Mangfold i bakterie-vert interaksjoner innenfor arten Helicobacter heilmannii strengt tatt

Mangfold i bakterie-vert interaksjoner innenfor arten Helicobacter heilmannii
strengt tatt
Abstract
Helicobacter (H.) heilmannii
strengt tatt (SS) er en zoonotisk bakterie som naturlig koloniserer magen av hunder og katter . Hos mennesker har denne mikroorganismen vært assosiert med gastritt, magesår sykdom og slimhinner assosiert lymfoid vev (MALT) lymfom. Lite informasjon er tilgjengelig om patogenesen av H. heilmannii
S.S. infeksjoner hos mennesker og det er ikke kjent hvorvidt forskjellene i virulens eksistere innenfor denne arten. Derfor er en mongolsk gerbil modellen ble brukt til å studere bakterie-vert interaksjoner av 9 H. heilmannii
S.S. stammer. Koloniser evne av stammene, intensiteten av gastritt og genekspresjon av forskjellige inflammatoriske cytokiner i magen ble bestemt ved 9 uker etter eksperimentell infeksjon. Induksjon av en antrum-dominant kronisk aktiv gastritt med dannelsen av lymfocytiske aggregater ble vist til 7 stammer. Høy-nivå antral kolonisering ble observert for 4-stammer, mens kolonisering av 4 andre stammer var mer begrenset og en stamme ble ikke påvist i magen på 9 uker etter infeksjon. Alle stammer som induserer en kronisk aktiv gastritt forårsaket en oppregulering av de pro-inflammatoriske cytokin IL-1β i antrum. En redusert antrum uttrykk for H + /K + ATPase ble sett i magen etter infeksjon med 3 svært koloniserende stammer og 2 svært koloniserende stammer forårsaket en økt gastrin uttrykk i fundus. Ikke i noen av H. heilmannii
S.S.-infiserte grupper, IFN-γ ekspresjon var oppregulert. Denne studien viser mangfoldet i bakterie-vert interaksjoner innenfor artene H. heilmannii
S.S. og at patogenesen av mage-infeksjoner med denne mikroorganisme er ikke identisk med et Helicobacter pylori-infeksjon

. Innledning
Helicobacter (H.) pylori
er den mest utbredte Helicobacter
arter kolonmageslimhinnen hos mennesker og har blitt assosiert med gastritt, peptisk sår sykdom og magekreft [1-3]. Foruten H. pylori
, annen morfologisk distinkt ikke-H. pylori Helicobacter
(NHPh) arter, også betegnet som H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] er blitt forbundet med gastrisk sykdom hos mennesker [5-10]. NHPh representerer en gruppe nært beslektede, men forskjellige bakteriearter, hovedsakelig finnes i forskjellige dyrearter, for eksempel H. felis
, H. salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
strengt tatt (ss), H. cynogastricus Hotell og H. baculiformis
i katter og hunder og H. suis
hos griser [5, 7, 10-15]. Disse mikroorganismene er preget av sin ekstremt kresen natur, som så langt har resultert i et begrenset antall in vitro-isolater tilgjengelig over hele verden.
H. heilmannii
S.S. har bare nylig blitt isolert og dyrket in vitro [16]. Det har blitt påvist i naturen feline og i humane mage-biopsier, men det er mest vanlig å finne i gastrisk mucosa fra katter og hunder med en utbredelse som strekker seg fra 20 til 100% [5-7, 10, 12]. Selv om denne bakterien er blitt assosiert med kronisk aktiv gastritt hos katter og hunder [12], forblir dens patogene betydning enigma og er sannsynligvis press-avhengig. Hos mennesker H. heilmannii
S.S. har blitt oppdaget i 8-19% av mage biopsier med histologiske tegn på NHPh infeksjon [5, 8, 10]. Infeksjon med denne bakterien hos mennesker har vært forbundet med gastritt, mavesår og mukosa-assosiert lymfoidvev (MALT) lymfom [5, 8, 10, 17, 18].
Flere infeksjonsstudier i eksperimentelle dyremodeller er blitt utført for å undersøke patogenesen av H. pylori
infeksjoner hos mennesker. I kontrast, er lite informasjon tilgjengelig håndtere patogenesen av H. heilmannii
S.S. infeksjoner hos mennesker. Denne bakterien har blitt dyrket i mus i inntil 28 måneder og var i stand til å indusere MALT lymfom i magen på disse dyrene [18]. Men i dette mus eksperiment, ble homogenisert gastrisk vev ble anvendt som inokulum. Dette medfører at andre mikroorganismer ble inokulert sammen med H. heilmannii
S.S., som kan påvirke resultatene, som har blitt beskrevet tidligere [19]. Derfor, for å oppnå bedre innsikt i patogenesen av human magesykdom assosiert med H. heilmannii
S.S., eksperimentelle infeksjonsstudier med rene kulturer av denne mikroorganismen er avgjørende. Derfor er målet med denne studien var å undersøke bakterien-vert interaksjoner av 9 H. heilmannii
S.S. stammer, isolert fra gastrisk mucosa av forskjellige katter. Den mongolske ørkenrotte-modellen har tidligere blitt vist å være et nyttig dyremodell for å studere Helicobacter
-relaterte gastrisk patologi hos mennesker og er derfor benyttet i den foreliggende undersøkelse [19-21].
Materiale og metoder
Bakteriell stammer
Ni stammer av H. heilmannii
ss ble hentet fra mageslimhinnen forskjellige katter og utpekt ASB1 (= type belastning, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 og ASB14. ble dyrket bakterier på bifasisk Brucella
agarplater (Oxoid, Basingstoke, UK) supplert med 20% (v /v) føtalt kalveserum (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /l amfotericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, inneholder 10 mg /l vancomycin, 5 mg /l laktat trimetoprim og 2500 U /L polymyxin B), Vitox supplement (Oxoid) og 0,05% HCl (pH 5). Etter inkubering i henhold microaerobic betingelser (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C), ble bakteriene høstet og sluttkonsentrasjonen ble justert til 7 x 10 8 levedyktige bakterier /ml, som bestemt ved telling i en Neubauer tellekammer for Dyr, bolig og eksperimentell prosedyre
Specific-patogen-fri (SPF) kvinnelige fem uker gamle mongolske ørkenrotte (CRL:. Man (Tum), n
= 48) ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Lille, Frankrike). Dyrene ble plassert i filter topp bur (1500 cm 2) på autoklaveres flis og autoklaveres høy. De ble foret ad libitum en autoklav kommersiell diett (TEKLAD 2018S, som inneholder 18% protein, Harlan, Nederland) og autoklaveres vann. For hver av de ni H. heilmannii
S.S. -stammer testet, 5 dyr ble inokulert intragastrisk 3 ganger i 2 dager intervall med 300 mL av en bakteriell suspensjon. Tre dyr ble inokulert med Brucella
buljong (pH 5, Oxoid) og tjente som negative kontroller. Inokulering ble utført under kortfattet isoflurananestesi (2,5%), ved hjelp av en kulespiss gavage nål. På 9 uker etter første inokulering ble dyrene avlivet ved cervikal dislokasjon etter dyp isoflurananestesi (5%). Magen og tolvfingertarmen av hver hamsteren ble resected og prøver ble tatt for histopatologisk undersøkelse og kvantitativ real-time (RT) -PCR analyse.
In vivo forsøket ble godkjent av etisk komité ved Fakultet for veterinærmedisin, Ghent University, Belgia (EC 2011/090).
Histopatologi og immunhistokjemi, En lengdesnitt, med start fra enden av forestomach og som omfatter antrum og fundus i magen og en del av tolvfingertarmen, ble kuttet langs større krumning og fiksert i 10% fosfatbuffret formalin, behandlet ved hjelp av standardmetoder og innstøpt i parafin for lysmikroskopi. Tre sammenhengende deler av 5 um ble kuttet. Etter deparaffinization og hydrering, ble varme-induserte antigen gjenfinning utføres i citrat-buffer (pH 6). For å blokkere endogen peroksidase-aktivitet og ikke-spesifikke reaksjoner, ble objektglass inkubert med 3% H 2o 2 i metanol (5 min) og 30% geiteserum (30 min), respektivt. Den første delen ble farget med hematoksylin /eosin (H & E) til å sette intensiteten av gastritt i henhold til oppdatert Sydney System [22], men med noen modifikasjoner, som tidligere beskrevet [19]. På den andre delen, ble epitelcelleproliferasjon bestemmes ved immunhistokjemisk farging bruke en mus monoklonalt anti-Ki67 antistoff (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgia). Ki67-positive epitelceller ble tellet i 5 tilfeldig valgt High Power Fields ved nivået for de gastriske groper (forstørrelse: 400 x), både i antrum og fundus. Gjennomsnittet av de positive celletall ble beregnet for hver forsøksgruppe i både mage regioner
parietalceller ble identifisert på den tredje seksjon ved immunhistokjemisk farging for hydrogen kalium-ATPase ved hjelp av et monoklonalt antistoff fra mus (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). Inkubasjon med primære antistoffer rettet mot Ki67 og hydrogen kalium ATPase ble etterfulgt av inkubasjon med et HRP-merket sekundært antistoff (Envision Link Mouse K4007, DakoCytomation, Heverlee, Belgia) for visualisering.
DNA-ekstraksjon og kvantifisering av kolon H. heilmannii
ss i magesekken og tolvfingertarmen
Fra hver ørkenrotte, ble prøver fra fundus og antrum i magen og tolvfingertarmen fra tatt. Vevsprøver ble lagret i 1 ml RNA senere (Ambion, Austin, TE, USA) ved -70 ° C inntil RNA- og DNA-ekstraksjon. Vevsprøver ble homogenisert (MagNALyser, Roche, Mannheim, Tyskland) og RNA og DNA ble separert ved hjelp TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Antallet kolon H. heilmannii
S.S. per mg gastrisk vev ble bestemt i DNA-prøvene ved hjelp av et H. heilmannii
S.S.-spesifikk kvantitativ RT-PCR. For generering av standarden, en del av ureAB
-genklusteret (1224 bp) fra H. heilmannii
S.S. ASB1 ble amplifisert ved anvendelse av primere U430F og U1735R, som tidligere beskrevet [6]. Standarden besto av 10-gangers-fortynninger som starter ved 10 8 PCR-amplikoner for hver 10 pl av reaksjonsblandingen. En mL av ekstrahert DNA-templat ble suspendert i en 10 ul reaksjonsblanding bestående av 0,25 mL av begge primerne som befinner seg innenfor 1224 bp-fragmentet, for å gi et 212 bp PCR-produkt (forstand primer: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', antisense-primer: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', glødetemperatur 58 ° C), 3,5 pl HPLC-vann og 5 ul SensiMix ™ SYBR No-ROX (Bioline Reagents Ltd. , UK). Begge standarder og prøver ble kjørt i duplikat på en CFX96 ™ RT-PCR System med en C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Bio-Rad CFX Manager (versjon 1.6) programvare ble benyttet for beregning av terskel sykluser (CT) -verdier og smeltekurve analyse av amplifisert DNA. De gjennomsnittlige verdier av duplikater ble anvendt for kvantifisering av H. heilmannii
S.S. DNA i vevsprøver.
RNA-fremstilling og genekspresjon
Total RNA, fra vevsprøver, ble renset ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Renheten av RNA ble demonstrert ved å måle forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm med Nanodrop som i alle tilfeller var omtrent 2. RNA-konsentrasjonen i hver prøve ble justert til 1 pg /pl og cDNA ble syntetisert RNA umiddelbart etter rensing ved anvendelse av iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Aliquoter av cDNA (1/5 fortynning) ble anvendt som et templat for kvantitativ RT-PCR for måling av genekspresjon. De mRNA ekspresjonsnivåer av forskjellige cytokiner (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ og TNF-α), gastrin og H + /K + ATPase ble kvantifisert. Renhold gener GAPDH, β-actin Kjøpe og hprt
ble inkludert som referanse gener. Primersekvensene er vist i tabell 1 [23-28]. For alle mål gener og referanse gener, primer effektiviteten var mellom 1,9 og 2,1. Reaksjonene ble utført i 10 mL volumer inneholder en ul cDNA, 0,05 mL av begge primere, 3,9 mL HPLC vann og 5 mL SensiMix ™ SYBR No-ROX. Den eksperimentelle protokollen for PCR-reaksjon (40 sykluser) ble utført på en CFX96 ™ RT-PCR System med en C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad): denaturering i 15 min ved 95 ° C, etterfulgt av amplifikasjons-cykler ved 95 ° C i 20 s, annealing ved 60 ° C i 30 s og forlengelse ved 73 ° C i 30 sek. Kontrollreaksjoner uten revers transkriptase trinnet ble gjennomført for å utelukke DNA-kontaminering av RNA prøver. No-templat-kontrollreaksjonsblandinger ble inkludert og alle prøvene ble kjørt i duplikat. CT-verdiene ble normalisert til det geometriske gjennomsnittet av CT-verdier fra de 3 referanse gener, etter som normaliserte mRNA nivåer ble beregnet på grunnlag av 2 -ΔΔCt metoden [29] .table 1 Primer par.
Primere
Sequence (5 '→ 3')
Cytokiner
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL- 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
Gastrin
Gastrin FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
Gastrin RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( parietalceller)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
Referanse gener
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-aktin FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
β-aktin RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Primerpar brukes for å måle mRNA-ekspresjonsnivåene av IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-y, TNF-a, gastrin og H + /K + ATPase er vist. Renhold gener GAPDH, β-actin Kjøpe og hprt
ble inkludert som referanse gener.
Statistisk analyse
Normalitet og avvik homogenitet av data ble analysert ved hjelp av Shapiro-Wilk normalitet test og Levene test for homogenitet av avvik. Gastritt score, kolonisering kapasitet og ATPase og gastrin genuttrykk ble sammenlignet mellom ulike infiserte grupper og kontroller ved hjelp Kruskall-Wallis analyse, etterfulgt av en Mann-Whitney U
test. Cytokin ekspresjon og antallet Ki67-positive celler ble analysert ved variansanalyse med en Bonferroni post hoc test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på p
≤ 0,05. SPSS statistikk 21 software (IBM) ble brukt for alle analyser.
Resultater
Infeksjon med virulente H. heilmannii
S.S. stammer induserer en antrum dominerende kronisk aktiv gastritt
magen av alle kontrolldyrene viste en normal histomorphology (Figur 1a). Betennelse i magen av ørkenrotte infisert med H. heilmannii
S.S. stammer ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14 var preget av en kronisk aktiv gastritt med dannelsen av lymfatisk aggregater i lamina propria og submucosa av antrum av magen (Figur 1b). Den slimhinnetykkelse ble litt økt og bare få nøytrofile ble oppdaget. I kontrast, H. heilmannii
S.S. stammer ASB7 og ASB9 forårsaket ikke eksplisitt antral betennelse og bare en svak økning i lymfatisk celleantall ble observert i lamina propria i antrum i magesekken (figur 1c). I alle H. heilmannii
S.S.-infiserte ørkenrotte, ble bare begrenset tegn på betennelse detektert i fundus i magesekken (Tilleggs fil 1). De antrum inflammasjon score av hvert enkelt dyr er vist i figur 2d. En statistisk signifikant forskjell mellom betennelse score for ørkenrotte inokulert med ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14 sammenlignet med kontrollgruppen ble demonstrert (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05, Figur 2d). Figur 1 H & E farging av antrum av en gerbil mage. Normal histologi av antrum av en falsk-inokulert negativ kontroll dyr (a). Eksplisitt lymfatisk infiltrasjon av lamina propria og submucosa med dannelse av lymfoide follikler (piler) i antrum av en gerbil inokulert med H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Milde til fraværende lymfocyttinfiltrasjon (piler) i lamina propria i antrum av en gerbil inokulert med H. heilmannii
S.S. ASB7 (c). Bar = 30 mikrometer Figur 2 Colonization kapasitet.
H. heilmannii S.S. stammer og mage betennelse stillingen etter eksperimentell infeksjon. Colonization kapasitet vises som log10 verdier av H. heilmannii
S.S. bakterier pr mg vev, detektert med kvantitativ RT-PCR i fundus (a) og antrum (c) i magesekken og tolvfingertarmen (b). Resultatene under deteksjonsgrensen (log 2,39 bakterier per mg vev) ble satt som 0. Antral betennelse (d) ble scoret på en skala fra 0 til 4 (0: ingen infiltrasjon med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler; 1: mild diffus infiltrasjon med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler eller tilstedeværelsen av en liten (50-200 celler) summen av inflammatoriske celler, 2: moderat diffus infiltrering med mononukleær og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelse av 2-4 inflammatoriske pellets; 3: merket diffus infiltrering med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller nærværet av minst fem inflammatoriske aggregater, 4: diffus infiltrering av store regioner med store aggregater av mononukleære og /eller polymorfonukleære celler) .Individual ørkenrotter er vist som tall rundt gjennomsnittet ( linjer). Statistiske signifikante forskjeller sammenlignet med kontrolldyrene, er angitt med * (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05)
kolonisering kapasitet av H. heilmannii
S.S.. stammer i magen og tolvfingertarm
Påvisning av H. heilmannii
S.S. DNA med kvantitativ RT-PCR på 9 uker etter infeksjon viste høyt nivå kolonisering av ASB1, ASB2, ASB3 og ASB6 i magen (figur 2a-c). I motsetning til kolonisering av ASB7, ASB11, ASB13 og ASB14 var mer begrenset så lenge ASB9 ikke ble påvist i magesekken (figur 2a-c). Generelt, koloniser kapasitet i fundus (figur 2a) var lavere enn i antrum (figur 2c) for alle stammene som ble testet, og den laveste antall bakterier ble påvist i tolvfingertarmen (figur 2b). I tillegg ble det en klar sammenheng sett mellom kolonisering kapasiteten på H. heilmannii
S.S. stammer og mage betennelse score i antrum av magen (figur 2c-d) Virulent H..
heilmannii
S.S. stammer forårsake gastrisk antrum epitelcelleproliferasjon
Resultater av gastrisk epitelcelleproliferasjon scoring i antrum i magen er vist i figur 3c. Betydelig høyere antall Ki67-positive prolifererende epitelceller ble sett i antrum av ASB1- og ASB6-infisert ørkenrotte, sammenlignet med kontrollgruppen (ANOVA, p
< 0,05, figur 3a-b). Antall Ki67-positive celler ble moderat økt i ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- og ASB14-infiserte ørkenrotte, selv om det ikke er statistisk signifikant. H. heilmannii
S.S. stammer ASB7 og ASB9 ikke føre til en økning av gastrisk epitelcelleproliferasjon. I tillegg ble signifikant høyere antall prolifererende epitelceller demonstrert i antrum av ASB1-, ASB2-, og ASB6-infisert ørkenrotte, sammenlignet med ørkenrotte infisert med ASB7 og ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figur 3 gastrisk antrum epitelcelleproliferasjon. Ki67 farging av antrum av en hamster inokulert med H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) viser et høyere antall prolifererende epitelceller i forhold til en falsk-inokulert negativ kontroll dyr (a). Frekvensen av epitelcelleproliferasjon ble bestemt ved telling Ki67-positive epitel-celler i 5 tilfeldig valgt High Power Fields ved nivået for de gastriske groper (forstørrelse: 400 x) i antrum av ørkenrotte magesekken (c). De gjennomsnittlige antall Ki67-positive celler er vist på hver forsøksgruppe. Signifikante forskjeller mellom H. heilmannii
S.S.-vaksinert og kontrolldyrene er angitt med * (ANOVA, p
< 0,05). Signifikante forskjeller i sammenligning med ASB7 og ASB9 vaksinert grupper er angitt med henholdsvis + og # (ANOVA, p
< 0,05).
I fundus av alt H. heilmannii
SS-smittet ørkenrotte, epiteliale celleproliferasjon sats var ikke signifikant høyere sammenlignet med kontrolldyrene (Tilleggs fil 2).
cytokin genuttrykk i magen som svar på H. heilmannii
ss infeksjon
lokale vertens immunrespons mot H. heilmannii
S.S. infeksjon ble karakterisert ved måling av mRNA-ekspresjonsnivået av IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 og TNF-α i magen av ørkenrotte. Resultatene er vist i tabell 2 og i figur 4.Table 2. Statistisk analyse av mRNA-ekspresjonsnivåer.
antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPase
Gastrin
Mean Ct-Ctrefa
p-valueB
Mean Ct-Ctref
p-verdi
Mean Ct-Ctref
p-verdi
Mean Ct-Ctref
p-verdi
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1,000
3,70 ± 2,11 *
0,050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8.15 ± 1.26
1,000
2.42 ± 5.01
0,513
5,94 ± 2,49 *
0,050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1,000
3,49 ± 2,28 *
0,050
7.71 ± 1.17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1,000
2,23 ± 1,99 *
0,050
5,33 ± 2,39 *
0,025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7.98 ± 0.52
1,000
0,45 ± 2,51
0,724
7.12 ± 1.54
0.180
ASB9
9.03 ± 2.54
1,000
8,55 ± 0,71
1,000
0,79 ± 0,03
0,564
8.11 ± 1.58
1,000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 *
0,004
1.32 ± 1.45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ± 0,34
0,083
8.10 ± 0.93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1,000
3,81 ± 3,11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881
negativ kontroll
9.71 ± 1.13 -
7,08 ± 0,65 -
0.15 ± 1.82 -
8,70 ± 0,62 -
Vist er den statistiske analyse av IL-1β, IFN-γ og H + /K + ATPase-mRNA-ekspresjon i antrum og gastrin mRNA-ekspresjon i fundus av ørkenrotte magen på 9 uker etter eksperimentell infeksjon. Cytokin ekspresjon ble analysert ved variansanalyse med en Bonferroni post hoc test. H + /K + ATPase og gastrin-genekspresjon ble sammenlignet mellom de forskjellige infiserte grupper og kontroller ved bruk av Kruskall-Wallis analyse, etterfulgt av en Mann-Whitney U-test
. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på p
≤ 0,05. SPSS statistikk 21 software (IBM) ble brukt for alle analyser
en Mean Ct-Ctref. For hver forsøksgruppe, er gjennomsnittet av de normaliserte Ct-verdier ± standardavvik vist
bp
-verdi. : den eksakte p
-verdier er gitt product: * statistisk signifikante forskjeller i forhold til infisert kontrollgruppen (p
≤ 0,05)
Figur 4 mRNA uttrykk nivåer av cytokiner IL-1β og IFN.. y i antrum i magen. Cytokin-mRNA-ekspresjonsnivåer i fundus og antrum i magesekken ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR. Uttrykket nivåer av IL-1β (a) og IFN-γ (b) i antrum er vist. Data er presentert som det gangers forandring i gen-ekspresjon normalisert til 3 referanse gener og i forhold til den negative kontrollgruppe som regnes som 1. Data er vist som middel + standardavvik. Signifikante forskjeller i uttrykket nivå mellom inokulerte grupper og negativ kontrollgruppe er angitt med * p
< 0,05 (ANOVA).
Pro-inflammatoriske cytokin IL-1β er en potent inhibitor av magesyresekresjon [30] og spiller en rolle i den akutte fase av inflammasjon [31]. Uttrykk av IL-1β ble oppregulert i antrum i magen av ørkenrotte infisert med H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14, sammenlignet med de negative kontrolldyrene (figur 4a). For ørkenrotter inokulert med ASB7 og ASB9, uten oppregulering av IL-1β ble sett.
Th1 cytokin IFN-γ, en signatur markør av Th1-polariserte reaksjon [24, 32], oppviste en redusert ekspresjon i antrum av ørkenrotter infisert med ASB11 og ASB13 (figur 4b), sammenlignet med kontrolldyrene.
Ingen signifikante forskjeller i ekspresjon mellom infiserte og sham-inokulert ørkenrotter ble observert for IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 og TNF-α.
parietalcellen H + /K + ATPase mRNA uttrykk er nedregulert i respons til kolonisering med H. heilmannii
ss
Ingen klare tap av parietalceller kan være visualisert ved immunhistokjemisk farging i fundus og antrum av H. heilmannii
SS-infisert ørkenrotter i forhold til de uinfiserte kontroller (data ikke vist). Imidlertid, kvantitativ RT-PCR viste en klar nedgang i ekspresjon av gastrisk H + /K + ATPase i antrum av ørkenrotte infisert med ASB1, ASB3 og ASB6 (figur 5 og tabell 2). I forhold til kontrolldyrene med mRNA ekspresjonsnivåer satt til 1,0, den midlere relative uttrykk var 0,09 ± 2,11 for ASB1-, 0,10 ± 2,28 for ASB3- og 0,24 ± 1,99 for ASB6-infiserte ørkenrotte, respektivt. Ingen signifikant endring i uttrykket ble sett i fundus av H. heilmannii
S.S.-infiserte ørkenrotte. Figur 5 mRNA ekspresjonsnivå av H + /K + ATPase i antrum i magen. Hydrogen kalium-ATPase-mRNA-ekspresjon nivå i magen ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR. H + /K + ATPase-mRNA-ekspresjon nivå i antrum er vist. Data er presentert som det gangers forandring i gen-ekspresjon normalisert til 3 referanse gener og i forhold til den negative kontrollgruppe som regnes som 1. Data er vist som middel + standardavvik. Signifikante forskjeller i uttrykket nivå mellom inokulerte grupper og negativ kontrollgruppe er angitt med * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Virulent H. heilmannii
S.S. stammer indusere økt gastrin uttrykk i fundus
peptid hormon gastrin stimulerer utskillelsen av magesyre ved parietalceller. En forstyrrelse i sin ekspresjon kan føre til hypergastrinemi. Ekspresjonen av gastrin var sterkt oppregulert i fundus av ørkenrotte infisert med ASB2 og ASB6 på 9 uker etter infeksjon (figur 6 og tabell 2). Sammenlignet med kontrolldyr, den midlere relative uttrykk var 6,79 ± 2,49 for ASB2- og 10,35 ± 2,39 for ASB6-infiserte ørkenrotte. I antrum i magen, noe oppregulering av gastrin ekspresjon ble påvist. Figur 6 mRNA ekspresjonsnivå av gastrin i fundus i magen. Gastrin mRNA ekspresjonsnivå i magesekken ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR. Vist er uttrykket nivå i fundus. Data er presentert som det gangers forandring i gen-ekspresjon normalisert til 3 referanse gener og i forhold til den negative kontrollgruppe som regnes som 1. Data er vist som middel + standardavvik. Signifikante forskjeller i uttrykket nivå mellom inokulerte grupper og negativ kontrollgruppe er angitt med * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Diskusjon
På 9 uker etter vaksinasjon, en kronisk aktiv gastritt i antrum av magen ble observert hos ørkenrotter eksperimentelt infisert med 7 av 9 H. heilmannii
ss stammene som ble testet i denne studien (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14). Lamina propria og submucosa ble massivt infiltrert med lymfocytter, noe som resulterer i dannelsen av lymfoide follikler. Den H. heilmannii
S.S. stammer ble hovedsakelig påvist i antrum, og i mindre grad i fundus og tolvfingertarmen. Hos mennesker infisert med NHPh, kolonisering og betennelse også forekommer hovedsakelig i antrum i magen [5, 33-35]. Dette bekrefter at mongolske ørkenrotte er en passende modell for å studere H. heilmannii
S.S. infeksjoner hos mennesker, som har også vist seg for H. suis product: [19] og H. pylori product: [20, 21]. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Genome sekvensanalyse av Helicobacter pylori stammer assosiert med magesår og mage cancer
• Antimikrobiell aktivitet, akutt giftighet og cytoprotective effekten av Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore trekke ut i en rotte etanol-HCl magesår model