La diversité dans les interactions bactérie-hôte au sein de l'espèce la stricto de Helicobacter heilmannii

La diversité dans les interactions bactérie-hôte au sein de l'espèce Helicobacter heilmannii

sensu stricto Helicobacter (H.)
Résumé heilmannii
stricto sensu (ss) est une bactérie zoonotique qui colonise naturellement l'estomac des chiens et des chats . Chez l'homme, ce micro-organisme a été associée à la gastrite, l'ulcère gastro-duodénal et de la muqueuse tissu lymphoïde associé (MALT), un lymphome. Peu d'informations sont disponibles sur la pathogenèse de H. heilmannii
S.S. infections chez les humains et on ne sait pas si les différences de virulence existent au sein de cette espèce. Par conséquent, un modèle de gerbille de Mongolie a été utilisé pour étudier les interactions bactérie-hôte de 9 H. heilmannii
S.S. souches. La capacité de colonisation des souches, l'intensité de la gastrite et de l'expression des gènes des différentes cytokines inflammatoires dans l'estomac ont été déterminées à 9 semaines après l'infection expérimentale. L'induction d'une gastrite active chronique antrale-dominante avec la formation d'agrégats lymphocytaires a été montré pour les 7 souches. haut niveau colonisation antrale a été vu pour 4 souches, alors que la colonisation de 4 autres souches était plus restreint et une souche n'a pas été détectée dans l'estomac après l'infection 9 semaines. Toutes les souches induisant une gastrite chronique active a provoqué une régulation positive de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β dans l'antre. Une expression antrale réduite de H + /K + ATPase a été vu dans l'estomac après l'infection avec 3 souches hautement colonisatrices et 2 souches hautement colonisatrices provoqué une expression de gastrine augmenté dans le fond. Dans aucun des heilmannii
groupes S.S. infectés par H., l'expression d'IFN-γ était régulée à la hausse. Cette étude démontre la diversité dans les interactions bactérie-hôte dans le espèce H. heilmannii
S.S. Introduction et que la pathogénèse de l'estomac infections par ce micro-organisme ne soit pas identique à celui de l'infection d'une bactérie H. pylori.
Helicobacter (H.) pylori est
espèces de la plus répandue Helicobacter coloniser la muqueuse gastrique de l'être humain et qui a été associée à la gastrite, l'ulcère gastro-duodénal et le cancer gastrique [1-3]. Outre H. pylori
, d'autres non-H morphologiquement distinctes. (NHPh) de l'espèce Helicobacter pylori, aussi appelée H. heilmannii
lato sensu (S.L.) [4] ont été associés à des maladies gastriques chez l'homme [5-10]. NHPh représente un groupe d'espèces bactériennes étroitement apparentées mais distinctes, principalement trouvés dans différentes espèces animales, telles que H. de
, H. de la
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
stricto sensu (ss), H. cynogastricus
et H. baculiformis
chez les chats et les chiens et H. suis
chez les porcs [5, 7, 10-15]. Ces micro-organismes sont caractérisés par leur nature extrêmement fastidieux, qui, jusqu'ici, a donné lieu à un nombre limité d'isolats in vitro disponibles dans le monde entier.
H. heilmannii
S.S. a récemment été isolés et cultivés in vitro [16]. Il a été détecté dans félin sauvage et dans les biopsies gastriques humaines, mais il est le plus souvent trouvé dans la muqueuse gastrique des chats et des chiens avec une prévalence allant de 20 à 100% [5-7, 10, 12]. Bien que cette bactérie a été associée à la gastrite active chronique chez les chats et les chiens [12], sa signification pathogène reste énigmatique et est probablement dépendant de la souche. Chez l'homme, H. heilmannii
S.S. a été détecté dans 8 à 19% des biopsies gastriques avec évidence d'une infection par NHPh [5, 8, 10]. L'infection par cette bactérie chez l'homme a été associée à la gastrite, l'ulcère gastro-duodénal et le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) lymphome [5, 8, 10, 17, 18].
Plusieurs études d'infection dans des modèles animaux expérimentaux ont été effectués pour étudier la pathogenèse des infections de H. pylori chez les humains. En revanche, peu d'informations sont disponibles face à la pathogenèse de H. heilmannii
S.S. des infections chez les humains. Cette bactérie a été propagée chez les souris jusqu'à 28 mois et a été capable d'induire un lymphome de MALT dans l'estomac de ces animaux [18]. Cependant, dans cette expérience, la souris, le tissu gastrique homogénéisée a été utilisé comme inoculum. Cela implique que d'autres micro-organismes ont été ensemencés avec H. heilmannii
S.S., ce qui pourrait influencer les résultats, comme cela a été décrit précédemment [19]. Ainsi, pour obtenir un meilleur aperçu sur la pathogenèse de la maladie gastrique humaine associée à H. heilmannii
S.S., des études d'infection expérimentale avec des cultures pures de ce microorganisme sont essentiels. Par conséquent, le but de la présente étude était d'étudier les interactions bactérie-hôte de 9 H. heilmannii
S.S. souches, isolées de la muqueuse gastrique de différentes chats. Le modèle de gerbille de Mongolie a été montré précédemment pour être un modèle animal utile pour étudier Helicobacter de pathologie gastrique concernant la PI chez l'homme et a donc été utilisée dans la présente étude [19-21].
Matériel et méthodes
bactérienne Neuf souches de souches de H. heilmannii
ss ont été obtenus à partir de la muqueuse gastrique de différents chats et ASB1 désigné (= souche de type, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 et ASB14. Les bactéries ont été cultivées sur des plaques de gélose biphasiques
Brucella (Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni) supplémenté avec 20% (v /v) sérum de veau foetal (Hyclone, Logan, UT, USA), 5 mg /L amphotéricine B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, contient 10 mg /L de vancomycine, 5 mg /L triméthoprime lactate et 2500 U /L polymyxine B), Vitox supplément (Oxoid) et 0,05% de HCl (pH 5). Après incubation dans des conditions microaérobies (85% N 2, 10% de CO 2, 5% d'O 2; 37 ° C), les bactéries ont été récoltées et la concentration finale a été ajustée à 7 × 10 8 bactéries viables /mL, les animaux, le logement et la procédure expérimentale
libre d'agents pathogènes spécifiques (SPF) des femmes de cinq semaines vieux gerbilles de Mongolie (Crl
tel que déterminé par comptage dans une chambre de comptage Neubauer: MON. (Tum), n
= 48) ont été obtenus auprès de Charles River Laboratories (Lille, France). Les animaux ont été logés dans des cages haut de filtre (1500 cm 2) sur les copeaux de bois autoclavés et de foin autoclavé. Ils ont été nourris ad libitum un régime commercial autoclavé (Teklad 2018S, contenant 18% de protéine; Harlan, Pays-Bas) et de l'eau autoclavée. Pour chacun des 9 H. heilmannii
S.S. les souches testées, 5 animaux ont été inoculés par voie intragastrique 3 fois à des intervalles de 2 jours avec 300 pi d'une suspension bactérienne. Trois animaux ont été inoculés avec Brucella bouillon (pH 5, Oxoid) et ont servi de contrôles négatifs. Ensemencement a été réalisée sous brève anesthésie à l'isoflurane (2,5%), en utilisant une aiguille de gavage balle à bout. Après 9 semaines après la première inoculation, les animaux ont été euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie à l'isoflurane profonde (5%). L'estomac et le duodénum de chaque gerbille ont été réséquées et des échantillons ont été prélevés pour un examen histopathologique et quantitative en temps réel (RT) analyse de -PCR.
L'expérience in vivo a été approuvé par le comité d'éthique de la Faculté de médecine vétérinaire, Gand Université, Belgique (CE 2011/090).
histopathologie et immunohistochimie
Une section longitudinale, à partir de la fin du préestomac et comprenant l'antre et le fundus de l'estomac et une partie du duodénum, ​​a été coupé le long de la grande courbure et fixé dans 10% de tampon phosphate formaline, traités par des méthodes standard et inclus dans la paraffine pour la microscopie optique. Trois sections consécutives de 5 um ont été coupées. Après déparaffinage et de l'hydratation, la récupération des antigènes induite par la chaleur a été réalisée dans un tampon citrate (pH 6). Pour bloquer l'activité de peroxydase endogène et des réactions non spécifiques, les lames ont été mises en incubation avec 3% de H 2 O 2 dans du methanol (5 min) et du sérum de chèvre à 30% (30 min), respectivement. La première section a été colorée avec de l'hématoxyline /éosine (H & E) pour marquer l'intensité de la gastrite selon le Système de Sydney Mise à jour [22], mais avec quelques modifications, comme décrit précédemment [19]. Sur la seconde section, la prolifération des cellules épithéliales a été déterminée par coloration immunohistochimique utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-Ki67 (25/01; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgique). les cellules épithéliales Ki67-positives ont été comptés dans 5 choisis au hasard Haut champs Puissance au niveau des fosses gastriques (grossissement: 400 ×), à la fois dans l'antre et fundus. La moyenne du nombre de cellules positives a été calculé pour chaque groupe expérimental dans les deux régions de l'estomac
cellules pariétales ont été identifiés sur la troisième section par coloration immunohistochimique pour le potassium d'hydrogène ATPase en utilisant un anticorps monoclonal de souris (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). L'incubation avec des anticorps primaires dirigés contre Ki67 et de potassium d'hydrogène ATPase a été suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire marqué à la HRP (Envision Lien souris K4007, DakoCytomation, Heverlee) pour la visualisation.
Extraction de l'ADN et la quantification des colonisant H. heilmannii
ss dans l'estomac et du duodénum
A partir de chaque gerbille, des échantillons provenant du fond d'oeil et l'antre de l'estomac et du duodénum ont été prises. Des échantillons de tissus ont été stockés dans 1 ml d'ARN plus tard (Ambion, Austin, TE, États-Unis) à -70 ° C jusqu'à ce que l'ARN et l'ADN-extraction. Des échantillons de tissus ont été homogénéisés (MagNALyser, Roche, Mannheim, Allemagne) et de l'ARN et l'ADN ont été séparés en utilisant TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, États-Unis) selon les instructions du fabricant. Le nombre de colonisant H. heilmannii
S.S. par mg de tissu gastrique a été déterminée dans les échantillons d'ADN en utilisant un H. heilmannii
RT-PCR quantitative S.S. spécifique. Pour la génération de la norme, une partie du groupe de gènes du ureAB de (1224 pb) à partir de H. heilmannii
S.S. ASB1 a été amplifié en utilisant des amorces et U430F U1735R, comme décrit précédemment [6]. La norme est composée de 10 fois-dilutions à partir de 10 8 amplicons PCR pour chaque 10 pi de mélange réactionnel. Un pi de matrice d'ADN extrait a été mis en suspension dans un mélange réactionnel de 10 ul constitué de 0,25 ul de deux amorces situées à l'intérieur du fragment bp 1224, pour obtenir un produit de PCR de 212 pb (amorce sens: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', amorce antisens: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', température de recuit 58 ° C), 3,5 pi HPLC eau et 5 pi SensiMix ™ SYBR No-ROX (Bioline Réactifs Ltd , ROYAUME-UNI). Les deux étalons et les échantillons ont été analysés en double sur un système CFX96 ™ RT-PCR avec un cycleur thermique C1000 (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Le (version 1.6) du logiciel Bio-Rad CFX Manager est utilisé pour le calcul du seuil cycles (Ct) -values ​​et analyse de la courbe de fusion de l'ADN amplifié. Les valeurs moyennes des doublons ont été utilisées pour la quantification de H. heilmannii
S.S. L'ARN total de l'ADN dans les échantillons de tissus.
Préparation de l'ARN et l'expression génique, à partir des échantillons de tissus, a été purifié en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. La pureté de l'ARN a été démontrée en mesurant le rapport d'absorbance à 260 nm et 280 nm avec NanoDrop qui, dans tous les cas, était d'environ 2. La concentration d'ARN dans chaque échantillon a été ajusté à 1 ug /ul et l'ADNc a été synthétisé immédiatement après la purification de l'ARN en utilisant iScript Kit de synthèse d'ADNc ™ (Bio-Rad). Des aliquotes de l'ADNc (dilution 1/5) ont été utilisés comme matrice pour la RT-PCR quantitative pour la mesure de l'expression génique. Les niveaux de différentes cytokines (IL-la 1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, l'IFN-γ et TNF-α), la gastrine et H + /K expression d'ARNm + ATPase ont été quantifiés. Les gènes de ménage GAPDH, β-actine
et HPRT
ont été inclus en tant que gènes de référence. Les séquences des amorces sont présentées dans le Tableau 1 [23-28]. Pour tous les gènes cibles et gènes de référence, les efficacités d'amorces se situaient entre 1,9 et 2,1. Les réactions ont été effectuées dans 10 volumes ul contenant 1 ul d'ADNc, 0,05 ul de deux amorces, 3,9 pi HPLC eau et 5 pi SensiMix ™ SYBR No-ROX. Le protocole expérimental pour la réaction PCR (40 cycles) a été effectuée sur un système de RT-PCR CFX96 ™ avec un cycleur thermique C1000 (Bio-Rad): dénaturation pendant 15 min à 95 ° C, suivi par des cycles d'amplification à 95 ° C pendant 20 s, annelage à 60 ° C pendant 30 s et extension à 73 ° C pendant 30 s. Les réactions témoins sans l'étape de transcriptase inverse ont été réalisées pour exclure une contamination de l'ADN des échantillons d'ARN. Sans matrice de contrôle de mélanges réactionnels ont été inclus et tous les échantillons ont été exécutés en double. Les valeurs Ct ont été normalisées à la moyenne géométrique des valeurs Ct des gènes de référence 3, après quoi les niveaux d'ARNm normalisés ont été calculées en utilisant la 2 -ΔΔCt méthode [29] .Tableau 1 paires d'amorces.
Amorces
Séquence (5 '→ 3')
Cytokines
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL- 1β RV23
IL-5 CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG CAG CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT GCC TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA IL-17 FW23 de la CCC TA
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC de l'IFN-γ de RV24
TNF-α FW23 de GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α la RV23 de GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
CTT TTC TTG de Gastrin RV25 de GCC CTG de Gastrin FW25 de gastrine de GGT GGT TGG GTA CGA CA GAA GCC CAA CA GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( cellules pariétales)
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG de ATP4b FW
gènes de référence GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
HPRT FW27 CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT RV27 de la CCT ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actine FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
RV28 β-actine
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
paires d'amorces utilisé pour mesurer les niveaux d'expression de l'ARNm de l'IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-y, TNF-a, gastrine et H + /K + ATPase sont représentés. Les gènes de ménage GAPDH, β-actine
et HPRT
ont été inclus en tant que gènes de référence.
Normalité et la variance de l'homogénéité de l'analyse statistique des données ont été analysées à l'aide de Shapiro-Wilk test de normalité et le test de Levene pour l'homogénéité des variances. les scores de gastrite, la capacité de colonisation et ATPase et le gène de la gastrine expression ont été comparés entre les différents groupes infectés et les contrôles à l'aide de l'analyse Kruskall-Wallis, suivie par un test de Mann-Whitney U. l'expression des cytokines et le nombre de cellules Ki67 positifs ont été analysées par analyse de variance avec un test post-hoc de Bonferroni. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à p ≤ 0,05
. Résultats de SPSS Statistics 21 logiciels (IBM) a été utilisé pour toutes les analyses.
Infection virulent H. heilmannii
S.S. souches induit une gastrite chronique active antrum-dominante
L'estomac de tous les animaux de contrôle a montré une histomorphologie normale (Figure 1a). L'inflammation dans l'estomac de gerbilles infectés par H. heilmannii
S.S. souches ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 et ASB14 a été marquée par une gastrite chronique active avec la formation d'agrégats lymphocytaires dans la lamina propria et la sous-muqueuse de l'antre de l'estomac (figure 1b). L'épaisseur de la muqueuse a été légèrement augmentée et à seulement quelques neutrophiles ont été détectés. En revanche, H. heilmannii
S.S. souches ASB7 et ASB9 ne provoquent une inflammation antrale explicite et seulement une légère augmentation du nombre de cellules lymphocytaire a été observée dans la lamina propria de l'antre de l'estomac (figure 1c). Dans tous H. heilmannii
gerbilles S.S. infectés, des signes limités de l'inflammation ont été détectés dans le fond de l'estomac (fichier supplémentaire 1). Les scores d'inflammation antraux de chaque animal sont présentés dans la figure 2d. Une différence statistiquement significative entre les scores d'inflammation pour les gerbilles inoculées avec ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 et ASB14 par rapport au groupe de contrôle a été démontrée (test, p <
de Mann-Whitney U; 0,05, figure 2d). Figure 1 H & E coloration de l'antre de l'estomac de gerbille. histologie normale de l'antre d'un contrôle négatif animal sham-inoculés (a). infiltration lymphocytaire explicite de la lamina propria et la sous-muqueuse avec la formation de follicules lymphoïdes (flèches) dans l'antre d'une gerbille inoculé avec H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Doux à l'absence d'infiltration lymphocytaire (flèches) de la lamina propria dans l'antre d'une gerbille inoculés avec H. heilmannii
S.S. ASB7 (c). Bar = 30 pm Figure 2 Colonisation la capacité. De H. heilmannii S.S. souches et gastrique score d'inflammation après l'infection expérimentale. capacité de Colonization est montré comme log10 valeurs de H. heilmannii
S.S. bactéries par mg de tissu, détectée par RT-PCR quantitative dans le fundus (a) et le sinus (c), de l'estomac et du duodénum (b). Résultats ci-dessous la limite de détection (log 2,39 bactéries par mg de tissu) ont été mis à 0. Antral inflammation (d) a été notée sur une échelle de 0 à 4 (0: pas d'infiltration avec mononucléaires et /ou polynucléaires cellules; 1: infiltration diffuse doux avec mononucléaires et /ou polynucléaires ou la présence d'une petite taille (50-200 cellules) agrégat de cellules inflammatoires; 2: infiltration diffuse modérée avec mononucléaires et /ou polynucléaires et /ou la présence d'agrégats inflammatoires 2-4; 3: marquée infiltration diffuse avec des cellules mononucléaires et /ou polynucléaires et /ou la présence d'au moins cinq agrégats inflammatoires; 4: infiltration diffuse de grandes régions avec de grands agrégats de mononucléaires et /ou polynucléaires), les gerbilles .Individual sont représentés comme des figures autour de la moyenne ( lignes). des différences importantes statistiques par rapport aux animaux témoins sont indiqués par * (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05) Capacité
Colonization de H. heilmannii
S.S.. souches dans l'estomac et du duodénum
Détection de H. heilmannii
S.S. ADN avec RT-PCR quantitative à 9 semaines après l'infection a révélé la colonisation de haut niveau de ASB1, ASB2, ASB3 et ASB6 dans l'estomac (Figure 2a-c). En revanche, la colonisation des ASB7, ASB11, et ASB13 ASB14 est plus restreinte pendant ASB9 n'a pas été détectée dans l'estomac (figure 2a-c). D'une manière générale, la capacité de colonisation dans le fond d'oeil (figure 2a) était plus faible que dans le sinus maxillaire (figure 2c) pour toutes les souches testées et le plus petit nombre de bactéries a été détectée dans le duodénum (figure 2b). En outre, une association claire a été observée entre la capacité de colonisation de la H. heilmannii
S.S. souches et les scores d'inflammation gastrique dans l'antre de l'estomac (figure 2c-d) Virulent H.. heilmannii
S.S. souches provoquent des résultats de prolifération épithéliale antrale gastrique des cellules épithéliales de la notation de la prolifération cellulaire gastrique dans l'antre de l'estomac sont présentés dans la figure 3c. un nombre significativement plus élevé de cellules epitheliales proliférantes Ki67-positives ont été observées dans l'antre et ASB1- gerbilles infectées ASB6, par rapport au groupe témoin (ANOVA, p
< 0,05, la figure 3a-b). Le nombre de cellules Ki67-positives ont été modérément augmenté en ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- et gerbilles ASB14 infectées, bien que non statistiquement significative. H. heilmannii
S.S. souches ASB7 et ASB9 n'a pas provoqué une augmentation de l'estomac prolifération des cellules épithéliales. En outre, un nombre significativement plus élevé de cellules épithéliales proliférantes ont été démontrées dans l'antre de ASB1-, ASB2- et gerbilles ASB6 infectées, comparativement à gerbilles infectées par ASB7 et ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). La figure 3 antrale de l'estomac prolifération des cellules épithéliales. Ki67 coloration de l'antre d'une gerbille inoculés avec H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) montrant un nombre plus élevé de cellules épithéliales proliférantes par rapport à un témoin négatif animal sham-inoculés (a). Le taux de prolifération des cellules épithéliales a été déterminée par comptage des cellules épithéliales Ki67-positives dans 5 choisis au hasard haut champs de puissance au niveau des fosses gastriques (grossissement: 400 ×) dans l'antre de l'estomac gerbille (c). Les nombres moyens de cellules Ki67-positives sont indiqués dans chaque groupe expérimental. Des différences significatives entre H. heilmannii
S.S.-inoculés et les animaux témoins sont indiqués par * (ANOVA, p
< 0,05). Des différences significatives par rapport à ASB7 et les groupes ASB9 inoculés sont indiqués par + et # respectivement (ANOVA, p
< 0,05).
Dans le fond de tous H. heilmannii
gerbilles ss-infecté, le épithéliale le taux de prolifération cellulaire n'a pas été significativement plus élevée par rapport aux animaux témoins (fichier additionnel 2).
l'expression du gène de cytokine dans l'estomac en réponse à H. heilmannii
ss infection
La réponse immunitaire de l'hôte local vers H. heilmannii
S.S. l'infection a été caractérisée en mesurant le niveau d'expression d'ARNm d'IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 et TNF-α dans l'estomac des gerbilles. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 et sur la figure 2 4.Table Analyse statistique des taux d'expression d'ARNm.
Antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

p-valeurB
H + /K + ATPase
Gastrin
Mean Ct-Ctrefa
moyenne
p-valeur de ct-Ctref
moyenne
p-valeur de ct-Ctref
p-valeur ct-Ctref moyenne
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1.000
3,70 ± 2.11 *
0,050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8,15 ± 1,26
1.000
2.42 ± 5.01
0,513
5,94 ± 2,49 *
0,050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1.000
3,49 ± 2,28 *
0,050
7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1.000
2,23 ± 1,99 *
0,050
5,33 ± 2,39 *
0,025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
1.000
0,45 ± 2,51
0,724
7,12 ± 1,54
0,180
ASB9
9,03 ± 2,54
1.000
8,55 ± 0,71
1.000
0,79 ± 0,03
0,564
8,11 ± 1,58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 *
0,004
1,32 ± 1,45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1.000
3.81 ± 3.11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881 contrôle
négatif
9,71 ± 1,13
- 7,08 ± 0,65
- 0,15 ± 1,82
- 8,70 ± 0,62
- Montré est l'analyse statistique de l'IL-1β, l'IFN-γ et d'expression H + /K + ATPase ARNm dans l'expression de l'ARNm et de la gastrine antrale dans le fond de l'estomac gerbille à 9 semaines après l'infection expérimentale. l'expression des cytokines a été analysée par une analyse de variance avec un test post-hoc de Bonferroni. H + /K + ATPase et le gène de la gastrine expression ont été comparés entre les différents groupes infectés et les contrôles à l'aide de l'analyse Kruskall-Wallis, suivie par un test de Mann-Whitney U. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à p ≤ 0,05
. SPSS Statistics 21 logiciels (IBM) a été utilisé pour toutes les analyses
une moyenne Ct-Ctref:. Pour chaque groupe expérimental, la moyenne des valeurs Ct normalisées ± écart-type sont présentées
pb
-value. : exactement les p
-values ​​sont donnés
* des différences statistiquement significatives par rapport au groupe témoin non infecté (p ≤ 0,05
)
Figure 4 niveaux d'expression d'ARNm de cytokines IL-1β et de l'IFN.. y dans l'antre de l'estomac. les niveaux d'expression d'ARNm de cytokine dans le fond d'oeil et de l'antre de l'estomac ont été examinés par RT-PCR quantitative. les niveaux d'IL-1β (a) et IFN-γ (b) dans l'antre d'expression sont représentés. Les données sont présentées en tant que facteur de variation de l'expression génique de gènes normalisée de référence 3 et par rapport au groupe témoin négatif qui est considérée comme 1. Les données sont montrées comme des moyennes ± écart-type. Des différences significatives dans le niveau d'expression entre les groupes inoculés et le groupe de contrôle négatif sont indiqués par * p
< 0,05 (ANOVA).
La cytokine pro-inflammatoire IL-1β est un puissant inhibiteur de la sécrétion d'acide gastrique [30] et joue un rôle dans la phase aiguë de l'inflammation [31]. L'expression de l'IL-1β a été régulée à la hausse dans l'antre de l'estomac de gerbilles infectés par H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, et ASB13 ASB14, par rapport aux animaux témoins négatifs (Figure 4a). Pour gerbilles inoculées avec ASB7 et ASB9, pas une régulation de l'IL-1β a été vu.
La Th1 cytokine IFN-γ, un marqueur de la signature de la réponse Th1 polarisée [24, 32], présentaient une diminution de l'expression dans le antrale de gerbilles infectées par ASB11 et ASB13 (figure 4b), par rapport aux animaux témoins.
Aucune différence significative dans l'expression entre les gerbilles infectées et fictivement inoculé n'a pu être observée pour l'IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 et TNF-α.
pariétal cellulaire H + /K + ATPase expression de l'ARNm est régulée à la baisse en réponse à la colonisation par H. heilmannii
ss
Pas de perte nette des cellules pariétales pourrait être visualisée par immunohistochimie dans le fond d'oeil et l'antre de H. heilmannii
ss gerbilles infectées par rapport aux témoins non infectées (données non montrées). Cependant, RT-PCR quantitative a montré une nette diminution de l'expression de l'estomac H + /K + ATPase dans l'antre des gerbilles infectées par ASB1, ASB3 et ASB6 (Figure 5 et le Tableau 2). Par rapport aux animaux témoins ayant des niveaux d'expression d'ARNm fixés à 1,0, l'expression relative moyenne était de 0,09 ± 2,11 pour ASB1-, 0,10 ± 2,28 et 0,24 pour ASB3- ± 1,99 pour les gerbilles infectées ASB6, respectivement. Aucun changement significatif dans l'expression a été observée dans le fond des heilmannii
gerbilles S.S. infectés par H.. Figure 5 ARNm niveau d'expression de la H + /K + ATPase dans l'antre de l'estomac. Hydrogène de potassium ATPase ARNm niveau d'expression dans l'estomac a été examinée par RT-PCR quantitative. H + /K + ATPase ARNm niveau d'expression dans l'antre est représenté. Les données sont présentées en tant que facteur de variation de l'expression génique de gènes normalisée de référence 3 et par rapport au groupe témoin négatif qui est considérée comme 1. Les données sont montrées comme des moyennes ± écart-type. Des différences significatives dans le niveau d'expression entre les groupes inoculés et le groupe de contrôle négatif sont indiqués par * p
≤ 0,05 (test
Mann-Whitney U).
Virulent H. heilmannii
S.S. les souches induisent une augmentation de l'expression de la gastrine dans le fundus The hormone gastrine peptide stimule la sécrétion d'acide gastrique par les cellules pariétales. Une perturbation dans son expression peut conduire à hypergastrinémie. L'expression de gastrine était hautement régulée à la hausse dans le fond de gerbilles infectées par ASB2 et ASB6 à 9 semaines après l'infection (figure 6 et tableau 2). Par rapport aux animaux témoins, l'expression relative moyenne était de 6,79 ± 2,49 et 10,35 pour ASB2- ± 2,39 pour les gerbilles infectées ASB6. Dans l'antre de l'estomac, a été détecté aucune régulation à la hausse de l'expression de gastrine. Figure 6 ARNm niveau d'expression de gastrine dans le fond de l'estomac. Gastrine ARNm niveau d'expression dans l'estomac a été examinée par RT-PCR quantitative. On a représenté le taux d'expression dans le fundus. Les données sont présentées en tant que facteur de variation de l'expression génique de gènes normalisée de référence 3 et par rapport au groupe témoin négatif qui est considérée comme 1. Les données sont montrées comme des moyennes ± écart-type. Des différences significatives dans le niveau d'expression entre les groupes inoculés et le groupe de contrôle négatif sont indiqués par * p ≤
Discussion de
0,05 (test de Mann-Whitney U). A 9 semaines après l'inoculation, une gastrite chronique active dans l'antre de l'estomac a été observée chez des gerbilles infectés expérimentalement avec 7 sur 9 H. heilmannii
ss souches testées dans cette étude (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 et ASB14). La lamina propria et la sous-muqueuse ont été massivement infiltrées avec des lymphocytes, conduisant à la formation de follicules lymphoïdes. Le H. heilmannii
S.S. les souches ont été principalement détectée dans le sinus maxillaire et dans une moindre mesure, dans le fond et le duodénum. Chez les humains infectés par le NHPh, la colonisation et l'inflammation aussi se produisent principalement dans l'antre de l'estomac [5, 33-35]. Cela confirme que les gerbilles de Mongolie sont un modèle approprié pour étudier H. heilmannii
S.S. infections chez l'homme, comme cela a également été montré pour H.
suis [19] et H. pylori
[20, 21]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• analyse de la séquence du génome de Helicobacter pylori souches associées à l'ulcération gastrique et gastrique analyse de la séquence du génome de cancer
• L'activité antimicrobienne, la toxicité aiguë et l'effet cytoprotecteur de Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore extrait dans un ulcère gastrique rat éthanol-HCl activité model