La diversità nelle interazioni batterio-ospite all'interno della specie Helicobacter heilmannii in senso stretto

La diversità nelle interazioni batterio-ospite all'interno della specie Helicobacter heilmannii
in senso stretto
Abstract
Helicobacter (H.) heilmannii
in senso stretto (SS) è un batterio che colonizza zoonotici naturalmente lo stomaco di cani e gatti . Negli esseri umani, questo microrganismo è stato associato con gastrite, ulcera peptica e della mucosa tessuto linfoide associato (MALT) linfoma. Poche informazioni sono disponibili sulla patogenesi di H. heilmannii
S.S. infezioni negli esseri umani e non si sa se esistono differenze nella virulenza all'interno di questa specie. Pertanto, un modello gerbillo mongolo è stato utilizzato per studiare le interazioni batterio-ospite di 9 H. heilmannii
S.S. tensioni. La capacità di colonizzazione dei ceppi, l'intensità di gastrite e l'espressione genica di varie citochine infiammatorie nello stomaco sono stati determinati a 9 settimane dopo l'infezione sperimentale. L'induzione di una gastrite cronica attiva antro-dominante con formazione di aggregati linfocitica è stato mostrato per 7 ceppi. colonizzazione antrale di alto livello è stato visto per 4 ceppi, mentre la colonizzazione di altri 4 ceppi era più ristretto e un ceppo non è stato rilevato nello stomaco a 9 settimane dopo l'infezione. Tutti i ceppi che inducono una gastrite cronica attiva, hanno causato un up-regulation della citochina pro-infiammatoria IL-1β nel antro. Una ridotta espressione antrale di H + /K + ATPasi è stato visto nello stomaco dopo l'infezione con 3 ceppi altamente colonizzatori e 2 ceppi altamente colonizzanti causato un aumento dell'espressione gastrina nel fondo. In nessuno dei H. heilmannii
gruppi S.S.-infetti, espressione di IFN-γ è up-regolato. Questo studio dimostra la diversità nelle interazioni batterio-ospite all'interno del H. specie heilmannii
S.S. e che la patogenesi delle infezioni gastriche con questo microrganismo non è identico a quello di un H. pylori
infezione.
Introduzione
Helicobacter (H.) pylori
è il più prevalente Helicobacter
specie colonizzare la mucosa gastrica di esseri umani ed è stata associata a gastrite, ulcera peptica e cancro gastrico [1-3]. Oltre H. pylori
, altro morfologicamente distinte non-H. Helicobacter pylori
(NHPH) specie, noto anche come H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] sono stati associati con la malattia gastrica nell'uomo [5-10]. NHPH rappresenta un gruppo di specie batteriche strettamente correlati, ma distinti, che si trova principalmente nelle diverse specie animali, come ad esempio H. felis
, H. Salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
in senso stretto (ss), H. cynogastricus baculiformis H. Comprare e vendere nei gatti e cani e H. suis
nei suini [5, 7, 10-15]. Questi microrganismi si caratterizzano per la loro natura estremamente esigente, che finora ha portato a un numero limitato di isolati in vitro disponibili in tutto il mondo.
H. heilmannii
S.S. solo recentemente isolati e coltivati ​​in vitro [16]. È stato rilevato in felino selvaggio e in biopsie gastriche umane, ma è più comunemente trovato nella mucosa gastrica di cani e gatti con una prevalenza che varia dal 20 al 100% [5-7, 10, 12]. Anche se questo batterio è stato associato con gastrite cronica attiva in cani e gatti [12], il suo significato patogeno rimane enigmatico ed è probabilmente Strain-dipendente. Negli esseri umani, H. heilmannii
S.S. è stato rilevato nel 8-19% delle biopsie gastriche con evidenza istologica di infezione NHPH [5, 8, 10]. L'infezione da questo batterio negli esseri umani è stato associato con gastrite, ulcera peptica e malt (MALT) linfoma [5, 8, 10, 17, 18].
Diversi studi di infezione in modelli sperimentali animali sono stati effettuati a studiare la patogenesi di H. pylori
infezioni nell'uomo. Al contrario, sono disponibili poche informazioni che fare con la patogenesi di H. heilmannii
S.S. infezioni nell'uomo. Questo batterio è stato propagato in topi per un massimo di 28 mesi ed è stato in grado di indurre MALT linfoma nello stomaco di questi animali [18]. Tuttavia in questo esperimento mouse, tessuto gastrico omogeneizzata viene utilizzata come inoculo. Ciò implica che altri microrganismi sono stati inoculati insieme H. heilmannii
S.S., che potrebbe influenzare i risultati, come precedentemente descritto [19]. Così, per ottenere migliori intuizioni nella patogenesi della malattia gastrica umana associata ad H. heilmannii
S.S., gli studi sperimentali di infezione con colture pure di questo microrganismo sono essenziali. Pertanto, lo scopo del presente studio è stato quello di studiare le interazioni batterio-ospite di 9 H. heilmannii
S.S. ceppi, isolata dalla mucosa gastrica di diversi gatti. Il modello gerbillo mongolo è stato precedentemente dimostrato di essere un modello animale utile per studiare Helicobacter
-related patologia gastrica negli esseri umani ed è stato quindi utilizzato in questo studio [19-21].
Materiali e metodi
batterica ceppi
Nove ceppi di H. heilmannii
ss sono stati ottenuti da mucosa gastrica di diversi gatti e ASB1 designato (= tipo di ceppo, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 e ASB14. I batteri sono stati coltivati ​​su bifasica Brucella
piastre di agar (Oxoid, Basingstoke, UK) integrati con il 20% (v /v) di vitello fetale siero (HyClone, Logan, UT, Stati Uniti d'America), 5 mg /L amphothericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, Stati Uniti d'America), Skirrow (Oxoid, contiene 10 mg /L vancomicina, 5 mg /L trimetoprim lattato 2500 U /L polimixina B), supplemento Vitox (Oxoid) e il 0,05% di HCl (pH 5). Dopo l'incubazione in condizioni microaerofilia (85% N 2, il 10% di CO 2, 5% O 2; 37 ° C), i batteri sono state raccolte e la concentrazione finale è stata regolata a 7 × 10 8 batteri vitali /ml, come determinato contando in una camera di conteggio Neubauer
animali, abitazioni e procedura sperimentale
gratuito specifico-patogeno-(SPF) di sesso femminile a cinque settimane di età gerbilli mongoli (Crl:. MON (TUM), n
= 48) sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Lille, Francia). Gli animali sono stati alloggiati in gabbie filtro superiore (1500 cm 2) su trucioli di legno in autoclave e di fieno in autoclave. Essi sono stati alimentati ad libitum una dieta commerciale autoclavato (TEKLAD 2018S, contenente proteine ​​18%, Harlan, Paesi Bassi) e acqua in autoclave. Per ciascuna delle 9 H. heilmannii
S.S. ceppi testati, 5 animali sono stati inoculati per via intragastrica 3 volte ad intervalli di 2 giorni con 300 ml di una sospensione batterica. Tre animali sono stati inoculati con Brucella
brodo (pH 5, Oxoid) e servito come controlli negativi. Inoculazione è stata eseguita in breve anestesia isoflurano (2,5%), utilizzando un ago sonda gastrica palla a punta. A 9 settimane dopo la prima inoculazione, gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale sotto anestesia profonda isoflurano (5%). Lo stomaco e il duodeno di ogni gerbillo sono stati asportati e sono stati prelevati campioni per l'esame istopatologico e in tempo reale (RT) analisi quantitativa -PCR.
L'esperimento in vivo è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Veterinaria, Gand Università, Belgio (CE 2011/090).
istopatologia e immunoistochimica
Una sezione longitudinale, a partire dalla fine del prestomaco e comprendente l'antro ed il fondo dello stomaco e parte del duodeno, è stato tagliato lungo la curvatura maggiore e fissato in 10% tampone fosfato in formalina, elaborati da metodi standard ed inclusi in paraffina per microscopia ottica. Tre sezioni consecutivi di 5 micron sono stati tagliati. Dopo deparaffinizzazione e idratazione, indotta dal calore recupero dell'antigene è stata effettuata in tampone citrato (pH 6). Per bloccare l'attività della perossidasi endogena e reazioni non specifiche, diapositive sono state incubate con 3% H 2O rispettivamente 2 in metanolo (5 min) e siero di capra 30% (30 min),. La prima sezione era macchiato con ematossilina /eosina (H & E) a segnare l'intensità della gastrite secondo il sistema Sydney aggiornato [22], ma con alcune modifiche, come precedentemente descritto [19]. Nella seconda sezione, la proliferazione delle cellule epiteliali è stata determinata mediante colorazione immunoistochimica utilizzando un anticorpo monoclonale del mouse anticorpo anti-Ki67 (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgio). cellule epiteliali Ki67-positive sono state contate in 5 scelto casualmente High Power Fields a livello delle fossette gastriche (ingrandimento: 400 ×), sia in antro e fundus. La media del numero di celle positivo è stato calcolato per ciascun gruppo sperimentale in entrambe le regioni dello stomaco
cellule parietali sono state identificate sulla terza sezione per colorazione immunoistochimica per il potassio idrogeno ATPasi utilizzando un anticorpo monoclonale murino (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). L'incubazione con anticorpi primari diretti contro Ki67 e acido di potassio ATPasi è stata seguita da incubazione con un anticorpo secondario HRP-marcato (Envision collegamento mouse K4007, Dako, Heverlee, Belgio) per la visualizzazione.
Estrazione del DNA e la quantificazione di colonizzare H. heilmannii
ss nello stomaco e duodeno
Da ogni gerbillo, sono stati prelevati campioni dalla fundus e l'antro dello stomaco e del duodeno. I campioni di tessuto sono stati conservati in 1 mL di RNA dopo (Ambion, Austin, TE, Stati Uniti d'America) a -70 ° C fino a RNA e DNA-estrazione. I campioni di tessuto sono stati omogeneizzati (MagNALyser, Roche, Mannheim, Germania) e RNA e DNA sono stati separati usando TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il numero di colonizzare H. heilmannii
S.S. per mg di tessuto gastrico è stata determinata nei campioni di DNA con una H. heilmannii
S.S. specifico RT-PCR quantitativa. Per la generazione dello standard, parte del ureAB
cluster di geni (1224 bp) da H. heilmannii
S.S. ASB1 è stato amplificato utilizzando i primer U430F e U1735R, come descritto in precedenza [6]. Lo standard era costituito da 10-fold-diluizioni a partire da 10 8 ampliconi della PCR per ogni 10 ml di miscela di reazione. Un ml di modello di DNA estratto è stato sospeso in una miscela di reazione 10 ml costituito da 0,25 ml di entrambi i primer situati all'interno del frammento bp 1224, per produrre un 212 bp prodotto di PCR (senso di fondo: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', primer antisenso: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', temperatura di ricottura 58 ° C), 3,5 ml di acqua HPLC e 5 ml SensiMix ™ SYBR No-ROX (Bioline Reagenti Ltd , UK). Entrambi gli standard ei campioni sono stati eseguiti in duplicato su un sistema CFX96 ™ RT-PCR con una C1000 Cycler termico (Bio-Rad, Hercules CA, USA). L'(versione 1.6) del software Bio-Rad CFX Manager è stato utilizzato per il calcolo dei cicli soglia (Ct) -Valori e analisi della curva di fusione del DNA amplificato. I valori medi dei duplicati sono stati utilizzati per la quantificazione di H. heilmannii
S.S. DNA nei campioni di tessuto.
Preparazione RNA e espressione genica
RNA totale, dai campioni di tessuto, è stato purificato utilizzando il RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania), secondo le istruzioni del produttore. La purezza di RNA è stata dimostrata misurando il rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm con NanoDrop che in tutti i casi è stato di circa 2. La concentrazione di RNA in ciascun campione è stato regolato a 1 mg /mL e cDNA è stato sintetizzato subito dopo purificazione RNA utilizzando iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Aliquote di cDNA (1/5 diluizione) sono stati utilizzati come modello per RT-PCR quantitativa per misurare l'espressione genica. I livelli di espressione di mRNA di diverse citochine (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ e TNF-α), gastrina e H + /K + ATPasi sono stati quantificati. I geni housekeeping GAPDH, β-actina
e HPRT
sono stati inclusi come i geni di riferimento. sequenze primer sono mostrati nella Tabella 1 [23-28]. Per tutti i geni bersaglio e geni di riferimento, le efficienze di primer erano tra 1,9 e 2,1. Le reazioni sono state eseguite in 10 volumi microlitri contenenti 1 ml di cDNA, 0,05 ml di entrambi i fondi, 3,9 microlitri HPLC acqua e 5 ml SensiMix ™ SYBR No-ROX. Il protocollo sperimentale per reazione di PCR (40 cicli) è stata eseguita su un sistema RT-PCR CFX96 ™ con un termociclatore C1000 (Bio-Rad): denaturazione per 15 min a 95 ° C, seguita da cicli di amplificazione a 95 ° C per 20 s, annealing a 60 ° C per 30 s ed estensione a 73 ° C per 30 s. Le reazioni di controllo senza il passaggio della trascrittasi inversa sono state implementate per escludere la contaminazione del DNA dei campioni di RNA. No-modello-controllo miscele di reazione sono stati inclusi e tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato. CT-valori sono stati normalizzati per la media geometrica dei Ct-valori dei 3 geni di riferimento, dopo di che i livelli di mRNA normalizzati sono stati calcolati utilizzando il 2 -ΔΔCt metodo [29] .table 1 coppie di primer.
Primer
Sequence (5 '→ 3')
citochine
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL- 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC AGC CAG CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
Gastrin
gastrina FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
Gastrin RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPasi ( cellule parietali)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
geni di riferimento
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actina FW28
CCA CCA AGG ACC GCG AGA TGA C
RV28 β-actina
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
coppie di primer utilizzato per la misurazione sono mostrati i livelli di espressione di mRNA di iL-1β, iL-5, iL-6, iL-10, iL-12p40, iL-17, IFN-y, TNF-alfa, gastrina e H + /K + ATPasi. I geni housekeeping GAPDH, β-actina
e HPRT
sono stati inclusi come i geni di riferimento.
Analisi statistica
normalità e la varianza omogeneità dei dati sono stati analizzati utilizzando test di normalità Shapiro-Wilk e il test di Levene per l'omogeneità delle varianze. punteggi gastrite, capacità di colonizzazione e l'espressione del gene ATPasi e gastrina sono stati confrontati tra i diversi gruppi infetti e controlli utilizzando l'analisi Kruskall-Wallis, seguito da un Mann-Whitney U
test. espressione di citochine e il numero di cellule Ki67-positivi sono stati analizzati mediante analisi della varianza con un test di Bonferroni post hoc. Le differenze sono state considerate statisticamente significativa a p
≤ 0,05. SPSS Statistics software 21 (IBM) è stato utilizzato per tutte le analisi.
Risultati
L'infezione da H. virulenta heilmannii
S.S. ceppi induce una gastrite cronica attiva antro-dominante
Lo stomaco di tutti gli animali di controllo ha mostrato una istomorfologia normale (Figura 1a). L'infiammazione nello stomaco di gerbilli infettati da H. heilmannii
S.S. ceppi ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14 è stato caratterizzato da una gastrite cronica attiva con formazione di aggregati linfocitica nella lamina propria e sottomucosa del antro dello stomaco (Figura 1b). Lo spessore della mucosa è stata leggermente aumentata e sono stati rilevati solo pochi neutrofili. Al contrario, H. heilmannii
S.S. ceppi ASB7 e ASB9 non hanno causato esplicito infiammazione antrale e solo un lieve aumento del numero di cellule linfocitica è stata osservata nella lamina propria della antro dello stomaco (Figura 1c). In tutto H. heilmannii
gerbilli S.S.-infetti, sono stati rilevati segni limitate di infiammazione nel fondo dello stomaco (sui file 1). I punteggi di infiammazione antrali di ciascun animale sono mostrati in figura 2d. Una differenza statisticamente significativa tra i punteggi di infiammazione per gerbilli inoculati con ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14 rispetto a è stato dimostrato il gruppo di controllo (test di Mann-Whitney U
, p
< 0,05, figura 2d). Figura 1 H & E colorazione del antro di uno stomaco gerbillo. Istologia normale dell'antro di un animale controllo negativo sham-inoculati (a). Esplicita infiltrazione linfocitaria della lamina propria e la sottomucosa con la formazione di follicoli linfoidi (frecce) nella antro di un gerbillo inoculato con H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Da lieve a assente infiltrazione linfocitaria (frecce) della lamina propria nel antro di un gerbillo inoculato con H. heilmannii
S.S. ASB7 (c). Bar = 30 micron
. Figura 2 Capacità colonizzazione di H. heilmannii S.S. stiramenti e punteggio infiammazione gastrica dopo l'infezione sperimentale. capacità di colonizzazione è mostrato come log10 valori di H. heilmannii
S.S. batteri per tessuti mg, identificati con RT-PCR quantitativa nel fondo (a) e l'antro (c) dello stomaco e del duodeno (b). Risultati sotto il limite di rilevazione (log 2,39 batteri per tessuto mg) sono stati fissati come 0. Antral infiammazione (d) è stato segnato su una scala da 0 a 4 (0: nessuna infiltrazione con mononucleare e /o polimorfonucleati celle; 1: lieve infiltrazione diffusa con mononucleare e /o cellule polimorfonucleati o la presenza di una piccola (50-200 cellule) aggregato di cellule infiammatorie; 2: infiltrazione diffusa moderata con mononucleare e /o cellule polimorfonucleati e /o la presenza di aggregati 2-4 infiammatorie; 3: marcata infiltrazione diffusa con cellule mononucleari e /o polimorfonucleati e /o la presenza di almeno cinque aggregati infiammatori; 4: diffusa infiltrazione di grandi regioni con grandi aggregati di mononucleare e /o cellule polimorfonucleati) gerbilli specifica ha sono rappresentati come figure intorno alla media ( Linee). differenze statisticamente significative rispetto agli animali di controllo sono indicati con * (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05) capacità
colonizzazione di H. heilmannii
S.S.. ceppi nello stomaco e del duodeno
Rilevamento di H. heilmannii
S.S. DNA con RT-PCR a 9 settimane dopo l'infezione rivelato alto livello colonizzazione ASB1, ASB2, ASB3 e ASB6 nello stomaco (Figura 2a-c). Al contrario, la colonizzazione di ASB7, ASB11, ASB13 e ASB14 era più ristretto, mentre ASB9 non è stato rilevato nello stomaco (Figura 2a-c). In generale, la capacità di colonizzazione nel fondo (figura 2a) era inferiore al antro (figura 2c) per tutti i ceppi testati e il minor numero di batteri è stata rilevata nel duodeno (Figura 2b). Inoltre, una chiara associazione è stata osservata tra la capacità di colonizzazione del H. heilmannii
S.S. ceppi ei punteggi di infiammazione gastrica nel antro dello stomaco (Figura 2c-d)
. Virulent H. heilmannii
S.S. ceppi causano gastrica antrale cellule epiteliali proliferazione
Risultati del gastrica epiteliale scoring proliferazione cellulare nel antro dello stomaco sono mostrati in figura 3c. numero significativamente più alto di proliferazione cellule epiteliali Ki67-positivi sono stati osservati nel antro di ASB1- e gerbilli ASB6 infettate, rispetto al gruppo di controllo (ANOVA, p
< 0,05, Figura 3a-b). Numero di cellule Ki67-positivi sono stati moderatamente aumentati nel ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- e gerbilli ASB14-infetti, anche se non statisticamente significativa. H. heilmannii
S.S. ceppi ASB7 e ASB9 non ha causato un aumento della proliferazione delle cellule epiteliali gastriche. Inoltre, il numero significativamente più elevati di proliferazione cellule epiteliali sono state dimostrate nel antro di ASB1-, ASB2-, e gerbilli ASB6 infettate, rispetto a gerbilli infettati con ASB7 e ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figura 3 gastrica antrale proliferazione delle cellule epiteliali. Ki67 colorazione del antro di un gerbillo inoculato con H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) mostra un maggior numero di cellule proliferanti epiteliali rispetto ad un controllo negativo animali sham-inoculato (a). Il tasso di proliferazione delle cellule epiteliali è stata determinata contando le cellule epiteliali Ki67-positivi in ​​5 scelto casualmente High Power Fields a livello delle fossette gastriche (ingrandimento: 400 ×) nella antro dello stomaco gerbillo (c). Il numero medio di cellule Ki67-positivi sono presenti in ogni gruppo sperimentale. Differenze significative tra H. heilmannii
S.S.-inoculati e animali di controllo sono indicati da * (ANOVA, p
< 0,05). Differenze significative in confronto con ASB7 e gruppi ASB9 inoculato sono indicati da, rispettivamente, + e # (ANOVA, p
< 0,05).
Nel fondo di tutte H. heilmannii
gerbilli ss-infetti, il epiteliale tasso di proliferazione delle cellule non è stata significativamente maggiore rispetto agli animali di controllo (file aggiuntivo 2).
citochine espressione genica nello stomaco in risposta ad H. heilmannii
ss infezione
L'host risposta immunitaria locale verso H. heilmannii
S.S. infezione è stata caratterizzata misurando il livello di espressione di mRNA di IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 e TNF-α nello stomaco dei gerbilli. I risultati sono riportati in Tabella 2 e nella Figura 2 4.Table analisi statistica dei livelli di espressione di mRNA.
Antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPasi
Gastrin
medio Ct-Ctrefa
p-valoreB
medio
Ct-Ctref
p-value
Significa
Ct-Ctref
p-value
medio
Ct-Ctref
p-value
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6.87 ± 0.60
1.000
3,70 ± 2,11 *
0.050
7.20 ± 1.68
0.101
ASB2
7.48 ± 1.42
0,231
8.15 ± 1.26
1.000
2.42 ± 5.01
0,513
5.94 ± 2.49 *
0.050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0.008
7.54 ± 0.37
1.000
3.49 ± 2.28 *
0.050
7.71 ± 1.17
0.101
ASB6
6.12 ± 0.67 *
0.001
7.99 ± 0.90
1.000
2.23 ± 1.99 *
0.050
5.33 ± 2.39 *
0.025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7.98 ± 0.52
1.000
0.45 ± 2.51
0,724
7.12 ± 1.54
0,180
ASB9
9,03 ± 2,54
1.000
8.55 ± 0.71
1.000
0,79 ± 0,03
0,564
8.11 ± 1.58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 *
0.004
1.32 ± 1.45
0,248
7.67 ± 1.25
0,289
ASB13
7.72 ± 1.17
0.523
9.54 ± 1.55 *
0.044
3.80 ± 0,34
0,083
8.10 ± 0.93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8.51 ± 0.97
1.000
3.81 ± 3.11
0.127
7.77 ± 2.96
0.881 controllo
negativo
9.71 ± 1.13 -
7.08 ± 0.65 -
0.15 ± 1.82 -
8.70 ± 0.62 -
Viene mostrato l'analisi statistica di iL-1β, IFN-γ e di espressione H + /K + ATPasi mRNA nel antro e gastrina espressione di mRNA nel fondo dello stomaco gerbillo a 9 settimane dopo l'infezione sperimentale. espressione di citochine è stata analizzata mediante analisi della varianza con un test di Bonferroni post hoc. H + /K + ATPasi e gene gastrina espressione sono stati confrontati tra i diversi gruppi infetti e controlli utilizzando analisi Kruskall-Wallis, seguito da un Mann-Whitney U
test. Le differenze sono state considerate statisticamente significativa a p
≤ 0,05. SPSS Statistics software 21 (IBM) è stato utilizzato per tutte le analisi impara una media Ct-Ctref:. Per ogni gruppo sperimentale, la media dei Ct-valori normalizzati ± deviazione standard sono mostrati
bp
-value. : i p
esatte -Valori sono dati
* differenze statisticamente significativa rispetto al gruppo di controllo non infetti (p
≤ 0.05)
Figura 4 livelli di espressione di mRNA di citochine iL-1β e IFN.. γ nel antro dello stomaco. livelli di espressione di citochine mRNA nel fondo e antro dello stomaco sono stati esaminati da RT-PCR quantitativa. Sono mostrati i livelli di espressione di IL-1β (a) e IFN-γ (b) nella antro. I dati sono presentati come variazione piega in genica normalizzata a 3 geni di riferimento e rispetto al gruppo di controllo negativo che è considerato come 1. I dati sono mostrati come mezzo + deviazione standard. Differenze significative a livello di espressione tra i gruppi inoculati e gruppo di controllo negativo sono indicati con * p
< 0.05 (ANOVA).
Il citochina pro-infiammatoria IL-1β è un potente inibitore della secrezione acida gastrica [30] e svolge un ruolo nella fase acuta dell'infiammazione [31]. L'espressione di IL-1β è up-regolato nel antro dello stomaco di gerbilli infettati da H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14, rispetto agli animali di controllo negativo (figura 4a). Per gerbilli inoculate con ASB7 e ASB9, nessun up-regolazione di IL-1β è stato visto.
La Th1 citochina IFN-γ, un marker firma della risposta Th1-polarizzata [24, 32], mostrato una diminuita espressione nella antro di gerbilli infettati con ASB11 e ASB13 (figura 4b), rispetto agli animali di controllo.
Nessuna differenza significativa nell'espressione tra potevano essere osservati per iL-5, iL-6, iL-10 gerbilli infetti e sham-inoculato, IL-12p40, IL-17 e TNF-α.
parietale delle cellule H + /K + ATPasi espressione mRNA è down-regolato in risposta alla colonizzazione da H. heilmannii
ss
Nessuna chiara perdita di cellule parietali potrebbe essere visibili con la colorazione immunoistochimica nel fondo e l'antro della H. heilmannii
gerbilli SS-infetti rispetto ai controlli non infetti (dati non riportati). Tuttavia, RT-PCR quantitativa ha mostrato una netta diminuzione della espressione di gastrica H + /K + ATPasi nel antro dei gerbilli infettati con ASB1, ASB3 e ASB6 (Figura 5 e Tabella 2). Rispetto agli animali di controllo con livelli di espressione di mRNA fissati a 1,0, l'espressione relativa media era di 0,09 ± 2,11 per ASB1-, 0.10 ± 2.28 per ASB3- e 0,24 ± 1,99 per gerbilli ASB6 infettate, rispettivamente. Nessun cambiamento significativo nella espressione è stato visto nel fondo delle H. heilmannii
gerbilli S.S.-infetti. Figura 5 livelli di espressione di mRNA di H + /K + ATPasi nel antro dello stomaco. potassio idrogeno ATPasi mRNA livello di espressione nello stomaco è stato esaminato da RT-PCR quantitativa. è mostrato H + /K + ATPasi mRNA livello di espressione in dell'antro. I dati sono presentati come variazione piega in genica normalizzata a 3 geni di riferimento e rispetto al gruppo di controllo negativo che è considerato come 1. I dati sono mostrati come mezzo + deviazione standard. Differenze significative a livello di espressione tra i gruppi inoculati e gruppo di controllo negativo sono indicati con * p ≤ 0,05
(Mann-Whitney U
test).
Virulent H. heilmannii
S.S. ceppi indurre aumento dell'espressione gastrina nel fondo
Il gastrina ormone peptidico stimola la secrezione di acido gastrico da parte delle cellule parietali. Un disturbo nella sua espressione può portare a ipergastrinemia. L'espressione di gastrina è stato molto up-regolata nel fondo di gerbilli infettati con ASB2 e ASB6 a 9 settimane dopo l'infezione (Figura 6 e Tabella 2). Rispetto agli animali di controllo, l'espressione relativa media era di 6.79 ± 2.49 per ASB2- e 10,35 ± 2,39 per gerbilli ASB6 infettate. Nel antro dello stomaco, nessun up-regolazione dell'espressione gastrina è stato rilevato. Figura 6 livelli di espressione di mRNA di gastrina nel fondo dello stomaco. Gastrin mRNA livello di espressione nello stomaco è stato esaminato da RT-PCR quantitativa. Viene mostrato il livello di espressione nel fondo. I dati sono presentati come variazione piega in genica normalizzata a 3 geni di riferimento e rispetto al gruppo di controllo negativo che è considerato come 1. I dati sono mostrati come mezzo + deviazione standard. Differenze significative a livello di espressione tra i gruppi inoculati e gruppo di controllo negativo sono indicati con * p ≤ 0,05
(Mann-Whitney U
test).
Discussione
a 9 settimane dopo l'inoculazione, una gastrite cronica attiva nel antro dello stomaco è stata osservata in gerbilli infettati sperimentalmente con 7 su 9 H. heilmannii
ss ceppi testati in questo studio (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14). La lamina propria e sottomucosa stati massicciamente infiltrati con linfociti, causando la formazione di follicoli linfoidi. Il H. heilmannii
S.S. ceppi sono stati rilevati principalmente nella antro e in misura minore nel fondo e il duodeno. Negli esseri umani infettati con NHPH, la colonizzazione e l'infiammazione anche si verificano soprattutto nel antro dello stomaco [5, 33-35]. Ciò conferma che gerbilli mongoli sono un modello adatto per studiare H. heilmannii
S.S. infezioni nell'uomo, come è stato dimostrato anche per H. suis
[19] e H. pylori
[20, 21]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• Genoma analisi della sequenza di ceppi di Helicobacter pylori associata con ulcere gastriche e gastriche analisi cancer
• attività antimicrobica, tossicità acuta e l'effetto citoprotettivo di Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore estratto in un'ulcera gastrica di ratto etanolo-HCl attività antimicrobica model