Разнообразие в бактерии-хозяине взаимодействий в пределах вида Helicobacter heilmannii в буквальном смысле слова

Разнообразие в бактерии-хозяине взаимодействий внутри вида Helicobacter heilmannii

в буквальном смысле Аннотация
хеликобактер (H.) heilmannii
в буквальном смысле (сс) является зоонозных бактерия, которая, естественно, колонизирует желудок собак и кошек , В организме человека этот микроорганизм был связан с гастритом, язвенной болезни и слизистая оболочка ассоциированной лимфоидной ткани (MALT) лимфома. Имеется мало информации о патогенезе H. heilmannii
S.S. инфекции в организме человека, и неизвестно, существуют ли различия в вирулентности в пределах этого вида. Таким образом, монгольская модель песчанки была использована для изучения Бактерия-хозяин взаимодействий 9 H. heilmannii
S.S. штаммы. Колонизация способность штаммов, интенсивность экспрессии гастрита и генов различных воспалительных цитокинов в желудке определяли через 9 недель после экспериментальной инфекции. Индукция антрального-доминантному хронического активного гастрита с образованием агрегатов лимфоцитарными было показано 7 штаммов. Высокого уровня антрального колонизация был замечен на 4 штаммов, в то время как колонизация 4 других штаммов был более ограничен, и один штамм не был обнаружен в желудке в возрасте 9 недель после инфицирования. Все штаммы, вызывающие хронический активный гастрит вызвало повышающей регуляции провоспалительных цитокинов IL-1 в антральном. Уменьшенный антральных выражение Н + /К + АТФазы наблюдалась в желудке после инфекции с 3-х сильно колонизирующих штаммов и 2 высоко колонизирующих штаммов вызвало повышенную экспрессию гастрина в глазном дне. Ни в одном из H. heilmannii
S.S.-инфицированных групп, ИФН-γ экспрессия была повышающей регуляции. Это исследование демонстрирует разнообразие в бактерию-хозяин взаимодействий в пределах вида H. heilmannii
S.S. и что патогенез желудочных инфекций с этим микроорганизмом не идентичен Г.пилори
инфекции.
Введение
Helicobacter (H.) пилори
является наиболее распространенным хеликобактером
видов колонизировать слизистую оболочку желудка человека и был связан с гастритом, язвенной болезни и рака желудка [1-3]. Кроме того, H. Pylori,
другой морфологически различимого не-H. Хеликобактерная
(NHPh) видов, также упоминается как H. heilmannii
Sensu Лато (S.L.) [4], были связаны с заболеванием желудка у людей [5-10]. NHPh представляет собой группу тесно связанных, но различных видов бактерий, в основном встречаются у разных видов животных, таких как Г.фелис ​​
, Х. Salomonis
Х. bizzozeronii
, Г. heilmannii
в буквальном смысле слова (сс), Х. cynogastricus
и H. baculiformis
у кошек и собак и H. суис
у свиней [5, 7, 10-15]. Эти микроорганизмы характеризуются чрезвычайно привередливый характер, что до сих пор привело к ограниченному числу в пробирке изолирует доступны по всему миру.
H. heilmannii
S.S. только недавно был выделен и культивировали в пробирке [16]. Он был обнаружен у диких кошачьих и в желудочных биопсий человека, но наиболее часто встречается в слизистой оболочке желудка кошек и собак с преобладанием в диапазоне от 20 до 100% [5-7, 10, 12]. Хотя эта бактерия была связана с хроническим активным гастритом у кошек и собак [12], его патогенные значение остается загадочным и, вероятно, процедите-зависимой. У людей, H. heilmannii
S.S. был обнаружен в 8-19% желудочных биопсий с гистологическим доказательством NHPh инфекции [5, 8, 10]. Заражение этой бактерии в организме человека была связана с гастритом, язвенной болезнью и слизистой лимфоидной ткани (MALT) лимфома [5, 8, 10, 17, 18].
Несколько исследований инфицирования в экспериментальных моделях на животных были выполнены, чтобы исследовать патогенез H. Pylori
инфекций у людей. В отличие от этого, имеется мало информации дело с патогенеза H. heilmannii
S.S. инфекции в организме человека. Эта бактерия распространяется на мышах в течение 28 месяцев и был в состоянии вызвать лимфому MALT в желудках этих животных [18]. Однако в этом эксперименте мыши, гомогенизированной ткани желудка, использовали в качестве посевного материала. Это означает, что другие микроорганизмы были привиты вместе с Х. heilmannii
S.S., которые могли бы повлиять на результаты, как было описано ранее [19]. Таким образом, чтобы получить более полное представление о патогенезе болезни желудка человека, ассоциированной с Н. heilmannii
S.S., экспериментальные исследования инфекции с чистыми культурами этого микроорганизма являются существенными. Таким образом, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить бактерия-хозяин взаимодействий 9 H. heilmannii
S.S. штаммы, выделенные из слизистой оболочки желудка разных кошек. Монгольская модель песчанки Ранее было показано, чтобы быть полезной моделью животных для изучения Helicobacter
желудка патологии о связанных у людей и поэтому используется в настоящем исследовании [19-21].
Материалы и методы Бактериальные
штаммы
Девять штаммов H. heilmannii
сс были получены из слизистой оболочки желудка различных кошек и обозначали ASB1 (= тип штамма, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 и ASB14. Бактерии культивировали на двухфазных Brucella
чашках с агаром (Oxoid, Basingstoke, Великобритания), дополненной 20% (об /об) фетальной сыворотки теленка (HyClone, Logan, UT, USA), 5 мг /л амфотерицин В (Fungizone, Brystal -Myers Сквибб, Нью-Йорк, США), Скирроу (Oxoid, содержит 10 мг /л ванкомицина, 5 мг /л триметоприм лактат и 2500 Ед /л полимиксин В), Vitox добавка (Oxoid) и 0,05% раствор HCl (рН 5). После инкубации в условиях микроаэробных (85% N <к югу> 2, 10% CO <суб> 2, 5% O <суб> 2; 37 ° С), бактерии собирали, и конечная концентрация доводили до 7 × 10 8 жизнеспособных бактерий /мл, как определено путем подсчета в счетной камере Neubauer
животных, жилье и экспериментальная процедура
Specific-патогена (SPF) женские пять-недельных монгольских песчанок (CRL:. MON (Тум), п
= 48) были получены из Charles River Laboratories (Лилль, Франция). Животных помещали в фильтр верхних клетках (1500 см 2) на автоклавного стружек и автоклавного сена. Кормили вволю с автоклавного коммерческой диеты (Teklad 2018S, содержащий 18% белка; Харлан, Нидерланды) и автоклавного воды. Для каждого из 9 H. heilmannii
S.S. штаммов, 5 животных внутрижелудочно засевают 3 раза через 2 дня интервала с 300 мкл бактериальной суспензии. У трех животных были привиты с Brucella
бульоне (рН 5, Oxoid) и служили в качестве отрицательного контроля. Прививка была выполнена под неглубоким изофлуран анестезией (2,5%), с использованием шаровой наконечником иглы через зонд. Через 9 недель после первой иммунизации животные были умерщвлены шейным вывихом при глубокой анестезии изофлуран (5%). Желудка и двенадцатиперстной кишки каждого песчанки резецировали и образцы были взяты для гистопатологического исследования и количественного в режиме реального времени (RT) анализ -PCR.
Эксперимент в естественных условиях был одобрен Комитетом по этике факультета ветеринарной медицины, Гента по университет, Бельгия (ЕС 2011/090).
гистопатологии и иммуногистохимии
представлен продольный разрез, начиная с конца forestomach и включающий антральном и дна желудка и части двенадцатиперстной кишки, разрезали вдоль большой кривизны и фиксировали в 10% формалине с фосфатным буфером, обрабатываются с помощью стандартных методов и заливали в парафин для световой микроскопии. Три последовательных секций 5 мкм были вырезаны. После депарафинизации и гидратации, поиска антигена зной индуцированный проводили в цитратном буфере (рН 6). Для того, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы и неспецифические реакции, предметные стекла инкубировали с 3% H <югу> 2O <подразделам> 2 в метаноле (5 мин) и 30% сыворотки козьего (30 мин), соответственно. Первый раздел окрашивали гематоксилином /эозином (H &Amp; E), чтобы набрать интенсивность гастрита в соответствии с обновленной системой Сиднея [22], но с некоторыми изменениями, как описано ранее [19]. На втором участке, пролиферацию эпителиальных клеток определяли с помощью иммуногистохимического окрашивания с использованием мышиных моноклональных анти-Ki67 антитела (1/25; МЕНАРИНИ диагностика, Завентем, Бельгия). Ki67-позитивные эпителиальные клетки подсчитывали в 5 случайным образом выбранных полей высокой мощности на уровне желудочных ямок (увеличение: 400 ×), как в антральном и глазного дна. Среднее значение положительного числа клеток рассчитывали для каждой экспериментальной группы в обеих областях желудка
париетальной клетки были идентифицированы на третьем участке путем иммуногистохимического окрашивания для калия водорода АТФазные с использованием мышиного моноклонального антитела (1/200;. Abcam Ltd, Кембридж, Великобритания). Инкубация с первичными антителами, направленными против Ki67 и гидрокарбонат калия АТФазы с последующей инкубацией с HRP-меченым вторичным антителом (Энвижн Ссылка мыши K4007, DakoCytomation, Heverlee, Бельгия) для визуализации.
Экстракции ДНК и количественно оценить колонизацию H. heilmannii
сс в желудке и двенадцатиперстной кишке
Из каждого песчанки, были взяты пробы из глазного дна и антрального отдела желудка и двенадцатиперстной кишки с. Образцы ткани хранили в 1 мл РНК позже (Ambion, Austin, TE, США) при -70 ° С до тех пор, РНК- и ДНК-экстракции. Образцы тканей гомогенизируют (MagNALyser, Roche, Mannheim, Германия) и РНК и ДНК разделяли с помощью TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Цинциннати, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Число колонизацию H. heilmannii
S.S. на мг желудочной ткани определяли в образцах ДНК с использованием H. heilmannii
S.S. специфичного количественного RT-PCR. Для генерации стандарта, который является частью ureAB
кластера генов (1224 пар оснований) от H. heilmannii
S.S. ASB1 амплифицировали с использованием праймеров U430F и U1735R, как описано ранее [6]. Стандарт состоял из 10-Fold-разведениях, начиная с 10 8 ПЦР ампликонов на каждые 10 мкл реакционной смеси. Один мкл экстрагированной ДНК-матрицы, суспендировали в 10 мкл реакционной смеси, состоящей из 0,25 мкл обоих праймеров, расположенных в пределах п.о. 1224, с получением 212 п.н. продукта ПЦР (смысловой праймер: HH_SP1: 5'-СТТ ТСТ ССТ ГГТ GAA GTG АТТ СТС-3 ', антисмысловой праймер: HH_RVQ: 5'-GCT GTA ССА ГАГ ВКА АТГ ТСС AAG-3', температура отжига 58 ° С), 3,5 мкл воды ВЭЖХ и 5 мкл SensiMix ™ SYBR Нет-ROX (БИОЛАЙН Реактивы Ltd , ВЕЛИКОБРИТАНИЯ). Оба стандарта и образцы были проведены в двух экземплярах на системе CFX96 ™ RT-PCR с Термоциклер C1000 (Bio-Rad, Hercules CA, США). (Версия 1.6) программного обеспечения Bio-Rad CFX менеджер был использован для расчета пороговых циклов (Ct) -значения и анализ кривой плавления амплифицированной ДНК. Средние значения дублей были использованы для количественного определения H. heilmannii
S.S. ДНК в образцах ткани.
Препарате РНК и экспрессии генов
Суммарную РНК из образцов ткани, очищали с помощью RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия), в соответствии с инструкциями изготовителя. Чистоту РНК была продемонстрирована путем измерения отношения оптической плотности при 260 нм и 280 нм с NanoDrop, который во всех случаях приблизительно 2. Концентрацию РНК в каждом образце доводили до 1 мкг /мкл и кДНК синтезировали сразу после очистки РНК с использованием iScript ™ Синтез кДНК Kit (Bio-Rad). Аликвоты кДНК (1/5 разведение) использовали в качестве матрицы для количественного RT-PCR для измерения экспрессии гена. Уровни экспрессии мРНК различных цитокинов (IL-1 β, IL-5, IL-6, ИЛ-10, ИЛ-12р40, ИЛ-17, ИФН-γ и TNF-α), гастрин и Н + /К + АТФазы количественно. В ведение домашнего хозяйства гены GAPDH, β-актина
и HPRT
были включены в качестве эталонных генов. Последовательности праймеров приведены в таблице 1 [23-28]. Для всех генов-мишеней и эталонных генов, к.п.д. праймеров были между 1,9 и 2,1. Реакции проводили в 10 мкл объемы, содержащие 1 мкл кДНК, 0,05 мкл обоих праймеров, 3,9 мкл ВЭЖХ воды и 5 мкл SensiMix ™ SYBR No-ROX. Экспериментальный протокол для реакции ПЦР (40 циклов) проводили на RT-PCR System CFX96 ™ с Термоциклер C1000 (Bio-Rad): денатурация в течение 15 мин при 95 ° С, с последующим циклов амплификации при 95 ° С в течение 20 с, отжиг при 60 ° С в течение 30 секунд и удлинение при 73 ° С в течение 30 с. Контрольные реакции без стадии обратной транскриптазы были реализованы, чтобы исключить загрязнение ДНК из образцов РНК. No-шаблон контроля реакционные смеси были включены и все образцы в дубликате. CT-значения были нормированы на среднее геометрическое Ct-значения из эталонных генов 3, после чего нормированные уровни мРНК были рассчитаны с использованием 2 -ΔΔCt метод [29] .table 1 пар праймеров.

Грунтовки

Последовательность (5 '→ 3')

Цитокины
IL-1β FW23
GGC AGG TGG ТАТ CGC TCA TC
IL- 1β RV23
CAC СТТ GGA GAC ТТТ TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GAG GGA ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
НКУ ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
ГГТ ТГК CAA НКУ TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12р40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12р40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT ТГК TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GAA GTA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC GTC CCA GAA GGC G
TNF-alpha RV23
СТТ GGT GGT TGG GTA CGA CA
гастрин
гастрин FW25
ССАГПЗ CTG GAA CCG CAA CA
гастрин RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + АТФазы ( париетальные клетки)
ATP4b FW
GGG ГГТ AAC СТТ Gag ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC СТТ ТСС GAC GTG CAG
справочнике генов
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
Результаты CTC ATG GAC TGA ТТА TGG ACA G
HPRT RV27
Результаты AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-актина FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
β-актина RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
пар праймеров для измерения уровни экспрессии мРНК IL-1 β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-gamma, TNF-a, гастрина и Н + /К + АТФазы показаны. В ведение домашнего хозяйства гены GAPDH, β-актина
и HPRT
были включены в качестве эталонных генов.
Статистический анализ
нормальности и дисперсия гомогенность данных были проанализированы с помощью критерия нормальности Шапиро-Wilk и тест Levene по однородности дисперсий. Гастрит баллов, емкость колонизация и экспрессия АТФазы и гена гастрина сравнивали между различными зараженными группами и управления с использованием анализа Крускала-Уоллиса, сопровождаемый Mann-Whitney U
тест. выражение цитокина и число Ki67-позитивных клеток анализировали с помощью дисперсионного анализа с Постфактум теста Бонферрони. Различия считались статистически значимыми при р ≤ 0,05
. SPSS Statistics 21 программного обеспечения (IBM) использовали для всех анализов.
Результаты
Заражение вирулентными H. heilmannii
S.S. штаммы индуцирует Антрум-доминантному хронический активный гастрит желудка
всех контрольных животных показали нормальную histomorphology (рис 1а). Воспаление в желудке песчанок, инфицированных H. heilmannii
S.S. штаммы ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 и ASB14 был отмечен активным хроническим гастритом с образованием лимфоцитарных агрегатов в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой антрального отдела желудка (рис 1b). Толщина слизистой была немного увеличена и были обнаружены лишь немногие нейтрофилы. В противоположность этому, H. heilmannii
S.S. штаммы ASB7 и ASB9 не вызывали явного антрального воспаление и лишь умеренное увеличение числа клеток лимфоцитарного наблюдалось в собственной пластинке слизистой оболочки антрального отдела желудка (рис 1в). Во всех Х. heilmannii
S.S.-инфицированные песчанки, лишь ограниченные признаки воспаления были обнаружены в глазном дне желудка (дополнительный файл 1). Антральном воспаление оценки каждого отдельного животного, показаны на рис 2d. Статистически значимая разница между воспалением баллов для песчанок, привитых ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 и ASB14 по сравнению с контрольной группой была продемонстрирована (Манна-Уитни U
тест, р
&л; 0,05, рис 2d). Рисунок 1 H &Amp; E окрашивание антрума желудка песчанки. Нормальная гистологию антральном из фиктивный привитой отрицательным контрольным животным (а). Явное лимфоцитарная инфильтрация собственной пластинки и Подслизистой с образованием лимфоидных фолликулов (стрелки) в антральном из песчанки, привитых с Х. heilmannii
S.S. ASB1 (б). Мягкий отсутствовать лимфоцитарной инфильтрацией (стрелки) в собственной пластинке слизистой оболочки в антральном из песчанки, привитых с H. heilmannii
S.S. ASB7 (с). Bar = 30 мкм.
Рисунок 2 Колонизация емкость H. heilmannii S.S. штаммы и желудка оценка воспаление после экспериментальной инфекции. емкость Колонизация показана как log10 значений H. heilmannii
S.S. бактерии на мг ткани, обнаруженные с количественной ОТ-ПЦР в глазном дне (а) и антральном (с), желудка и двенадцатиперстной кишки (б). Результаты ниже предела обнаружения (2,39 войти бактерий на мг ткани) были установлены в 0. Антраль воспаление (d) оценивали по шкале от 0 до 4 (0: нет инфильтрации с одноядерных и /или полиморфноядерных клеток; 1: легкая диффузная инфильтрация мононуклеарных и /или полиморфно-клетки или наличие одного небольшого (50-200 клеток) совокупность воспалительных клеток; 2: умеренное диффузная инфильтрация с одноядерных и /или полиморфно-клеток и /или при наличии 2-4 воспалительными агрегатов; 3: отмеченные диффузная инфильтрация мононуклеарных и /или полиморфно-клеток и /или в присутствии по меньшей мере пяти воспалительных агрегатов; 4: диффузная инфильтрация больших областей с большими агрегатами мононуклеарных и /или полиморфно-ядерных клеток) .Individual песчанки изображены в виде фигуры вокруг среднего ( линии). Статистически значимых различий по сравнению с контрольными животными, обозначены * (Манна-Уитни U
тест, р
≪ 0,05)
Колонизация емкость Х. heilmannii
S.S.. штаммов в желудке и двенадцатиперстной кишке
Обнаружение H. heilmannii
S.S. ДНК с количественной ОТ-ПЦР в 9 недель после инфицирования показало высокий уровень колонизации ASB1, ASB2, ASB3 и ASB6 в желудке (рис 2а-с). В противоположность этому, колонизация ASB7, ASB11, ASB13 и ASB14 был более ограничен, в то время как ASB9 не была обнаружена в желудке (рис 2а-с). В целом, емкость колонизация в глазном дне (рис 2а) была ниже, чем в антральном (фиг.2с) для всех тестируемых штаммов и наименьшее количество бактерий было обнаружено в двенадцатиперстной кишке (рис 2b). Кроме того, четкая связь была замечена между колонизацией мощности из H. heilmannii
S.S. Штаммы и желудочные оценки воспаления в полости желудка (рис 2c-d).
Virulent H. heilmannii
S.S. штаммы вызывают антрального отдела желудка пролиферации эпителиальных клеток
Результаты эпителия желудка скоринг пролиферации клеток в полости желудка показаны на рисунке 3в. Значительно более высокие числа Ki67-положительных пролиферирующих клеток эпителия наблюдались в антральном из ASB1- и ASB6-инфицированных песчанок, по сравнению с контрольной группой (ANOVA, р &
ЛТ; 0,05, 3, а-б). Число Ki67-позитивных клеток были умеренно увеличились в ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- и ASB14-инфицированных песчанок, хотя и не является статистически значимым. H. heilmannii
S.S. штаммы ASB7 и ASB9 не приводит к увеличению желудочного пролиферации эпителиальных клеток. Кроме того, значительно более высокие числа пролиферирующих эпителиальных клеток были продемонстрированы в антральном из ASB1-, ASB2- и ASB6-инфицированных песчанок, по сравнению с песчанок, инфицированных ASB7 и ASB9 (ANOVA, р
&ЛТ; 0,05). Рисунок 3 Желудочный антральная пролиферации эпителиальных клеток. Ki67 окрашивание антральном из песчанки, привитых с H. heilmannii
S.S. ASB1 (б), показывающий высокое число пролиферирующих эпителиальных клеток, по сравнению с мнимым засевают отрицательным контрольным животным (а). Скорость пролиферации эпителиальных клеток определяли путем подсчета Ki67-позитивных эпителиальных клеток в 5 произвольно выбранных полей высокой мощности на уровне желудочных ямок (увеличение: 400-кратное увеличение) в полости желудка песчанки (с). Среднее количество Ki67-положительных клеток, показаны в каждой экспериментальной группе. Значительные различия между H. heilmannii
S.S.-прививали и контрольные животные обозначены * (ANOVA, р
&ЛТ; 0,05). Значительные различия по сравнению с ASB7 и ASB9 засевают групп обозначены + и # соответственно (ANOVA, р
< 0,05).
В глазном дне всех H. heilmannii
SS-инфицированных песчанки, эпителиальный скорость пролиферации клеток не была значительно выше по сравнению с контрольными животными (Дополнительный файл 2). экспрессия гена
цитокина в желудке в ответ на H. heilmannii
SS Инфекция
Местная иммунного ответа хозяина к H. heilmannii
S.S. Инфекция характеризуется измерением уровня экспрессии мРНК IFN-gamma, IL-1, IL-5, IL-6, ИЛ-10, ИЛ-12р40, IL-17 и TNF-a в желудке песчанок. Результаты приведены в таблице 2 и на рисунке 2 4.Table статистического анализа уровней экспрессии мРНК.


Антрум


Fundus


IL-1β


IFN-γ


H + /K + АТФазу


гастрин



Mean Ct-Ctrefa

р-

VALUE млрд Среднее Ct-Ctref

р-значение

Среднее Ct-Ctref

р-значение

Среднее Ct-Ctref

р-значение

ASB1
6,92 ± 0,29 * 0,031

6,87 ± 0,60
1.000
3,70 ± 2,11 * 0,050

7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8,15 ± 1,26
1.000
2,42 ± 5,01
0,513
5,94 ± 2,49 * 0,050

ASB3 <бр> 6,55 ± 0,80 * 0,008

7,54 ± 0,37
1.000
3,49 ± 2,28 * 0,050

7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1.000
2,23 ± 1,99 * 0,050

5,33 ± 2,39 *
0.025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
+1,000
0,45 ± 2,51
0,724
7,12 ± 1,54
0,180
ASB9
9,03 ± 2,54
1.000
8,55 ± 0,71
1.000
0,79 ± 0,03
0,564
8,11 ± 1,58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 * 0,004

1,32 ± 1,45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 * 0,044

3,80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1.000
3.81 ± 3.11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881
Отрицательный контроль
9,71 ± 1,13
-
7,08 ± 0,65
-
0,15 ± 1,82
-
8,70 ± 0,62
-
Показана статистический анализ IL-1, IFN-gamma и экспрессии Н + /к + АТФазы мРНК в экспрессии мРНК антрального и гастрина в глазном дне желудка у песчанки на 9 недель после экспериментальной инфекции. экспрессии цитокинов анализировали с помощью дисперсионного анализа с Постфактум теста Бонферрони. Выражение H + /K + АТФазы и гена гастрина сравнивали между различными зараженными группами и управления с использованием анализа Крускала-Уоллиса, сопровождаемый Mann-Whitney U
тест. Различия считались статистически значимыми при р ≤ 0,05
. SPSS Statistics 21 программного обеспечения (IBM) использовали для всех анализов изображения среднее Ct-Ctref:. Для каждой экспериментальной группы, причем среднее значение нормированных Ct-значения ± стандартное отклонение показаны
п.н.
-value. : точные р
-значения приведены
* Статистически значимые различия по сравнению с неинфицированных контрольной группой (р ≤ 0,05
) Рисунок 4
уровней экспрессии мРНК цитокинов IL-1 и IFN-.. Г в полости желудка. Уровни экспрессии цитокинов мРНК в глазном дне и антрального отдела желудка были исследованы с помощью количественной ОТ-ПЦР. Уровни экспрессии IL-1 β (а) и IFN-gamma (б) в антральном показаны. Данные представлены в виде складчатого изменение экспрессии генов, нормированной на 3 эталонных генов и по отношению к отрицательной контрольной группе, которая рассматривается как 1. Данные представлены как средство + стандартное отклонение. Значительные различия в уровне экспрессии между привитых групп и отрицательной контрольной группы обозначены * р
&ЛТ; 0,05 (ANOVA).
Провоспалительных цитокинов IL-1 является мощным ингибитором секреции желудочной кислоты [30] и играет определенную роль в острой фазе воспаления [31]. Экспрессия IL-1 была повышающей регуляции в антральном отделе желудка песчанок, инфицированных H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 и ASB14, по сравнению с отрицательными контрольными животными (рис 4а). Для песчанок, привитых ASB7 и ASB9, не повышающей регуляции IL-1 был замечен.
The Th1 цитокина IFN-gamma, подпись маркер Th1-поляризованной ответ [24, 32], проявляли сниженную экспрессию в Антрум песчанок, инфицированных ASB11 и ASB13 (рис 4б), по сравнению с контрольными животными. не
никаких существенных различий в экспрессии между инфицированными и мнимым засевают песчанок можно было наблюдать за IL-5, IL-6, IL-10, + выражение IL-12р40, IL-17 и TNF-α.
париетальных клеток H /K + АТФазы мРНК понижающей регуляции в ответ на колонизацию с H. heilmannii
сс не
нет четкого потери париетальных клеток может быть визуализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания на глазном дне и антрального отдела H. heilmannii
SS-инфицированных песчанки по сравнению с неинфицированными (данные не показаны). Тем не менее, количественный RT-PCR показали четкое уменьшение экспрессии желудочной H + /K + АТФазы в антральном из песчанок, инфицированных ASB1, ASB3 и ASB6 (рисунок 5 и таблицу 2). По сравнению с контрольными животными с уровнями экспрессии мРНК, установленным в 1.0, среднее относительное выражение было 0,09 ± 2,11 для ASB1-, 0,10 ± 2,28 для ASB3- и 0,24 ± 1,99 ASB6-инфицированных песчанок, соответственно. Никаких существенных изменений в выражении не было замечено в глазном дне из H. heilmannii
S.S.-инфицированных песчанок. Рисунок уровень экспрессии мРНК 5 Н + /К + АТФазы в антральном отделе желудка. Гидрокарбонат калия уровень экспрессии мРНК АТФазы в желудке исследовали с помощью количественной ОТ-ПЦР. уровень экспрессии H + /K + АТФазы мРНК в антральном показана. Данные представлены в виде складчатого изменение экспрессии генов, нормированной на 3 эталонных генов и по отношению к отрицательной контрольной группе, которая рассматривается как 1. Данные представлены как средство + стандартное отклонение. Значительные различия в уровне экспрессии между привитых групп и отрицательной контрольной группы обозначены * р
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
тест).
Virulent H. heilmannii
S.S. штаммы вызывают повышенную экспрессию гастрина в глазном дне
гастрин пептидный гормон, стимулирует секрецию кислоты в желудке путем париетальных клеток. Нарушение в своем выражении может привести к гипергастринемии. Выражение гастрина был высоко повышающей регуляции в глазном дне песчанок, инфицированных ASB2 и ASB6 через 9 недель после инфицирования (рисунок 6 и таблица 2). По сравнению с контрольными животными, среднее относительное выражение было 6,79 ± 2,49 для ASB2- и 10,35 ± 2,39 для ASB6-инфицированных песчанок. В антральном отделе желудка, не повышающей регуляции экспрессии гастрина было обнаружено. Рисунок уровень экспрессии мРНК 6 гастрина в глазном дне желудка. Уровень экспрессии мРНК гастрина в желудке исследовали с помощью количественной ОТ-ПЦР. Показан уровень экспрессии в глазном дне. Данные представлены в виде складчатого изменение экспрессии генов, нормированной на 3 эталонных генов и по отношению к отрицательной контрольной группе, которая рассматривается как 1. Данные представлены как средство + стандартное отклонение. Значительные различия в уровне экспрессии между привитых групп и отрицательной контрольной группы обозначены * р
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
тест).
Обсуждение
В 9 недель после прививки, хронический активный гастрит в антральном отделе желудка наблюдалось у песчанок, экспериментально зараженных 7 из 9 H. heilmannii
сс штаммы, испытанные в этом исследовании (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 и ASB14). Собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой массово инфильтрирована лимфоцитами, что приводит к образованию лимфоидных фолликулов. H. heilmannii
S.S. штаммы были в основном обнаружены в антральном отделе и в меньшей степени в глазном дне и двенадцатиперстной кишки. У людей, инфицированных NHPh, колонизация и воспаление также в основном происходит в антральном отделе желудка [5, 33-35]. Это подтверждает, что монгольских песчанок являются подходящей моделью для изучения H. heilmannii
S.S. инфекции в организме человека, а также было показано, для H. суис
[19] и H. Pylori
[20, 21]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Анализ последовательности генома штаммов Helicobacter Pylori, связанные с язвой желудка и рака желудка
• Антимикробная активность, острая токсичность и цитопротективный эффект Crassocephalum vitellinum (Benth.) С. Мур экстракт в …