee vertikal Miessunge vun der entholl Duerchmiesser an der Berechnung vun de Volumen laachen wéi an d 'Material a Methoden Rubrik beschriwwen. Fir eng kënschtlech Wuesstem Charakteristiken festzestellen, goufen Zellen am 24-gutt Placke ugebaut mat der uginn Zell Zuelen Start. Op verschiddene Zäit Punkten Zellen aus triplicate Wells sech gesammelt an gezielt. Resultater sinn als mengen +/- Standard deviation (Fils) gewisen. Best fit Kéiren souwéi Verdueblung Mol an Deeg (a Klammeren gewisen) waren berechent der GraphPad Software benotzen. VerfÜgung 6 Wuesstem vun gastric carcinoma Zell Linnen Dorënner zu Wildwest-Typ an transgenic Mais. 3 × 105 424GC Zellen sech subcutaneously an C57BL /6 a CEA424 /Tag-transgenic Mais (A) oder 3 × 105 mGC11CEA Zellen sech an C57BL /6 a CEA424 /Tag × CEA-double transgenic Mais (B) heijen heijen. Entholl Wuesstem war vun zwee vertikal Miessunge vun der entholl Duerchmiesser an der Berechnung vun de Volumen laachen wéi an d 'Material a Methoden Rubrik beschriwwen. Resultater sinn als mengen +/- Fils (n = 3) gewisen. VerfÜgung Immunogenicity vun der gastric carcinoma Zell Linnen D'ähnlechen Wuesstem vun der entholl Zell Linnen VerfÜgung zu Wildwest-Typ an transgenic Mais beweist, datt kee groussen immun Äntwert ze entweder entholl antigen (Tag, CEA) opgetrueden an entholl Träger Mais. Iwwerhaapt kee Tag-spezifesch CTL an der Mëlz vun entholl Wildwest-Typ Mais op II subcutaneous Wuesstem vun Tag-ausdrécken gastric carcinoma Zellen Träger identifizéiert ginn hätt (Donnéeën net gewisen). Allerdéngs, wann duebel transgenic Zell Linnen am Mais gewuess, CEA-spezifesch antibodies kéint zu Wildwest-Typ C57BL /6 Mais identifizéiert ginn awer net zu CEA-transgenic Mais (Figebam. 7A). Ausserdeem, dräi immunizations vun C57BL /6 Mais mat 106 KHTML-thawed mGC8 entholl Zellen um Wochemaart Intervalle entweder dowéinst Wuesstem vun subcutaneously heijen liewen mGC8 Zellen komplett oder entholl outgrowth war fir bal dräi Wochen jee op der heijen entholl Zell Dosis (Lalumi Verspéidung. 7B , C). Dës Experimenter der entholl Zell Leitungen immunogenic ënner gewësse Conditiounen. Allerdéngs, C57BL /6 Mais do net spontan eng efficace entholl Werdegang-limitéieren immun Äntwert ze entweder entholl antigen während subcutaneous entholl Wuesstem opgebaut. Figur 7 Immunogenicity vun MGC Zellen. (A) Anti-CEA antibodies waren an der serum vun C57BL /6 a CEA-transgenic Mais alles cytometry benotzt stréimen. All Mais haten lues wuessen erhéijen ouni Verkaf necrosis der Transplantatioun a Wuesstem vun der uginn Zell Linnen fir 35-40 Deeg. mGC4CEA Zellen sech mat der serum vun der uginn Mais bei verschiddene dilutions a gebonnen Primärschoul antibodies incubated sech mat engem PE-conjugated anti-Maus antibody fonnt. (B, C) Dräi C57BL /6 Mais all ware mat 1 × 106 mGC8 Zellen vun zwee KHTML-Thaw Zykle ëmbruecht subcutaneously dräi Mol um Wochemaart Intervalle heijen. Zwou Wochen no de leschte Impfpass, huet de Mais vun Sprëtz erausgefuerdert mat 1 × 106 (B) an 3 × 106 (C) liewen mGC8 Zellen, bzw. (gefëllt-a Kreeser). Als Kontroll, goufen entholl Zellen an Net-immunized Mais (oppen Kreeser) heijen. Entholl Bänn sech als an Material a Methoden Rubrik beschriwwen berechent. Resultater sinn als mengen Wäerter gewisen +/- Fils. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung D'Haaptziel vun dëser Etude war eng therapeutesch Modell vun gastric Kriibs zu immunocompetent Mais gedoe fir datt en Déier Modell gëtt géif anti-entholl excellence ze diskutéieren an immunotherapeutic Strategien.

• Primärschoul gastric Net-Hodgkins lymphoma an Chinese Patienten: Medeziner Beméien an prognostic factors
• GASTRICHIP: D2 resection an hyperthermic intraperitoneal Chimiotherapie zu lokalen fortgeschratt gastric carcinoma: eng zoufälleg an multicenter Phase III study