Rozmanitosť baktérie-hostiteľskej interakcie v rámci druhu Helicobacter heilmannii sensu stricto

rozmanitosť baktérie-hostiteľskej interakcie v rámci druhu Helicobacter heilmannii
sensu stricto
abstraktné
Helicobacter (H.) heilmannii
sensu stricto (ss) je zoonotické baktérie, ktorá kolonizuje prirodzene žalúdok psov a mačiek. U človeka, tento mikroorganizmus bol spájaný s gastritída, vredovej choroby a sliznice lymfóm asociovaný s lymfoidné tkanív (MALT) lymfómu. Málo informácií je k dispozícii o patogenéze H. heilmannii
S. S. infekcií u ľudí a nie je známe, či existujú rozdiely vo virulencii v rámci tohto druhu. Preto mongolský modelu Gerbil bola použitá k štúdiu baktérie-hostiteľskej interakcie 9 H. heilmannii
S. S. kmene. Kolonizácia Schopnosť kmeňov, intenzita gastritída a génovej expresie rôznych zápalových cytokínov v žalúdku boli stanovené v 9 týždne po pokusné infekcii. Indukcia z antra-dominantné chronickej aktívnej gastritíde s tvorbou agregátov lymfocytových bolo ukázané na 7 kmeňov. Na vysokej úrovni antrálnej kolonizácie bol pozorovaný u 4 kmeňov, zatiaľ čo kolonizácia 4 iných kmeňov bolo obmedzenejšie a jeden kmeň bol v žalúdku na 9 týždňov po infekcii neidentifikuje. Všetky kmene vyvolávajúce chronický aktívny gastritídu spôsobila up-regulácia prozápalových cytokínov IL-1 v dutine. Znížená antrálnej výrazom H + /K + ATPázy bol videný v žalúdku po infekcii s 3 veľmi kolonizovať kmene a 2 veľmi kolonizovať kmeňov spôsobil zvýšenú gastrín výraz v očnom pozadí. V žiadnom z heilmannii
S. S. infikovaných H. skupín, IFN-γ expresie bola up-regulovaná. Táto štúdia ukazuje rozmanitosť baktérie-hostiteľskej interakcie v rámci druhu H. heilmannii
S. S. stroje a že patogenéza žalúdočných infekcií týmto mikroorganizmom nie je totožná so baktérie H. pylori
infekcie. Úvod
Helicobacter (H.) pylori
je najrozšírenejší druh Helicobacter
kolonizovať žalúdočnú sliznicu človeka a bolo spojené s gastritída, vredovej choroby a rakoviny žalúdka [1-3]. Okrem H. pylori
druhej morfologicky odlišný non-H. pylori Helicobacter
(NHPh) druh, označovaný aj ako H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4], ktoré boli spojené s žalúdočné ochorenia u ľudí [5-10]. NHPh predstavuje skupinu príbuzných, ale odlišných druhov baktérií, hlavne nájdený u rôznych druhov zvierat, ako je napríklad H. felis
, H. Salomonis
H. bizzozeronii
H. heilmannii
sensu stricto (ss) H. cynogastricus stroje a H. baculiformis
, u mačiek a psov a H. suis
u ošípaných [5, 7, 10-15]. Tieto mikroorganizmy sa vyznačujú extrémne náročnom veľtržnom povahy, ktoré doteraz za následok obmedzený počet in vitro izolátov dostupné po celom svete.
H. heilmannii
S. S. len nedávno bola izolovaná a kultivované in vitro [16]. Že bola zistená v divoké mačky a v ľudských žalúdočných biopsiách, ale to je najbežnejšie objavujú v žalúdočnej sliznici mačiek a psov s prevahou v rozmedzí od 20 do 100%, [5-7, 10, 12]. Aj keď táto baktéria je spájaná s chronickou aktívnou gastritídou u mačiek a psov [12], jej patogénne význam zostáva záhadné a je pravdepodobne závislá na kmeň. U ľudí, H. heilmannii
S. S. bola zistená v 8-19% žalúdočných biopsiou s histologickým zistení infekcie NHPh [5, 8, 10]. Infekcia touto baktériou u ľudí bola spojená s gastritídou, vredovej choroby a slizničnej lymfóm asociovaný s lymfoidné tkanív (MALT) lymfóm [5, 8, 10, 17, 18].
Niekoľko štúdií infekcie v experimentálnych zvieracích modeloch boli vykonané na vyšetrovať patogenézy H. pylori
infekcií u ľudí. Na rozdiel od toho málo informácií je k dispozícii zaoberajúca sa patogenéze H. heilmannii
S. S. infekcií u ľudí. Táto baktéria bol propagovaný u myší po dobu až 28 mesiacov a bol schopný vyvolať sladu s lymfómom v žalúdkoch týchto zvierat [18]. Avšak v tomto experimente myši, homogenizuje žalúdočné tkaniva bol použitý ako inokulum. To znamená, že iné mikroorganizmy boli vrúbľovať s H. heilmannii
S. S., ktoré by mohli ovplyvniť výsledky, ako bolo opísané skôr [19]. Tak, aby získať lepší vhľad do patogenézy ľudskej žalúdočnej choroby spojené s H. heilmannii
S. S., experimentálne štúdie infekcie s čistými kultúrami tohto mikroorganizmu sú nevyhnutné. Preto je cieľom tejto štúdie bolo preskúmať baktérie-hostiteľskej interakcie 9 H. heilmannii
S. S. kmene izolované z žalúdočnej sliznice rôznych mačiek. Mongolskej modelu Gerbil Už skôr bolo preukázané, že je užitočný zvierací model pre štúdium Helicobacter
by preto žalúdočné patológiu u ľudí a bol preto použitý v tejto štúdii [19-21].
Materiál a metódy Bakteriálne
kmene
Deväť kmene H. heilmannii
ss boli získané z žalúdočnej sliznice rôznych mačiek a označený ASB1 (= typ kmeňa, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 a ASB14. Baktérie boli kultivované na dvojfázových Brucella
agarom (Oxoid, Basingstoke, UK) doplnenom 20% (objem /objem) fetálneho teľacieho séra (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /l amphothericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, obsahuje 10 mg /l vankomycín, 5 mg /l trimetoprim laktátu a 2500 U /L polymyxín B), Vitox doplnok (Oxoid) a 0,05% HCl (pH 5). Po inkubácii za mikroaerobní podmienok (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C), baktérie boli zozbierané a konečná koncentrácia bola upravená na 7 × 10 8 životaschopných baktérií /ml, ako je stanovené odpočtom v počítacie komore Neubauer
zvieratá, bývanie a experimentálny postup
špecifické-patogén (SPF) samica päť týždňov staré mongolské pieskomila (CRL :. MON (Tum), n
= 48) boli získané od Charles River Laboratories (Lille, Francúzsko). Zvieratá boli umiestnené v klietkach filtračných top (1500 cm 2) na autoklávovaných drevených hoblín autoklávového sena. Oni boli kŕmené ad libitum s autoklávovaného komerčné diétou (Teklad 2018S, ktorý obsahuje 18% bielkovín, Harlan, Holandsko) autoklávového vodu. Pre každú z 9 H. heilmannii
S. S. kmene testované, 5 zvierat boli vrúbľovať do žalúdka 3krát v intervale 2 dni s 300 ul bakteriálnej suspenzie. Tri zvieratá boli očkujú Brucella
média (pH 5, Oxoid) a slúžil ako negatívna kontrola. Naočkovanie bola vykonaná v krátkom izofluranom anestézie (2,5%), za použitia guľového hrotom ihly žalúdočnou sondou. V 9 týždňov po prvom očkovaní boli zvieratá zabité cervikálnou dislokáciou za hlbokej anestézie izofluranom (5%). Žalúdka a dvanástnika každého Gerbil boli resekováno a boli odobraté vzorky na histopatologické vyšetrenie a kvantitatívne real-time analýzy -PCR (RT).
In vivo experiment bola schválená etickou komisiou Fakulty veterinárneho lekárstva, Gent University, Belgicko (ES 2011/090).
histopatológie a imunohistochémia
pozdĺžnom reze, a to od konca predného žalúdka a obsahujúce antra a fundusu žalúdka a časti dvanástnika, bol rez pozdĺž väčšie zakrivenie a fixované v 10% formaldehydu pufrovanom fosfátom, spracované štandardnými metódami a vložené do parafínu pre svetelnú mikroskopiu. boli vyrezané tri po sebe idúce úseky 5 um. Po Deparafinizace a hydratáciu, sprístupnenie antigénu tepelne indukovaná bola vykonaná v citrátovom pufri (pH 6). K zablokovaniu endogénne peroxidázy a nešpecifické reakcie boli rezy inkubované s 3% H 2O 2 v metanole (5 min) a 30% kozieho séra (30 min), v danom poradí. Prvá časť sa zafarbia hematoxylín /eosínu (H &E) pre skóre intenzitu gastritídy podľa aktualizovaného Sydney systému [22], ale s určitými úpravami, ako bolo opísané skôr [19]. Na druhej sekcii, epiteliálne proliferácie buniek bola stanovená imunohistochemickým farbením za použitia myší monoklonálne protilátky anti-Ki67 (1/25; MENARINI diagnostika, Zaventem, Belgicko). epitelové bunky Ki67-pozitívne boli počítané v 5 náhodne zvolenom High Power poľa na úrovni žalúdka jam (zväčšenie: x 400), a to ako v antra a fundu. Priemer pozitívneho počtu buniek sa vypočíta pre každú experimentálnu skupinu v oboch oblastiach žalúdočnej
parietálnych buniek boli identifikované na treťom úseku imunohistochemickým farbením na hydrogénuhličitan draselný ATPázy za použitia myší monoklonálne protilátky (1/200;. abca Ltd, Cambridge, Veľká Británia). Inkubácia s primárnymi protilátkami proti Ki67 a vodík draselného ATPázy nasledovala inkubácia s HRP-značenú sekundárnou protilátkou (Envision Link Mouse K4007, DakoCytomation, Heverlee, Belgicko) pre vizualizáciu.
Extrakciu DNA a kvantifikáciu kolonizáciu H. heilmannii
ss v žalúdku a dvanástnika predaj z každej Gerbil, boli odobraté vzorky z fundusu a antra žalúdka a od dvanástnika. Vzorky tkaniva boli uložené v 1 ml RNA neskôr (Ambion, Austin, TE, USA) pri -70 ° C až do RNA-DNA a extrakcii. Vzorky tkaniva boli homogenizované (MagNALyser Roche, Mannheim, Nemecko) a RNA a DNA boli oddelené pomocou TriReagent RT (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Počet kolonizáciu H. heilmannii
S. S. na mg tkaniva žalúdka bola stanovená vo vzorkách DNA za použitia H. heilmannii
S. S. špecifické pre kvantitatívne RT-PCR. Pre generáciu štandardu, ktorý je súčasťou zhluku génu UreaB
(1224 bp) z H. heilmannii
S. S. ASB1 bola amplifikovaná s použitím primerov a U430F U1735R, ako bolo opísané skôr [6]. Štandardné sa skladala z 10-rozkladací riedenie od 10 8 PCR amplikónov za každých 10 ul reakčnej zmesi. Jeden ul extrahovaného templátu DNA sa suspenduje v 10 ul reakčnej zmesi obsahujúcej 0,25 ul oboch primérov umiestnených vnútri fragmentu 1224 bp, čím sa získa 212 bp PCR produkt (sense primeru: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 'antisencie primer: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', žíhacie teplota 58 ° C), 3,5 ul HPLC vody a 5 ul SensiMix ™ SYBR No-ROX (Bioline Ltd Činidlá , UK). Obaja štandardy a vzorky boli v duplikátoch na RT-PCR System ™ CFX96 s C1000 termocykléra (Bio-Rad, Hercules CA, USA). The (1,6 verzia) softvér Bio-Rad CFX Manažér bol použitý pre výpočet prahových cyklov (CT) -hodnoty a analýza krivky topenia amplifikovanej DNA. Boli použité priemerné hodnoty duplikátov pre kvantifikáciu H. heilmannii
S. S. DNA vo vzorkách tkanív.
Príprava RNA a expresie génov
Celková RNA zo vzoriek tkaniva, sa čistí pomocou RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko), podľa inštrukcií výrobcu. Čistota RNA bola preukázaná meraním pomeru absorbancie pri 260 nm a 280 nm s Nanodrop ktorá bola vo všetkých prípadoch približne 2. Koncentrácia RNA v každej vzorke bol upravený na 1 ug /ul a cDNA bola syntetizovaná bezprostredne po čistení RNA za použitia iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Alikvótne cDNA (1/5 riedenie) boli použité ako templát pre kvantitatívne RT-PCR pre meranie génovej expresie. Úrovne expresie mRNA rôznych cytokínov (IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ a TNF-α), gastrín a H + /K + ATPázy boli kvantifikované. V upratovacia gény GAPDH, β-aktínu stroje a HPRT
boli zahrnuté ako referenčné gény. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1. [23-28]. Pre všetky cieľové gény a referenčných génov, primérov účinnosti boli medzi 1,9 a 2,1. Reakcie boli vykonané v 10 objemoch ul obsahujúcich 1 ul cDNA, 0,05 ul oboch primérov, 3,9 ul HPLC vody a 5 ul SensiMix ™ SYBR No-ROX. Experimentálne protokol pre PCR reakciu (40 cyklov) bola vykonaná na RT-PCR System CFX96 ™ s C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad): denaturácia počas 15 min pri 95 ° C, a následne amplifikačních cyklov pri 95 ° C počas 20 s, Annealing pri 60 ° C počas 30 sekúnd a predĺženie pri 73 ° C počas 30 s. Kontrolné reakcie bez reverznej transkriptázy kroku bola vykonaná pre vylúčenie kontaminácie DNA vzoriek RNA. Ne-template-kontrolný reakčnej zmesi boli zahrnuté a všetky vzorky boli vykonávané v duplikátu. CT-hodnoty boli normalizované na geometrický priemer CT-hodnôt z referenčných génov 3, po ktorom normalizovanej hladiny mRNA boli vypočítané za použitia 2 -ΔΔCt metóda [29] .Table 1 párov primeru.
Primery
Sequence (5 '→ 3')
cytokíny
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5, RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG GTG TCT ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GMT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT GGG TCT ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC cca GAA GTC GGC G
TNF-alfa RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
gastrín
gastrín FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
gastrín RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPázy ( parietálnej bunky)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG Referencie génov
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GAG GCT AAC g
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA g
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-aktínu FW28
CCA CCA AGG ACC GCG AGA TGA C
β-aktínu RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Primer pary používa pre meranie sú uvedené úrovne expresie mRNA pre IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-y, TNF-a, gastrínu a H + /K + ATPázy. V upratovacia gény GAPDH, β-aktínu stroje a HPRT
boli zahrnuté ako referenčné gény.
Štatistická analýza
normality a homogenity variance dát boli analyzované pomocou Shapiro-Wilk test normality a test Levente pre homogenity rozptylov. Zápal žalúdka skóre, kolonizácie kapacity a ATPázy a gastrín génovej expresie boli porovnané medzi rôznymi skupinami nakazených a kontrol s využitím Kruskall-Wallis analýzu, po ktorom nasleduje Mann-Whitney U
testu. Cytokín expresie a počet Ki67-pozitívnych buniek boli analyzované pomocou analýzy variance s Bonferroniho post hoc test. Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 softvér (IBM) bol použitý pre všetky analýzy.
Výsledky
infekciu s virulentný H. heilmannii
S. S. Kmene sa prenáša vyvíjaný Antrum dominantné chronická aktívna gastritída
žalúdka všetkých kontrolných zvierat vykazovali normálny histomorphology (obrázok 1a). Zápal žalúdka pieskomilov infikovaných H. heilmannii
S. S. kmene ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 a ASB14 bol poznačený chronickej aktívnej gastritíde s tvorbou lymfatických agregátov v lamina propria a submukóze z antra žalúdka (1b obrázok). Hrúbka sliznice sa mierne zvýšila a bolo zistené len málo neutrofilov. Naproti tomu, H. heilmannii
S. S. kmene ASB7 a ASB9 nespôsobil explicitné antrálnej zápal a len mierne zvýšenie lymfocytárnej počtu buniek bolo pozorované v lamina propria antra v žalúdku (obrázok 1C). Vo všetkých H. heilmannii
S. S. infikované gerbily, boli zistené iba obmedzené známky zápalu v fundusu žalúdka (ďalší súbor 1). Antrálnej zápal výsledkov každého jednotlivého zvieraťa sú uvedené na obrázku 2d. Štatisticky významný rozdiel medzi zápal skóre pre pieskomilov naočkovaných ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 a ASB14 v porovnaní s kontrolnou skupinou bolo preukázané (Mann-Whitney U
test, p
menšie ako 0,05, obr 2d). Obrázok 1 H &E farbenie antra časti Gerbil žalúdka. Normálny histológia antra časti placebo naočkovaných negatívne kontrolné zvieratá (a). Explicitné lymfocytárnej infiltrácie lamina propria a podslizničnom tkanive s tvorbou lymfatických folikulov (šípky) v dutine jedného pískomil naočkovaného H. heilmannii
S. S. ASB1 (b). Mierne až chýbajúce lymfocytárnej infiltráciu (šípky) z lamina propria v dutine jedného Gerbil bol naočkovaný H. heilmannii
S. S. ASB7 (c). Bar = 30 um.
Obrázok 2 Kolonizácia kapacita H. heilmannii S. S. kmene a žalúdočné zápal skóre po experimentálnej infekcii. Kolonizácia kapacita je zobrazený ako log10 hodnôt H. heilmannii
S. S. baktérií na mg tkaniva, detekovanej pomocou kvantitatívnej RT-PCR v očnom pozadí (a) a (c) antra žalúdka a dvanástnika (b). Výsledky pod detekčným limitom (log 2,39 baktérií na mg tkaniva) bola stanovená ako 0. antrálnej zápal (d) bola hodnotená na škále od 0 do 4 (0: žiadna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky, 1: mierna difúzna infiltrácia mononukleárny a /alebo polymorfonukleárne bunky alebo prítomnosť jednej malej (50-200 buniek) agregátu zápalových buniek; 2: mierna difúzna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo prítomnosti zápalových 2-4 agregátov; 3: označené difúzna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo v prítomnosti najmenej piatich zápalových agregátov; 4: difúzny infiltráciu veľkých oblastí s veľkými agregáty mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky) .Individual pieskomily sú znázornené ako obrázkoch okolo strednej hodnoty ( linky). Štatistické významné rozdiely v porovnaní s kontrolnými zvieratami, sú označené * (Mann-Whitney U
test, p Hotel &0,05)
kolonizácia kapacita H. heilmannii
S. S .. Kmene v žalúdku a dvanástnika
Detekcia H. heilmannii
S. S. DNA pomocou kvantitatívnej RT-PCR v 9 týždňov po infekcii odhalili vysokej úrovni kolonizáciu ASB1, ASB2, ASB3 a ASB6 v žalúdku (pozri obrázok 2a-c). Na rozdiel od kolonizácie ASB7, ASB11, ASB13 a ASB14 bol viac obmedzený, zatiaľ čo ASB9 bola v žalúdku (obrázok 2a-c) nebola detekovaná. Všeobecne platí, že kolonizácia kapacita v očnom pozadí (obrázok 2a) bola nižšia ako v dutine (obrázok 2c) pre všetky testované kmene a najnižším počtom baktérií bola zistená v dvanástnika (obrázok 2b). Okrem toho jasné združenie bolo pozorované medzi kolonizačné schopnosť H. heilmannii
S. S. kmene a žalúdočné zápal skóre v antra žalúdka (2c-d).
Virulent H. heilmannii
S. S. kmene spôsobujú Žalúdočné antrálnej epitelové bunkovej proliferácie
Výsledky žalúdočné epiteliálne bunkovej proliferácie bodovanie do antra žalúdka sú znázornené na obrázku 3c. Významne vyššie počty Ki67-pozitívnych proliferujúcich epitelových buniek boli pozorované v dutine z ASB1- a ASB6 infikovaných Gerbil, v porovnaní s kontrolnou skupinou (ANOVA, p
menšie ako 0,05, 3a-b). Počty Ki67-pozitívnych buniek sa mierne zvýšila v ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- a ASB14 infikovaných Gerbil, aj keď nie štatisticky významné. H. heilmannii
S. S. kmene ASB7 a ASB9 nespôsobil nárast žalúdočné proliferácie epiteliálnych buniek. Okrem toho, významne vyššie počty proliferujúcich epitelových buniek boli demonštrované v dutine z ASB1-, ASB2- a ASB6 infikovaných Gerbil, v porovnaní s infikovanými pieskomilov ASB7 a ASB9 (ANOVA, p
menšie ako 0,05). Obrázok 3 Žalúdočné antrálnej epiteliálne bunková proliferácia. Ki67 farbenia antra časti pískomil naočkovaného H. heilmannii
S. S. ASB1 (b) ukazuje vyšší počet proliferujúcich epitelových buniek v porovnaní s placebo naočkovaných negatívne kontrolné zvieratá (a). Rýchlosť epitelovej bunkovej proliferácie bola stanovená počítaním Ki67-pozitívnych epitelové bunky v 5 náhodne zvolenom High Power poľa na úrovni žalúdka jam (zväčšenie: 400 ×) v dutine z Gerbil žalúdka (c). Priemerné počty Ki67-pozitívnych buniek sú uvedené v každej pokusnej skupine. Významné rozdiely medzi H. heilmannii
S. S. naočkovaných a kontrolných zvierat, sú označené * (ANOVA, p
menšie ako 0,05). Významné rozdiely v porovnaní s ASB7 a ASB9 naočkuje skupiny sú označené + a # na nich (ANOVA, p
menšie ako 0,05). Br &fundusu všetkých H. heilmannii
SS-infikovaných pieskomilov, epiteliálne rýchlosť proliferácie buniek bola významne vyššia v porovnaní s kontrolnými zvieratami (ďalší súbor 2).
cytokínov génu v žalúdku, v reakcii na H. heilmannii
ss Infekcia
miestneho hostiteľa imunitnej odpovede voči H. heilmannii
S. S. Infekcia bola charakterizovaná meraním mRNA úrovne expresie IFN-y, IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 a TNF-a v žalúdku pieskomilov. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2 a na obrázku 2 4.Table Štatistická analýza expresných hladín mRNA.
dutine
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATP
spoločností
gastrín
Mean CT-Ctrefa
p-VALUE mld
Stredná CT-Ctref
p-hodnota
Stredná CT-Ctref
hodnotu p
Stredná CT-Ctref
p-hodnotu
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1,000
3,70 ± 2,11 *
0,050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8,15 ± 1,26
1,000
2,42 ± 5,01
0,513
5,94 ± 2,49 *
0,050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1,000
3,49 ± 2,28 *
0,050
7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1,000
2,23 ± 1,99 *
0,050
5,33 ± 2,39 *
0,025
ASB7
10,25 ± 0,37
1,000
7,98 ± 0,52
1,000
0,45 ± 2,51
0,724
7,12 ± 1,54
0,180
ASB9
9,03 ± 2,54
1,000
8,55 ± 0,71
1,000
0,79 ± 0,03
0,564
8,11 ± 1,58
1,000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 * 0,004

1,32 ± 1,45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1,000
3,81 ± 3,11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881
Negatívna kontrola
9,71 ± 1,13 -
7,08 ± 0,65 -
0,15 ± 1,82 -
8,70 ± 0,62 -
Vidia je štatistická analýza IL-1, IFN-gama a expresiu H + /k + ATPázy mRNA v dutine a gastrínu expresie mRNA vo fundusu žalúdka Gerbil v 9 týždňov po pokusné infekcii. Cytokín expresia bola analyzovaná analýzou variance s Bonferroniho post hoc test. H + /K + ATPázy a gastrín génovej expresie boli porovnané medzi rôznymi skupinami nakazených a kontrol s využitím Kruskall-Wallis analýzu, po ktorom nasleduje Mann-Whitney U
testu. Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 softvér (IBM) bol použitý pre všetky analýzy
Mean Ct-Ctref :. Pre každú experimentálnu skupinu, sa zobrazí priemerná hodnota Ct normalizovaných hodnôt ± štandardná odchýlka
bp
-hodnota. : presné p
-hodnoty sú uvedené
* Štatisticky významné rozdiely v porovnaní so neinfikované kontrolnej skupiny (p
≤ 0,05)
Obrázok 4 úrovne expresie mRNA cytokínov IL-1 a IFN-y .. gama v dutine žalúdku. Cytokínov mRNA hladiny expresie vo fundusu a antra žalúdka boli skúmané pomocou kvantitatívnej RT-PCR. sú uvedené úrovne expresie IL-1 (a) a IFN-y (b) v dutine. Údaje sú prezentované ako násobné zmeny v génovej expresii normalizovanej na 3 referenčných génov, a vzhľadom k negatívnej kontrolnou skupinou, ktorá je považovaná za 1. Údaje sú uvedené ako priemery ± štandardná odchýlka. Významné rozdiely v expresii úrovni medzi naočkovaných skupín a negatívnou kontrolou sú označené * p Hotel < 0,05 (ANOVA).
Prezápalového cytokínu IL-1 je silný inhibítor sekrécie žalúdočnej kyseliny [30] a hrá úlohu pri akútnej fázy zápalu [31]. Expresie IL-1 bola up-regulované v antra žalúdka z pieskomilov infikovaných H. heilmannii
S. S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 a ASB14, v porovnaní s negatívnymi kontrolnými zvieratami (obr 4a). Pre pieskomilov naočkovaných ASB7 a ASB9, nie up-regulácia IL-1 bol pozorovaný.
Th1 cytokínov IFN-y, podpis značky na Th1-polarizované odozvy [24, 32], vykazovali zníženú expresiu v Antrum z pieskomilov infikovaných ASB11 a ASB13 (obrázok 4b), v porovnaní s kontrolnými zvieratami.
žiadne významné rozdiely v expresii medzi nakazenými a simulovanú Inokulované pieskomilov mohli byť sledované pre IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 a TNF-α.
parietálnych buniek H + /k + ATPázy expresie mRNA je down-regulovaná v reakcii na kolonizácie H. heilmannii
ss
žiadna jasná strata parietálnych buniek by mohla byť vizualizované imunohistochemické farbenie vo fundusu a antra v H. heilmannii
SS-infikovaných pieskomilov v porovnaní s neinfikovanými kontrolami (dáta nie sú uvedené). Avšak, kvantitatívne RT-PCR ukázali jasný pokles expresie žalúdočnej H + /K + ATPázy v dutine z Gerbil infikovaných ASB1, ASB3 a ASB6 (Obrázok 5 a Tabuľka 2). V porovnaní s kontrolnými zvieratami s úrovňou expresie mRNA nastavený na 1,0, je stredná relatívna expresia bola 0,09 ± 2,11 pre ASB1-, 0,10 ± 2,28 pre ASB3- a 0,24 ± 1,99 pre ASB6 infikovaných pieskomilov, v danom poradí. Žiadne významné zmeny v expresii bol videný v fundusu heilmannii
S. S. infikovaných pieskomilov H .. Obrázok 5 mRNA úroveň expresie H + /K + ATPázy v dutine žalúdku. Hydrogénuhličitan draselný ATPázy mRNA úroveň expresie v žalúdku bola skúmaná pomocou kvantitatívnej RT-PCR. je zobrazený H + /K + ATPázy mRNA úroveň expresie v dutine. Údaje sú prezentované ako násobné zmeny v génovej expresii normalizovanej na 3 referenčných génov, a vzhľadom k negatívnej kontrolnou skupinou, ktorá je považovaná za 1. Údaje sú uvedené ako priemery ± štandardná odchýlka. Významné rozdiely v expresii úrovni medzi naočkovaných skupín a negatívnou kontrolou sú označené * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Virulent H. heilmannii
S. S. kmene vyvolať zvýšenú expresiu gastrínu v očnom pozadí
peptidový hormón gastrín stimuluje vylučovanie žalúdočnej kyseliny parietálními bunkami. Porucha v jeho expresie môže viesť k hypergastrinémie. Expresia gastrínu bola vysoko up-regulovaný v fundusu pieskomilov infikovaných ASB2 a ASB6 na 9 týždňov po infekcii (obr 6 a tabuľka 2). V porovnaní s kontrolnými zvieratami, je stredná relatívna expresia bola 6,79 ± 2,49 pre ASB2- a 10,35 ± 2.39 pre ASB6 infikovaných pieskomilov. V antra žalúdka, nie je up-regulácia expresie bola detekovaná gastrínu. Obrázok 6 mRNA expresie hladina gastrínu v fundu žalúdka. Gastrín mRNA úroveň expresie v žalúdku bola skúmaná pomocou kvantitatívnej RT-PCR. Znázornený je hladina expresie v očnom pozadí. Údaje sú prezentované ako násobné zmeny v génovej expresii normalizovanej na 3 referenčných génov, a vzhľadom k negatívnej kontrolnou skupinou, ktorá je považovaná za 1. Údaje sú uvedené ako priemery ± štandardná odchýlka. Významné rozdiely v expresii úrovni medzi naočkovaných skupín a negatívnou kontrolou sú označené * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U test).
Diskusia
V 9 týždňov po očkovaní, chronická aktívna gastritída v antra žalúdka bolo pozorované u pieskomilov experimentálne infikovaných 7 z 9 H. heilmannii
ss kmene testované v tejto štúdii (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 a ASB14). Lamina propria a podslizničnom tkanive boli masívne infiltrovaná lymfocytov, čo vedie k tvorbe lymfatických folikulov. H. heilmannii
S. S. Kmene boli zistené predovšetkým v dutine, a v menšej miere vo fundu a dvanástnika. U ľudí nakazených NHPh, kolonizácie a zápal tiež dochádza najmä v antra žalúdka [5, 33-35]. To potvrdzuje, že mongolskej pieskomily sú vhodným modelom pre štúdium H. heilmannii
S. S. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Sekvencia genómu analýza Helicobacter pylori kmeňov spojené s žalúdočné vredy a rakovinou žalúdka
• Antimikrobiálna aktivita, akútna toxicita a cytoprotektívny účinok Crassocephalum vitellinum (. Benth), S. Moore extrahovať v modeli žalúdočné vredy krysa etanol-HCl