Mangfoldighed i bakterie-vært interaktioner inden arten Helicobacter heilmannii snæver forstand

Mangfoldighed i bakterie-vært interaktioner inden arten Helicobacter heilmannii
snæver forstand
Abstrakt
Helicobacter (H.) heilmannii
snæver forstand (ss) er en zoonotisk bakterie, der naturligt koloniserer maven af ​​hunde og katte . Hos mennesker har denne mikroorganisme blevet forbundet med gastritis, mavesår sygdom og mucosa associerede lymfoide væv (MALT) lymfom. Lidt oplysninger om patogenesen af ​​H. heilmannii
S.S. infektioner i mennesker, og det er uvist, om forskelle i virulens eksistere inden denne art. Derfor blev en mongolsk hoppemus model, der anvendes til at studere bakterie-vært interaktioner af 9 H. heilmannii
S.S. stammer. Koloniseringen Stammernes evne, intensiteten af ​​gastritis og genekspression af forskellige inflammatoriske cytokiner i maven blev bestemt ved 9 uger efter eksperimentel infektion. Induktionen af ​​en antrum-dominerende kronisk aktiv gastritis med dannelse af lymfocytiske aggregater blev vist for 7 stammer. Højt niveau antral kolonisering blev set i 4 stammer, mens kolonisering af 4 andre stammer var mere begrænset og en stamme blev ikke detekteret i maven på 9 uger efter infektion. Alle stammer, der inducerer en kronisk aktiv gastritis forårsagede en opregulering af pro-inflammatoriske cytokin IL-1β i antrum. En reduceret antral udtryk for H + /K + ATPase blev set i maven efter infektion med 3 meget koloniserende stammer og 2 meget koloniserende stammer forårsagede en øget gastrin udtryk i fundus. I ingen af ​​de H. heilmannii Salg S.S.-inficerede grupper, IFN-γ-ekspression var opreguleret. Denne undersøgelse viser mangfoldighed i bakterie-vært interaktioner inden for arterne H. heilmannii
S.S. og at patogenesen af ​​gastriske infektioner med denne mikroorganisme er ikke identisk med den for et H. pylori
infektion.
Indledning
Helicobacter (H.) pylori
er den mest udbredte Helicobacter
arter koloniserer maveslimhinden hos mennesker og er blevet forbundet med gastritis, mavesår sygdom og gastrisk cancer [1-3]. Udover H. pylori
, andre morfologisk forskellig ikke-H. pylori Helicobacter
(NHPh) arter, der også betegnes som H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4], er blevet associeret med gastrisk sygdom hos mennesker [5-10]. NHPh repræsenterer en gruppe af nært beslægtede, men distinkte bakteriearter, hovedsageligt findes i forskellige dyrearter, såsom H. felis
, H. salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
snæver forstand (ss), H. cynogastricus
og H. baculiformis
i katte og hunde og H. suis
hos svin [5, 7, 10-15]. Disse mikroorganismer er karakteriseret ved deres ekstremt kræsen natur, som hidtil har resulteret i et begrænset antal in vitro isolater tilgængelig over hele verden.
H. heilmannii
S.S. er først for nylig blevet isoleret og dyrket in vitro [16]. Det er blevet påvist hos vilde katte og i humane gastriske biopsier, men det er mest almindeligt forekommende i maveslimhinden af ​​katte og hunde med en prævalens i området fra 20 til 100% [5-7, 10, 12]. Selv om denne bakterie er blevet forbundet med kronisk aktiv gastritis hos katte og hunde [12], dens patogene betydning forbliver gådefulde og er sandsynligvis stamme-afhængig. Hos mennesker, H. heilmannii
S.S. er blevet påvist i 8-19% af gastriske biopsier med histologiske tegn på NHPh infektion [5, 8, 10]. Infektion med denne bakterie hos mennesker er blevet forbundet med gastritis, mavesår sygdom og mucosa associerede lymfoide væv (MALT) lymfom [5, 8, 10, 17, 18].
Adskillige infektionsstudier i eksperimentelle dyremodeller er blevet udført til undersøge patogenesen af ​​H. pylori
infektioner i mennesker. I modsætning hertil lidt information er tilgængelig beskæftiger sig med patogenesen af ​​H. heilmannii
S.S. infektioner i mennesker. Denne bakterie er blevet formeret i mus i op til 28 måneder og var i stand til at inducere MALT lymfom i maverne af disse dyr [18]. Men i denne mus eksperiment blev homogeniseret gastrisk væv, der anvendes som inokulum. Dette indebærer, at andre mikroorganismer blev podet sammen med H. heilmannii
S.S., som kan påvirke resultaterne, som er blevet beskrevet tidligere [19]. For således at opnå bedre indsigt i patogenesen af ​​human gastrisk sygdom forbundet med H. heilmannii
S.S., eksperimentel infektion studier med rene kulturer af denne mikroorganisme er afgørende. Derfor er formålet med den foreliggende undersøgelse var at studere bakterie-vært interaktioner af 9 H. heilmannii
S.S. stammer, isoleret fra maveslimhinden forskellige katte. Den mongolske hoppemus model har tidligere vist sig at være en nyttig dyremodel for at studere Helicobacter
-relateret gastrisk patologi hos mennesker og blev derfor anvendt i den foreliggende undersøgelse [19-21].
Materiale og metoder
Bakteriel stammer
Ni stammer af H. heilmannii
ss blev opnået fra maveslimhinden forskellige katte og udpeget ASB1 (= stamme, DSM 23.983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 og ASB14. Bakterier blev dyrket på bifasiske Brucella
agarplader (Oxoid, Basingstoke, UK) suppleret med 20% (v /v) føtalt kalveserum (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /l amphothericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, indeholder 10 mg /l vancomycin, 5 mg /l trimethoprim lactat og 2500 E /L polymyxin B), Vitox supplement (Oxoid) og 0,05% HCI (pH 5). Efter inkubering under mikroaerobe betingelser (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C), blev bakterierne høstet, og slutkoncentrationen blev justeret til 7 × 10 8 levedygtige bakterier /mL, som bestemt ved tælling i en Neubauer tællekammer
Dyr, boliger og eksperimentelle procedure
Specific-patogen-fri (SPF) kvindelige fem uger gamle mongolske ørkenrotter (CRL:. MON (Tum), n
= 48) blev opnået fra Charles River Laboratories (Lille, Frankrig). Dyrene blev opstaldet i filter top bure (1500 cm 2) på autoklaveres høvlspåner og autoklaveres hø. De blev fodret ad libitum en autoklaveret kommerciel diæt (Teklad 2018S, indeholdende 18% protein; Harlan, Holland) og autoklaveret vand. For hver af de 9 H. heilmannii
S.S. stammer testet, 5 dyr blev intragastrisk inokuleret 3 gange med 2 dages mellemrum med 300 pi af en bakteriel suspension. Tre dyr blev inokuleret med Brucella
bouillon (pH 5, Oxoid) og tjente som negative kontroller. Podning blev udført under kortvarig isoflurananæstesi (2,5%), ved anvendelse af en kugle spids gavagenål. Ved 9 uger efter den første inokulering, blev dyrene aflivet ved cervikal dislokation under dyb isofluran anæstesi (5%). Maven og tolvfingertarmen af ​​hver gerbil blev resektion og prøver blev taget til histopatologisk undersøgelse og kvantitativ real-time (RT) -PCR analyse.
In vivo forsøg blev godkendt af Etisk Komité veterinærmedicinske fakultet, Gent University, Belgien (EF 2011/090).
Histopatologi og immunhistokemi
En længdesnit, startende fra slutningen af ​​formaven og omfatter antrum og fundus af maven og en del af duodenum, blev skåret langs store krumning og fikseret i 10% phosphatpufret formalin, behandlet ved standardmetoder og indlejret i paraffin til lysmikroskopi. Tre på hinanden følgende sektioner af 5 um blev skåret. Efter afparaffinering og hydratisering blev varmeinduceret antigen hentning udført i citratbuffer (pH 6). At blokere endogen peroxidase-aktivitet og ikke-specifikke reaktioner blev objektglassene inkuberet med 3% H 2O 2 i methanol (5 min) og 30% gedeserum (30 min), hhv. Det første afsnit blev farvet med hæmatoxylin /eosin (H &E) for at score intensiteten af ​​gastritis efter den Opdateret Sydney System [22], men med visse ændringer, som tidligere beskrevet [19]. På den anden sektion blev epitelcelleproliferation bestemt ved immunhistokemisk farvning under anvendelse af et monoklonalt muse-anti-Ki67-antistof (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgien). Ki67-positive epitelceller blev talt i 5 tilfældigt valgt High Power Fields på niveau med de gastriske miner (forstørrelse: 400 x), både i antrum og fundus. Gennemsnittet af den positive celletal blev beregnet for hver forsøgsgruppe i begge mave regioner
parietalcellerne blev identificeret på den tredje sektion af immunhistokemisk farvning for hydrogen kalium ATPase anvendelse af et monoklonalt muse-antistof (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). Inkubation med primære antistoffer rettet mod Ki67 og hydrogen kalium ATPase blev efterfulgt af inkubation med et HRP-mærket sekundært antistof (Envision Link Mouse K4007, DakoCytomation, Heverlee, Belgien) til visualisering.
DNA-ekstraktion og kvantificering af kolonisering H. heilmannii
ss i maven og duodenum
Fra hver gerbil, blev prøver fra fundus og antrum i maven og fra duodenum taget. Vævsprøver blev opbevaret i 1 ml RNA senere (Ambion, Austin, TE, USA) ved -70 ° C indtil RNA- og DNA-ekstraktion. Vævsprøver blev homogeniseret (MagNALyser, Roche, Mannheim, Tyskland) og RNA og DNA blev separeret ved anvendelse TriReagent RT (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, USA) ifølge producentens anvisninger. Antallet af kolonisere H. heilmannii
S.S. per mg gastrisk væv blev bestemt i DNA-prøverne ved anvendelse af en H. heilmannii
S.S.-specifik kvantitativ RT-PCR. Til generering af standarden, del af ureAB
genklyngen (1224 bp) fra H. heilmannii
S.S. ASB1 blev amplificeret under anvendelse af primere U430F og U1735R, som tidligere beskrevet [6]. Standarden bestod af 10-fold-fortyndinger startende ved 10 8 PCR amplikoner for hver 10 pi reaktionsblanding. One pi ekstraherede DNA template blev suspenderet i en reaktionsblanding 10 pi bestående af 0,25 pi begge primere placeret inden bp-fragmentet 1224, hvilket gav et 212 bp PCR-produkt (sense primer: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', antisense-primer: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', annealing temperatur 58 ° C), 3,5 pi HPLC vand og 5 pi SensiMix ™ SYBR nr-ROX (Bioline Reagenser Ltd , UK). Både standarder og prøver blev kørt i duplikat på en CFX96 ™ RT-PCR System med en C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Den (version 1.6) software Bio-Rad CFX manager blev anvendt til beregning af tærskelværdier cyklusser (CT) -værdier og smeltekurveanalyse af amplificeret DNA. Den gennemsnitlige værdi af dubletter blev brugt til kvantificering af H. heilmannii
S.S. DNA i vævsprøver.
RNA-fremstilling og genekspression
Totalt RNA fra vævsprøverne, blev oprenset ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Renhed af RNA blev påvist ved at måle forholdet mellem absorbansen ved 260 nm og 280 nm med NanoDrop som i alle tilfælde var cirka 2. koncentrationen RNA i hver prøve blev justeret til 1 ug /uL og cDNA blev syntetiseret umiddelbart efter RNA oprensning under anvendelse iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Portioner af cDNA (1/5 fortynding) blev anvendt som en skabelon til kvantitativ RT-PCR til måling af genekspression. MRNA ekspressionsniveauer af forskellige cytokiner (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ og TNF-α), gastrin og H + /K + ATPase blev kvantificeret. Husholdning gener GAPDH, β-actin
og HPRT
indgik som reference- gener. Primersekvenser er vist i tabel 1 [23-28]. For alle target gener og reference- gener, de primer effektivitet var mellem 1,9 og 2,1. Reaktioner blev udført i 10 pi volumener indeholdende 1 pi cDNA, 0,05 pL af begge primere, 3,9 pi HPLC vand og 5 pi SensiMix ™ SYBR nr-ROX. Den eksperimentelle protokol til PCR-reaktion (40 cyklusser) blev udført på en CFX96 ™ RT-PCR System med en C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad): denaturering i 15 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af amplifikationscykler ved 95 ° C i 20 s, annealing ved 60 ° C i 30 s og ekstension ved 73 ° C i 30 s. Kontrolreaktioner uden revers transkriptase trin blev gennemført for at udelukke DNA forurening af RNA-prøver. Uden template-kontrol reaktionsblandinger blev medtaget og alle prøver blev kørt in duplo. CT-værdierne blev normaliseret til den geometriske middelværdi af CT-værdierne fra de 3 referencepunkter gener, hvorefter normaliserede mRNA-niveauer blev beregnet ved anvendelse 2 -ΔΔCt metode [29] .table 1 Primerpar.
Primere
Sequence (5 '→ 3')
Cytokiner
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC FTT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA Californien
Gastrin
Gastrin FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
Gastrin RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( parietalcellerne)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
reference gener
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actin FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
β-actin RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Primerpar anvendes til måling mRNA ekspressionsniveauer af IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-y, TNF-a, gastrin og H + /K + ATPase er vist. Husholdning gener GAPDH, β-actin
og HPRT
indgik som reference- gener.
Statistisk analyse
Normalitet og varians homogenitet blev analyseret ved hjælp af Shapiro-Wilk normalitet test og Levene test for homogenitet af afvigelser. Gastritis scores, kolonisering kapacitet og ATPase og gastrin-genekspression blev sammenlignet mellem forskellige inficerede grupper og kontroller under anvendelse Kruskall-Wallis-analyse efterfulgt af en Mann-Whitney U
test. Cytokinekspression og antallet af Ki67-positive celler blev analyseret ved variansanalyse med en Bonferroni post hoc test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 software (IBM) blev anvendt til alle analyser.
Resultater
Infektion med virulent H. heilmannii
S.S. stammer inducerer en antrum-dominerende kronisk aktiv gastritis
mave alle kontroldyr udviste en normal histomorphology (figur 1a). Betændelse i maven af ​​hoppemus inficeret med H. heilmannii
S.S. stammer ASB1, ASB2, ASB3, ASB6 blev ASB11, ASB13 og ASB14 præget af en kronisk aktiv gastritis med dannelse af lymfocytiske aggregater i lamina propria og submucosa af antrum i maven (figur 1b). Den mucosale tykkelse blev let øget og påvistes kun få neutrofiler. I modsætning hertil H. heilmannii
S.S. stammerne ASB7 og ASB9 forårsagede ikke eksplicit antral inflammation og kun en svag stigning i lymfocytisk celletal blev observeret i lamina propria af antrum i maven (fig 1c). I alle H. heilmannii
S.S.-inficerede ørkenrotter, blev opdaget kun begrænsede tegn på betændelse i fundus af maven (Ekstra fil 1). De antrale inflammation snesevis af hvert enkelt dyr er vist i figur 2d. En statistisk signifikant forskel mellem betændelse scoringer for ørkenrotter podet med ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14 sammenlignet med kontrolgruppen blev demonstreret (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05, figur 2d). Figur 1 H &E farvning af antrum af en gerbil mave. Normal histologi af antrum af en skin-inokuleret negativ kontrol dyr (a). Explicit lymfocytisk infiltration af lamina propria og submucosa med dannelsen af ​​lymfoide follikler (pile) i antrum af en gerbil inokuleret med H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Mild til fraværende lymfocytisk infiltration (pile) af lamina propria i antrum af en gerbil inokuleret med H. heilmannii
S.S. ASB7 (c). Bar = 30 um.
Figur 2 Colonization kapacitet H. heilmannii S.S. stammer og gastrisk inflammation score efter eksperimentel infektion. Colonization kapacitet er vist som log10-værdierne af H. heilmannii
S.S. bakterier pr mg væv, detekteret med kvantitativ RT-PCR i fundus (a) og antrum (c) i maven og tolvfingertarmen (b). blev sat resultater under detektionsgrænsen (log 2,39 bakterier pr mg væv) som 0. Antral inflammation (d) blev bedømt på en skala fra 0 til 4 (0: ingen infiltration med mononukleære og /eller polymorfkernede celler; 1: mild diffus infiltration med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler eller tilstedeværelse af en lille (50-200 celler) aggregat af inflammatoriske celler; 2: moderat diffus infiltration med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelse af 2-4 inflammatoriske aggregater; 3: markeret diffus infiltration med mononukleære og /eller polymorfonukleære celler og /eller tilstedeværelsen af ​​mindst fem inflammatoriske aggregater; 4: diffus infiltration af store regioner med store aggregater af mononukleære og /eller polymorfonukleære celler) .Individual hoppemus er afbildet som tal omkring gennemsnittet ( linjer). Statistiske signifikante forskelle i forhold til at styre dyrene er angivet med * (Mann-Whitney U
test, p
< 0,05)
Colonization kapacitet H. heilmannii
S.S.. stammer i maven og tolvfingertarmen
Påvisning af H. heilmannii
S.S. DNA med kvantitativ RT-PCR på 9 uger efter infektion viste højt niveau kolonisering af ASB1, ASB2, ASB3 og ASB6 i maven (figur 2a-c). I modsætning hertil kolonisering af ASB7, ASB11, ASB13 og ASB14 var mere begrænset, mens ASB9 ikke blev detekteret i maven (figur 2a-c). Generelt koloniseringen kapacitet i fundus (figur 2a) var lavere end i antrum (figur 2c) for alle testede stammer og det laveste antal bakterier blev påvist i duodenum (figur 2b). Desuden blev en klar sammenhæng ses mellem koloniseringen kapacitet H. heilmannii
S.S. stammer og mavens betændelse scorer i antrum i maven (Figur 2c-d).
Virulent H. heilmannii
S.S. stammer forårsage gastriske antral epitelcelleproliferation
Resultater af den gastriske epitelcelleproliferation scoring i antrum i maven er vist i figur 3c. Betydeligt højere antal Ki67-positive prolifererende epitelceller blev set i antrum af ASB1- og ASB6-inficerede hoppemus, sammenlignet med kontrolgruppen (ANOVA, p
< 0,05, figur 3a-b). Antal Ki67-positive celler var moderat forøget i ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- og ASB14-inficerede hoppemus, men ikke statistisk signifikant. H. heilmannii
S.S. stammerne ASB7 og ASB9 ikke forårsage en stigning af gastrisk epitelcelleproliferation. Desuden blev signifikant højere antal prolifererende epitelceller demonstreret i antrum af ASB1-, ASB2-, og ASB6-inficerede hoppemus, sammenlignet med hoppemus inficeret med ASB7 og ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figur 3 Gastrisk antral epitelcelleproliferation. Ki67-farvning af antrum af en gerbil inokuleret med H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) viser et højere antal prolifererende epitelceller sammenlignet med en sham-inokuleret negativ kontrol dyr (a). Hastigheden af ​​epitelcelleproliferation blev bestemt ved tælling Ki67-positive epitelceller i 5 tilfældigt valgt High Power Fields på niveau med de gastriske miner (forstørrelse: 400 x) i antrum af gerbil mave (c). De gennemsnitlige antal af Ki67-positive celler er vist i hver forsøgsgruppe. Væsentlige forskelle mellem H. heilmannii
S.S.-podet og ved * kontroldyr er angivet (ANOVA, p
< 0,05). Signifikante forskelle i forhold med ASB7 og ASB9 podet grupper er angivet med + og # henholdsvis (ANOVA, p
< 0,05).
I fundus af alle H. heilmannii
ss-inficerede ørkenrotter, epitel celledeling sats var ikke signifikant højere sammenlignet med kontroldyr (Yderligere fil 2).
Cytokine genekspression i maven som reaktion på H. heilmannii
ss infektion
lokale vært immunrespons mod H. heilmannii
S.S. infektion blev karakteriseret ved at måle mRNA-ekspression niveau af IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 og TNF-α i maven af ​​hoppemus. Resultater er vist i tabel 2 og i figur 4.Table 2 Statistisk analyse af mRNA-ekspressionsniveauer.
antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPase
Gastrin Vejviser Mean Ct-Ctrefa
p-værdiB
Mean ct-Ctref
p-værdi
Mean ct-Ctref
p-værdi
Mean ct-Ctref
p-værdi
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1,000
3,70 ± 2,11 *
0,050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8.15 ± 1,26
1,000
2,42 ± 5,01
0,513
5,94 ± 2,49 *
0,050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1,000
3.49 ± 2.28 *
0,050
7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1,000
2,23 ± 1,99 *
0,050
5,33 ± 2,39 *
0,025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
1,000
0,45 ± 2,51
0,724
7.12 ± 1,54
0,180
ASB9
9.03 ± 2,54
1,000
8,55 ± 0.71
1,000
0,79 ± 0,03
0,564
8.11 ± 1,58
1,000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10.45 ± 0.95 *
0,004
1,32 ± 1,45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1,000
3,81 ± 3,11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881
negativ kontrol
9,71 ± 1,13 -
7,08 ± 0,65 -
0,15 ± 1,82 -
8,70 ± 0,62 -
Vist er den statistiske analyse af IL-1β, IFN-γ og H + /K + ATPase-mRNA-ekspression i antrum og gastrin-mRNA-ekspression i fundus af gerbil maven på 9 uger efter eksperimentel infektion. Cytokin ekspression blev analyseret ved variansanalyse med en Bonferroni post hoc test. H + /K + ATPase og gastrin-genekspression blev sammenlignet mellem forskellige inficerede grupper og kontroller under anvendelse Kruskall-Wallis-analyse efterfulgt af en Mann-Whitney U
test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 software (IBM) blev anvendt til alle analyser
en Mean Ct-Ctref:. For hver forsøgsgruppe, er gennemsnittet af de normaliserede Ct-værdier ± standardafvigelse vist
bp
-værdi. : de nøjagtige p
-værdier er givet
* Statistisk signifikante forskelle i forhold til ikke-inficerede kontrolgruppen (p
≤ 0,05)
Figur 4 mRNA ekspression niveauer af cytokiner IL-1β og IFN.. y i antrum i maven. Cytokin mRNA ekspressionsniveauer i fundus og antrum i maven blev undersøgt ved kvantitativ RT-PCR. Ekspressionsniveauer af IL-1β (a) og IFN-γ (b) i antrum er vist. Data er præsenteret som den gange ændring i genekspression normaliseret til 3 reference- gener og i forhold til den negative kontrolgruppe, der anses for 1. Data er vist som middel + standardafvigelse. Væsentlige forskelle i udtryk plan mellem podede grupper og negativ kontrolgruppe er angivet med * p
< 0,05 (ANOVA).
Pro-inflammatoriske cytokin IL-1β er en potent inhibitor af mavesyresekretion [30] og spiller en rolle i den akutte fase af inflammation [31]. Ekspression af IL-1β blev opreguleret i antrum i maven af ​​hoppemus inficeret med H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14, sammenlignet med de negative kontroldyr (figur 4a). For hoppemus inokuleret med ASB7 og ASB9, ingen opregulering af IL-1β blev set.
Th1 cytokin IFN-γ, en signatur markør af Th1-polariseret respons [24, 32], udviste en reduceret ekspression i antrum af hoppemus inficeret med ASB11 og ASB13 (figur 4b), sammenlignet med kontroldyrene.
nogen signifikante forskelle i ekspression mellem inficerede og skin-inokuleret hoppemus kunne observeres for IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 og TNF-α.
parietalcellens H + /K + ATPase mRNA-ekspression nedreguleres som respons på kolonisering med H. heilmannii
ss
Ingen klar tab af parietalcellerne kunne være visualiseret ved immunhistokemisk farvning i fundus og antrum af H. heilmannii Salg ss-inficerede hoppemus sammenlignet med de ikke-inficerede kontroller (data ikke vist). Imidlertid viste kvantitativ RT-PCR, et klart fald i ekspressionen af ​​gastrisk H + /K + ATPase i antrum af ørkenrotter inficeret med ASB1, ASB3 og ASB6 (figur 5 og tabel 2). Sammenlignet med kontroldyrene med mRNA ekspressionsniveauer sat til 1,0, den gennemsnitlige relative ekspression var 0,09 ± 2,11 for ASB1-, 0,10 ± 2,28 for ASB3- og 0,24 ± 1,99 for ASB6-inficerede hoppemus hhv. Ingen signifikant ændring i ekspression blev set i fundus af H. heilmannii Salg S.S.-inficerede hoppemus. Figur 5 mRNA-ekspression niveau af H + /K + ATPase i antrum i maven. Hydrogen kalium ATPase mRNA-ekspression niveau i maven blev undersøgt ved kvantitativ RT-PCR. H + /K + ATPase-mRNA-ekspression niveau i antrum er vist. Data er præsenteret som den gange ændring i genekspression normaliseret til 3 reference- gener og i forhold til den negative kontrolgruppe, der anses for 1. Data er vist som middel + standardafvigelse. Væsentlige forskelle i udtryk plan mellem podede grupper og negativ kontrolgruppe er angivet med * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Virulent H. heilmannii
S.S. stammer inducerer øget gastrin ekspression i fundus
peptidhormon gastrin stimulerer sekretionen af ​​mavesyre ved parietalceller. En forstyrrelse i sit udtryk kan føre til hypergastrinæmi. Ekspressionen af ​​gastrin var stærkt opreguleret i fundus af hoppemus inficeret med ASB2 og ASB6 på 9 uger efter infektion (figur 6 og tabel 2). I forhold til kontroldyr, den gennemsnitlige relative udtryk var 6,79 ± 2,49 for ASB2- og 10.35 ± 2.39 for ASB6-inficerede ørkenrotter. I antrum i maven, ingen opregulering af gastrin-ekspression blev detekteret. Figur 6 mRNA-ekspression niveau af gastrin i fundus af maven. Gastrin mRNA-ekspression niveau i maven blev undersøgt ved kvantitativ RT-PCR. Vist er udtryk niveau i fundus. Data er præsenteret som den gange ændring i genekspression normaliseret til 3 reference- gener og i forhold til den negative kontrolgruppe, der anses for 1. Data er vist som middel + standardafvigelse. Væsentlige forskelle i udtryk plan mellem podede grupper og negativ kontrolgruppe er angivet med * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Diskussion dele på 9 uger efter podning, en kronisk aktiv gastritis i antrum i maven blev observeret i hoppemus eksperimentelt inficeret med 7 af 9 H. heilmannii
ss testet i denne undersøgelse stammer (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 og ASB14). Lamina propria og submucosa var massivt infiltreret med lymfocytter, hvilket resulterer i dannelsen af ​​lymfoide follikler. Den H. heilmannii
S.S. stammer blev hovedsageligt påvist i antrum og i mindre grad i fundus og duodenum. I inficeret med NHPh mennesker, kolonisering og inflammation også hovedsagelig forekomme i antrum i maven [5, 33-35]. Dette bekræfter, at mongolske ørkenrotter er en passende model til at studere H. heilmannii
S.S. infektioner hos mennesker, som er også blevet vist for H. suis
[19] og H. pylori
[20, 21]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Genom-sekvensanalyse af Helicobacter pylori stammer, der er forbundet med gastrisk ulceration og gastrisk cancer
• Antimikrobiel aktivitet, akut toksicitet og cytobeskyttende effekt af Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore ekstrakt i en rotte ethanol-HCI mavesår model