Mångfald i bakterie-värdinteraktioner inom arten Helicobacter heilmannii egentlig bemärkelse

Mångfald i bakterie-värdinteraktioner inom arten Helicobacter heilmannii
egentlig bemärkelse Bild Sammanfattning
Helicobacter (H.) heilmannii
egentlig bemärkelse (ss) är en zoonotisk bakterie som naturligt koloniserar magsäcken hos hundar och katter . Hos människor har denna mikroorganism förknippats med gastrit, magsår och slemhinnor lymfoid vävnad (MALT) lymfom. Det finns få uppgifter om patogenesen av H. heilmannii
S.S. infektioner hos människor och det är inte känt om skillnader i virulens finns inom denna art. Därför var en mongolisk gerbil modell som används för att studera bakterie-värdinteraktioner av 9 H. heilmannii
S.S. stammar. Den koloniseringsförmåga av stammarna, intensiteten av gastrit och genuttryck av olika inflammatoriska cytokiner i magen bestämdes vid 9 veckor efter experimentell infektion. Induktion av en antrum-dominant kronisk aktiv gastrit med bildandet av lymfocytiska aggregat visades 7 stammar. Hög nivå antral kolonisering sågs 4 stammar, medan kolonisering av 4 andra stammar var mer begränsad och en stam upptäcktes inte i magen vid 9 veckor efter infektion. Alla stammar som inducerar en kronisk aktiv gastrit orsakas en uppreglering av den pro-inflammatoriska cytokinen IL-1β i antrum. En minskad antral uttryck av H + /K + ATPas sågs i magen efter infektion med 3 mycket koloniserande stammar och 2 mycket koloniserande stammar orsakade en ökad gastrin uttryck i ögonbotten. I inget av de H. heilmannii
S.S.-infekterade grupper, IFN-γ uttryck var uppreglerad. Denna studie visar mångfalden i bakterie-värdinteraktioner inom arten H. heilmannii
S.S. Introduktion
Helicobacter (H.) och att patogenesen av gastriska infektioner med denna mikroorganism är inte identisk med den för en H. pylori
infektion
. Pylori
är den vanligaste Helicobacter
arter kolonisera magslemhinnan hos människor och har förknippats med gastrit, magsår och magcancer [1-3]. Förutom H. pylori
, andra morfologiskt distinkt icke-H. pylori Helicobacter
(NHPh) art, även kallad H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] har förknippats med gastrisk sjukdom hos människor [5-10]. NHPh representerar en grupp av nära besläktade men distinkta bakteriearter, främst i olika djurarter, såsom H felis
, H. Salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
sensu stricto (ss), H. cynogastricus Mössor och H. baculiformis
hos katter och hundar och H. suis
hos svin [5, 7, 10-15]. Dessa mikroorganismer kännetecknas av sin extremt kräsen natur, som hittills har resulterat i ett begränsat antal in vitro isolat tillgängligt över hela världen.
H. heilmannii
S.S. har först nyligen isolerats och odlas in vitro [16]. Det har upptäckts i vilda kattdjur och i humana gastriska biopsier, men det är vanligast i magslemhinnan av katter och hundar med en prevalens mellan 20 och 100% [5-7, 10, 12]. Även om denna bakterie har satts i samband med kronisk aktiv gastrit hos katter och hundar [12], dess patogena betydelse förblir gåtfull och förmodligen stam beroende. Hos människor, H. heilmannii
S.S. har påvisats i 8-19% av gastriska biopsier med histologiska tecken på NHPh infektion [5, 8, 10]. Infektion med denna bakterie hos människa har förknippats med gastrit, magsår och slemhinnor lymfoid vävnad (MALT) lymfom [5, 8, 10, 17, 18].
Flera infektionsstudier i experimentella djurmodeller har utförts för att undersöka patogenesen av H. pylori
infektioner hos människor. I motsats härtill finns lite information behandlar patogenesen av H. heilmannii
S.S. infektioner hos människa. Denna bakterie har förökats i möss för upp till 28 månader och kunde framkalla MALT lymfom i magen på dessa djur [18]. Men i denna mus experiment homogeniserad gastric vävnad som används som inokulum. Detta innebär att andra mikroorganismer ympades tillsammans med H. heilmannii
S.S., som kan påverka resultaten, som har beskrivits tidigare [19]. Således, för att få bättre insikt i patogenesen av human gastrisk sjukdom associerad med H. heilmannii
S.S., experimentella infektionsstudier med rena kulturer av denna mikroorganism är viktigt. Därför är syftet med denna studie var att studera bakterie-värdinteraktioner av 9 H. heilmannii
S.S. stammar, isolerad från magslemhinnan av olika katter. Den mongolisk ökenråtta-modellen har tidigare visats sig vara en användbar djurmodell för att studera Helicobacter
-relaterade gastric patologi i människor och användes därför i föreliggande studie [19-21].
Material och metoder
Bacterial stammar
Nio stammar av H. heilmannii
ss erhölls från magslemhinnan olika katter och betecknas ASB1 (= typ stam, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 och ASB14. Bakterierna odlades på bifasiska Brucella
agarplattor (Oxoid, Basingstoke, UK) som kompletterats med 20% (volym /volym) fetalt kalvserum (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /L amphothericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, innehåller 10 mg /L vankomycin, 5 mg /L trimetoprim laktat och 2500 U /L polymyxin B), Vitox tillägg (Oxoid) och 0,05% HCl (pH 5). Efter inkubation enligt mikroaerob betingelser (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C), de bakterier skördas och den slutliga koncentrationen justerades till 7 × 10 8 levande bakterier /ml, som bestämdes genom räkning i en Neubauer räknekammare
Djur, bostäder och experimentell procedur
specifik patogenfria (SPF) kvinnliga fem veckor gamla mongoliska ökenråttor (CRL. MON (Tum), n
= 48) erhölls från Charles River Laboratories (Lille, Frankrike). Djuren inhystes i filtertopp burar (1500 cm 2) på autoklave träspån och autoklaveras hö. Att de matats ad libitum en autoklaverad kommersiell diet (Teklad 2018S, innehållande 18% protein, Harlan, Nederländerna) och autoklaveras vatten. För var och en av de 9 H. heilmannii
S.S. testade stammar, 5 djur intragastriskt ympades 3 gånger vid 2 dagars intervall med 300 mikroliter av en bakteriesuspension. Tre djur inokulerades med Brucella
buljong (pH 5, Oxoid) och tjänstgjorde som negativa kontroller. Inokulering utfördes under kortvarig isofluran anestesi (2,5%), med användning av en boll-tippas sondmatning nål. Vid 9 veckor efter den första inokuleringen fick djuren avlivas genom cervikal dislokation under djup isoflurananestesi (5%). Magen och tolvfingertarmen hos varje gerbil var opererande och prover togs för histopatologisk undersökning och kvantitativ realtids (RT) -PCR-analys.
In vivo experiment godkändes av den etiska kommittén vid fakulteten för veterinärmedicin, Ghent University, Belgien (EG 2011/090).
Histopatologi och immunohistokemi Review, en längsgående sektion, med början från slutet av förmagen och innefattande antrum och fundus i magsäcken och en del av duodenum, skars längs den större krökning och fixerades i 10% fosfatbuffrad formalin, bearbetades genom standardmetoder och inbäddades i paraffin för Ijusmikroskopi. Tre på varandra följande sektioner av 5 um skars. Efter avparaffinering och hydratisering var värmeinducerad antigenåtervinning utförs i citratbuffert (pH 6). Att blockera endogen peroxidasaktivitet och icke-specifika reaktioner, var diabilder inkuberades med 3% H 2O 2 i metanol (5 min) och 30% getserum (30 min), respektive. Den första delen var färgas med hematoxylin /eosin (H & E) för att poängsätta intensiteten av gastrit enligt det uppdaterade Sydney systemet [22], men med vissa modifieringar, såsom beskrivits tidigare [19]. På den andra sektionen, var epitelcellproliferation bestämdes genom immunhistokemisk färgning med användning av en mus-monoklonal anti-Ki67-antikropp (25/1; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgien). Ki67-positiva epitelceller räknades i fem slumpvis valt High Power Fields på samma nivå som de gastriska gropar (förstoring: 400 x), både i antrum och fundus. Medelvärdet av den positiva celltal beräknades för varje experimentgrupp i både magen regioner
parietalcellerna identifierades den tredje delen av immunhistokemisk färgning för väte kalium ATPas använda en mus monoklonal antikropp (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). Inkubation med primära antikroppar riktade mot Ki67 och väte kalium ATPas följdes av inkubation med en HRP-märkt sekundär antikropp (Envision Link Mouse K4007, Dako, Heverlee, Belgien) för visualisering.
DNA-extraktion och kvantifiering av kolonisera H. heilmannii
ss i magen och tolvfingertarmen
Från varje gerbil, togs prover från fundus och antrum i magen och från tolvfingertarmen togs. Vävnadsprover lagrades i 1 ml RNA senare (Ambion, Austin, TE, USA) vid -70 ° C fram till RNA- och DNA-extraktion. Vävnadsprover homogeniserades (MagNALyser, Roche, Mannheim, Tyskland) och RNA och DNA separerades med användning TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Antalet kolonisera H. heilmannii
S.S. per mg gastric vävnad bestämdes i DNA-prover med hjälp av en H. heilmannii
S.S.-specifik kvantitativ RT-PCR. För alstring av standarden, en del av den ureAB
genklustret (1224 bp) från H. heilmannii
S.S. ASB1 amplifierades med användning av primrar U430F och U1735R, såsom beskrivits tidigare [6]. Standarden bestod av 10-faldiga-utspädningar med början vid 10 8 PCR amplikoner för varje 10 mikroliter av reaktionsblandningen. En mikroliter av extraherat DNA-mall suspenderades i en 10

• Genome sekvensanalys av Helicobacter pylori stammar i samband med magsår och magsäcks cancer
• Antimikrobiell aktivitet, akut toxicitet och cellskyddande effekt av crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore extrakt i en råtta etanol-HCI magsår model