Vielfalt in der Bakterium-Wirt-Interaktionen innerhalb der Spezies Helicobacter heilmannii sensu stricto

Vielfalt in Bakterium-Wirt-Interaktionen innerhalb der Spezies Helicobacter heilmannii
sensu stricto
Zusammenfassung Helicobacter (H.) heilmannii
sensu stricto (ss) ist eine Zoonose-Bakterium, das den Magen von Hunden und Katzen natürlich kolonisiert. Beim Menschen dieser Mikroorganismus wurde mit Gastritis, Magengeschwüren und assoziierten lymphatischen Gewebe Schleimhaut (MALT) Lymphom. Nur wenige Informationen verfügbar über die Pathogenese von H. heilmannii
S.S. Infektionen bei Menschen, und es ist nicht bekannt, ob Unterschiede in der Virulenz innerhalb dieser Spezies existieren. Daher wurde eine mongolische Gerbils Modell zu studieren Bakterium-Wirt-Interaktionen von 9 H. heilmannii
S.S. verwendet Stämme. Die Besiedlungsfähigkeit der Stämme, die Intensität von Gastritis und Genexpression verschiedener entzündlicher Zytokine in den Magen wurden bei 9 Wochen nach experimenteller Infektion bestimmt. Die Induktion einer Antrum-dominant chronische aktive Gastritis mit Bildung von Aggregaten lymphatischer wurde 7 Stämme gezeigt. Hochrangige antral Kolonisation wurde 4 Stämme gesehen, während Besiedlung von 4 anderen Stämmen war stärker eingeschränkt und ein Stamm wurde nicht im Magen bei 9 Wochen nach der Infektion nachgewiesen. Alle Stämme eine chronische aktive Gastritis induziert verursacht eine Hochregulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β in der Kieferhöhle. Eine verminderte Expression von antralen H + /K + ATPase wurde im Magen nach der Infektion mit 3 stark kolonisierenden Stämme und 2 hoch kolonisierenden Stämme verursacht eine erhöhte Expression Gastrin im Fundus gesehen. In keinem der H. heilmannii
S.S.-infizierten Gruppen, IFN-γ-Expression war hochreguliert. Diese Studie zeigt, Vielfalt in Bakterium-Wirt-Interaktionen innerhalb der Spezies H. heilmannii
S.S. und dass die Pathogenese von Mageninfektionen mit diesem Mikroorganismus zu der einer H. pylori-Infektion
nicht identisch ist.
Einführung Helicobacter (H.) pylori Was ist die am weitesten verbreitete Helicobacter
Spezies Kolonisierung der Magenschleimhaut des Menschen und hat mit Gastritis, Magengeschwüre und Magenkrebs [1-3] in Verbindung gebracht worden. Neben H. pylori
, andere morphologisch unterschiedliche nicht-H. pylori Helicobacter
(NPSH) Arten, die auch als H. heilmannii
sensu lato (S. L.) [4] wurden mit Magen-Krankheit beim Menschen [5-10] verbunden. NPSH steht für eine Gruppe von eng verwandten, aber verschiedene Bakterienarten, vor allem in verschiedenen Tierarten gefunden, wie H. felis
, H. Salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
sensu stricto (ss), H. cynogastricus
und H. baculiformis
bei Katzen und Hunden und H. suis
bei Schweinen [5, 7, 10-15]. Diese Mikroorganismen sind durch ihre extrem anspruchsvollen Natur aus, die so weit geführt hat, in einer begrenzten Anzahl von in vitro-Isolate weltweit erhältlich.
H. heilmannii
S.S. wurde erst vor kurzem in vitro [16] isoliert und kultiviert. Es hat sich in der wilden Katzen-und in der menschlichen Magen-Biopsien nachgewiesen, aber es ist am häufigsten in der Magenschleimhaut von Katzen und Hunden mit einer Prävalenz von 20 bis 100% [5-7, 10, 12]. Obwohl dieses Bakterium mit chronisch aktiver Gastritis bei Katzen und Hunden [12], dessen pathogene Bedeutung bleibt rätselhaft und wird wahrscheinlich belasten abhängig in Verbindung gebracht worden. Bei Menschen, H. heilmannii
S.S. wurde in 8-19% der Magenbiopsien mit histologischen Nachweis der NPSH-Infektion [5, 8, 10] festgestellt. Die Infektion mit diesem Bakterium beim Menschen mit Gastritis, Magengeschwüren und assoziierten lymphatischen Gewebe-Schleimhaut (MALT) Lymphom [5, 8, 10, 17, 18].
Mehrere Infektionsstudien in experimentellen Tiermodellen wurden durchgeführt, um in Verbindung gebracht worden die Pathogenese von H. pylori
Infektionen beim Menschen zu untersuchen. Im Gegensatz dazu ist wenig Information mit der Pathogenese von H. heilmannii
S.S. verfügbaren Handels Infektionen beim Menschen. Dieses Bakterium wurde für bis zu 28 Monate bei Mäusen propagiert und konnte MALT-Lymphom in den Mägen der Tiere [18] zu induzieren. Doch in dieser Maus Experiment wurde homogenisiert Magengewebe als Impfstoff verwendet. Dies bedeutet, dass andere Mikroorganismen zusammen beimpft wurden mit H. heilmannii
S.S., die die Ergebnisse beeinflussen könnten, wie zuvor beschrieben wurde [19]. Somit bessere Einblicke in die Pathogenese menschlicher Erkrankungen des Magens mit H. heilmannii
S.S., experimentelle Infektionsstudien mit reinen Kulturen dieser Mikroorganismen sind wesentlich assoziiert zu erhalten. Daher war es das Ziel der vorliegenden Studie Bakterium-Wirt-Interaktionen von 9 H. heilmannii
S.S. studieren Stämme, isoliert aus der Magenschleimhaut von verschiedenen Katzen. Die mongolische Wüstenrennmaus-Modell hat bisher ein nützliches Tiermodell zu untersuchen Helicobacter
-related Magen-Pathologie bei Menschen und wurde daher in der vorliegenden Studie [19-21].
Material und Methoden
Bakterielle verwendet gezeigt worden, Neun Stämme von H.
Stämme heilmannii
ss wurden aus der Magenschleimhaut von verschiedenen Katzen und bezeichnet ASB1 (= Typ-Stamm, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 und ASB14 erhalten. Bakterien wurden kultiviert auf zweiphasige Brucella
Agarplatten (Oxoid, Basingstoke, UK), ergänzt mit 20% (v /v) fötalem Kälberserum (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /l Amphotericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, enthält 10 mg /l Vancomycin, 5 mg /L Lactat Trimethoprim und 2500 U /L Polymyxin B), Vitox Ergänzung (Oxoid) und 0,05% HCl (pH 5). Nach Inkubation unter mikroaeroben Bedingungen (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C) wurden die Bakterien geerntet und die Endkonzentration bis 7 × 10 eingestellt 8 lebensfähige Bakterien /ml, wie bestimmt durch in einer Neubauer-Zählkammer gezählt
Tiere, Gehäuse und experimentelle Verfahren
Specific-pathogenfreien (SPF) weiblich fünf Wochen alte mongolische Wüstenrennmäuse (Crl:. MON (Tum), n
= 48) wurden von Charles River Laboratories (Lille, Frankreich) erhalten. Die Tiere wurden in Filterober Käfige (1500 cm 2) auf autoklaviert Holzspäne und autoklaviert Heu untergebracht. Sie wurden ad libitum eine autoklaviert kommerziellen Diät (Teklad 2018S, 18% Protein enthält; Harlan, Niederlande) zugeführt und autoklaviert Wasser. Für jedes der 9 H. heilmannii
S.S. Stämme getestet, 5 Tieren intragastral 3-mal mit 300 ul einer Bakteriensuspension mit 2 Tagen Intervall inokuliert wurden. Drei Tiere wurden mit Brucella
broth (pH 5, Oxoid) inokuliert und dienten als negative Kontrollen. Die Inokulation wurde unter kurzen Isofluran-Narkose (2,5%) durchgeführt, unter Verwendung einer Kugelbestückte Sondennadel. Bei 9 Wochen nach der ersten Impfung wurden die Tiere durch zervikale Dislokation unter tief Isofluran-Narkose (5%) euthanasiert. Der Magen und das Duodenum jeder Gerbils wurden reseziert und die Proben wurden für die histopathologische Untersuchung und quantitative Echtzeit (RT) -PCR-Analyse entnommen.
Die in vivo-Experiment durch die Ethikkommission der Fakultät für Veterinärmedizin, Gent genehmigt wurde Universität, Belgien (EC 2011/090).
Histopathologie und Immunhistochemie
Ein Längsschnitt, vom Ende des Vorm beginnen und mit den Antrum und den Fundus des Magens und des Duodenums wurde entlang der Schnitt größere Krümmung und durch Standardverfahren in 10% Phosphat-gepuffertem Formalin verarbeitet fixiert und für die Lichtmikroskopie in Paraffin eingebettet. Drei aufeinanderfolgende Abschnitte von 5 &mgr; m geschnitten wurden. Nach Entparaffinierung und Hydratisierung Wärme induzierte Antigen-Retrieval wurde in Citratpuffer (pH 6) durchgeführt wird. endogene Peroxidase-Aktivität und unspezifische Reaktionen zu blockieren, wurden die Objektträger mit 3% H 2 O 2 in Methanol (5 min) und 30% Ziegenserum (30 min) inkubiert. Der erste Abschnitt wurde mit Hämatoxylin /Eosin (H & E) gefärbt, um die Intensität der Gastritis ein Tor nach dem aktualisierten Sydney-System [22], aber mit einigen Modifikationen, wie zuvor beschrieben [19]. (; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgien 25.1) auf dem zweiten Abschnitt wurde Epithelzellproliferation durch immunhistochemische Färbung unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-Ki67-Antikörper bestimmt. Sowohl im Antrum und Fundus: Ki67-positiven Epithelzellen wurden in 5 zufällig ausgewählte High Power Felder auf der Ebene der Magengruben (400-fache Vergrößerung) gezählt. Der Mittelwert der positiven Zellzahl wurde für jede Versuchsgruppe in beiden Magen Regionen berechnet
Parietal Zellen auf dem dritten Abschnitt durch immunhistochemische Färbung für die Protonen-Kalium-Pumpe unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörper (1/200 identifiziert wurden;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). Inkubation mit primären Antikörpern gegen Ki67 und Wasserstoff Kalium-ATPase wurde durch Inkubation mit HRP-markiertem sekundärem Antikörper (Envision Link-Maus-K4007, DakoCytomation, Heverlee, Belgien) zur Visualisierung gefolgt.
DNA-Extraktion und Quantifizierung von heilmannii H. kolonisieren
ss im Magen und Duodenum
Von jeder Gerbil, Proben aus dem Fundus und Antrum des Magens und des Zwölffingerdarms vom wurden entnommen. Gewebeproben wurden in 1 mL RNA später (Ambion, Austin, TE, USA) bei -70 ° C bis zur RNA- und DNA-Extraktion gelagert. Gewebeproben wurden homogenisiert (MagNALyser, Roche, Mannheim, Deutschland) und RNA und DNA wurden mittels RT TriReagent (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, USA) getrennt nach den Anweisungen des Herstellers. Die Anzahl der Kolonisierung H. heilmannii
S.S. pro mg Magengewebe in den DNA-Proben wurde unter Verwendung eines H. heilmannii
S.S.-spezifischen quantitativen RT-PCR. Für die Erzeugung der Standard-Teil des Genclusters
ureAB (1224 bp) von H. heilmannii
S.S. ASB1 wurde unter Verwendung von Primern und U430F U1735R amplifiziert, wie zuvor beschrieben [6]. Der Standard bestand aus 10-fach-Verdünnungen bei 10 beginnend 8 PCR-Produkte für jeweils 10 &mgr; l Reaktionsmischung. Ein ul der extrahierten DNA-Matrize wurde in einer 10 ul Reaktionsmischung suspendiert, bestehend aus 0,25 &mgr; l der beiden Primer innerhalb des 1224 bp-Fragment lokalisiert, ein 212 bp PCR Produkt (Sense-Primer zu ergeben: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', Antisense-Primer: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', Temper-Temperatur 58 ° C), 3,5 ul HPLC-Wasser und 5 ul SensiMix ™ SYBR No-ROX (Bioline Reagenzien Ltd , UK). Beide Standards und Proben wurden in doppelter Ausführung auf einem CFX96 ™ RT-PCR-System mit einem C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA, USA) durchgeführt. Die Bio-Rad CFX Manager (Version 1.6) Software wurde für die Berechnung von Schwellenzyklen (Ct) -Werte und Schmelzkurvenanalyse von amplifizierte DNA verwendet. Die Mittelwerte der Duplikate wurden für die Quantifizierung von H. heilmannii
S.S. verwendet DNA in den Gewebeproben.
RNA-Präparation und die Genexpression
Gesamt-RNA aus den Gewebeproben wurde unter Verwendung des Kit RNeasy Mini gereinigt (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Reinheit der RNA wurde durch Messen des Verhältnisses der Extinktion bei 260 nm und 280 nm mit Nanodrop gezeigt, die in allen Fällen ungefähr 2. Die RNA-Konzentration in jeder Probe wurde wurde auf 1 &mgr; g /&mgr; l cDNA und unmittelbar nach der RNA-Aufreinigung wurde synthetisiert unter Verwendung iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Aliquots der cDNA (1/5 Verdünnung) wurden zur Messung der Genexpression als Matrize für die quantitative RT-PCR verwendet. Die mRNA-Expressionsniveaus von verschiedenen Zytokinen (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ und TNF-α), Gastrin und H + /K + ATPase wurden quantifiziert. Die Housekeeping-Gene GAPDH, β-Actin
und HPRT
als Referenzgene enthalten waren. Primersequenzen sind in Tabelle 1 [23-28] gezeigt. Für alle Zielgene und Referenzgene waren die Primer Effizienzen zwischen 1,9 und 2,1. Reaktionen wurden in 10 &mgr; l Volumina, die 1 &mgr; l cDNA, 0,05 &mgr; l der beiden Primer, 3,9 &mgr; l HPLC-Wasser und 5 &mgr; l SensiMix ™ SYBR No-ROX durchgeführt. bei 95 ° C für 15 min Denaturierung, gefolgt von Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 20: Das experimentelle Protokoll für die PCR-Reaktion (40 Zyklen) wurde mit einem C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad) auf einem CFX96 ™ RT-PCR System durchgeführt s, Annealing bei 60 ° C für 30 s und Verlängerung bei 73 ° C für 30 s. Kontrollreaktionen ohne die Reverse-Transkriptase-Schritt wurden implementiert, um DNA-Kontamination der RNA-Proben auszuschließen. No-Template-Kontrollreaktionsgemische wurden eingeschlossen und alle Proben wurden doppelt durchgeführt. Die Ct-Werte wurden normalisiert auf das geometrische Mittel der Ct-Werte aus den drei Referenzgenen, wonach normalisierte mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung der 2 berechnet -ΔΔCt Methode [29] .Tabelle 1 Primerpaare.
Grundierungen
Sequenz (5 '→ 3')
Cytokine
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL- 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
Gastrin Gastrin
FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
Gastrin RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( Belegzellen)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
Referenz Gene
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-Actin-FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
β-Actin RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Primerpaare zur Messung die mRNA-Expressionsniveaus von IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ, TNF-α, Gastrin und H + /K + ATPase gezeigt. Die Housekeeping-Gene GAPDH, β-Actin
und HPRT
als Referenzgene enthalten waren. Die statistische Analyse
Normality und Varianzhomogenität von Daten
wurden unter Verwendung von Shapiro-Wilk Normalitätstest und Levene-Test auf Homogenität untersucht von Abweichungen. Gastritis Partituren, Kolonisation Kapazität und ATPase und Gastrin Genexpression wurden zwischen verschiedenen infizierten Gruppen und Kontrollen verglichen Kruskall-Wallis-Analyse, gefolgt von einem Mann-Whitney U
Test. Cytokin-Expression und die Anzahl der Ki67-positive Zellen wurden durch Varianzanalyse mit post hoc Test Bonferroni analysiert. Unterschiede waren statistisch signifikant betrachtet bei p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 Software (IBM) wurde für alle Analysen verwendet.
Ergebnisse | Infektion mit virulenten H. heilmannii
S.S. Stämme induziert eine Antrum-dominant chronische aktive Gastritis
Der Magen aller Kontrolltiere eine normale Histomorphologie (Abbildung 1a) zeigte. Die Entzündung im Magen von gerbils infiziert mit H. heilmannii
S.S. Stämme ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 und ASB14 durch eine chronische aktive Gastritis unter Bildung von lymphatischen Aggregaten in der Lamina propria und Submukosa des Antrums des Magens (Abbildung 1b) markiert wurde. Die Mukosadicke wurde leicht erhöht und nur wenige Neutrophile nachgewiesen. Im Gegensatz dazu H. heilmannii
S.S. Stämme ASB7 und ASB9 nicht explizit antralen Entzündung und nur eine leichte Zunahme der lymphatischen Zellzahl wurde in der Lamina propria des Antrums des Magens (Abbildung 1c) beobachtet verursacht hat. In allen H. heilmannii
S.S.-infizierten gerbils nur begrenzte Anzeichen einer Entzündung im Fundus des Magens nachgewiesen wurden (zusätzliche Datei 1). Die antralen Entzündung Werte jedes einzelnen Tieres sind in 2d gezeigt. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Entzündung Scores für mit ASB1 beimpft gerbils, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 und ASB14 im Vergleich mit der Kontrollgruppe nachgewiesen (Mann-Whitney-U
Test, p
< 0,05, Abbildung 2d). Abbildung 1 H & E-Färbung der Kieferhöhle eines Gerbil Magen. Normale Histologie des Antrum einer Sham-beimpft negativen Kontrolltier (a). Explicit lymphozytische Infiltration der Lamina propria und submucosa die mit der Bildung von lymphoiden Follikeln (Pfeile) im Antrum eines Gerbil inokuliert mit H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Leichte bis lymphatischer Infiltration (Pfeile) der Lamina propria in der Kieferhöhle eines Gerbil beimpft mit H. heilmannii
S.S. abwesend ASB7 (c). Bar = 30 &mgr; m.
2 Colonization Kapazität von H. heilmannii S.S. Stämme und Magenentzündung Score nach experimenteller Infektion. Colonization Kapazität wird als log10-Werte von H. heilmannii
S.S. gezeigt Bakterien pro mg Gewebe, mit quantitativer RT-PCR in den Fundus (a) und dem Antrum (c) des Magens und des Duodenum nachgewiesen (b). Ergebnisse unterhalb der Nachweisgrenze (log 2,39 Bakterien pro mg Gewebe) wurden eingestellt, wie 0. Antral Entzündung (d) auf einer Skala von 0 bis 4 (0 erzielt wurde: keine Infiltration mit einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen; 1: milde diffuse Infiltration mit einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen oder das Vorhandensein eines kleinen (50-200 Zellen) Aggregat von Entzündungszellen, 2: mäßige diffuse Infiltration mit einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen und /oder das Vorhandensein von 2-4 Entzündungs ​​Aggregate; 3: markiert diffuse Infiltration mit einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen und /oder das Vorhandensein von mindestens fünf Entzündungs ​​Aggregate; 4: diffuse Infiltration großer Regionen mit großen Aggregate von einkernigen und /oder polymorphkernige Zellen) .Individuelle Gerbils werden als Zahlen um den Mittelwert dargestellt ( Linien). Statistische signifikante Unterschiede im Vergleich zu Kontrolltieren werden durch * angegeben ist (Mann-Whitney U-Test
, p
< 0,05)
Kolonisationsfähigkeit von H. heilmannii
S.S.. Stämme im Magen und Duodenum
Nachweis von H. heilmannii
S.S. DNA mit quantitativer RT-PCR mit 9 Wochen nach der Infektion ergab, High-Level-Kolonisierung ASB1, ASB2, ASB3 und ASB6 im Magen (Abbildung 2a-c). Im Gegensatz dazu Kolonisierung ASB7, ASB11, ASB13 und ASB14 war eingeschränkteren während ASB9 nicht im Magen (2a-c) festgestellt wurde. Im Allgemeinen war die Kolonisierung Kapazität in den Fundus (2a) niedriger ist als in dem Antrum (Abbildung 2c) für alle getesteten Stämme und der geringsten Anzahl von Bakterien wurde in den Zwölffingerdarm (2b) detektiert. Darüber hinaus wurde ein klarer Zusammenhang zwischen der Kolonisation Kapazität des H. heilmannii
S.S. gesehen Stämme und die Magen-Entzündung Partituren im Antrum des Magens (2c-d).
Virulente H. heilmannii
S.S. Stämme verursachen GAVE Epithelzellvermehrung
Ergebnisse der Magen Epithelzellvermehrung scoring im Antrum des Magens sind in 3c gezeigt. (; 0,05, 3a-b ANOVA, p <
) signifikant höhere Anzahl von Ki67-positive proliferierenden Epithelzellen wurden in der Antrum ASB1- und ASB6-infizierten Gerbils, im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu sehen. Anzahlen von Ki67-positive Zellen wurden in ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- und ASB14-infizierten Gerbils moderat erhöht, wenn auch nicht statistisch signifikant. H. heilmannii
S.S. Stämme ASB7 und ASB9 keine Zunahme der Magen Epithelzellvermehrung verursachen. (; 0,05 ANOVA, p <
) zusätzlich deutlich höhere Zahl von proliferierenden Epithelzellen wurden in der Antrum ASB1-, ASB2- und ASB6-infizierten Gerbils verglichen mit gerbils infiziert mit ASB7 und ASB9 demonstriert. Abbildung 3 GAVE epithelialen Zellproliferation. Ki67-Färbung des Antrums eines Gerbil beimpft mit H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) eine höhere Anzahl an proliferierenden Epithelzellen im Vergleich zu einer Schein inokuliert negativen Kontrolltier zeigt (a). (400-fache Vergrößerung) im Antrum des Gerbils Magen (c) Die Rate der epithelialen Zellproliferation wurde durch Zählen der Ki67-positiven Epithelzellen in 5 zufällig ausgewählten High Power Felder auf der Ebene der Magengrübchen bestimmt. Die mittlere Anzahl von Ki67-positive Zellen werden in jeder Versuchsgruppe gezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen H. heilmannii
S.S. geimpften und Kontrolltiere sind mit * gekennzeichnet (ANOVA, p
< 0,05). Signifikante Unterschiede im Vergleich zu ASB7 und ASB9 beimpft Gruppen angegeben werden durch + und # bzw. (ANOVA, p
< 0,05).
Im Fundus aller H. heilmannii
ss-infizierten gerbils, die epitheliale Zellproliferation war Rate höher nicht signifikant im Vergleich zu den Kontrolltieren (Weitere Datei 2).
Zytokin-Genexpression im Magen als Reaktion auf H. heilmannii
ss Infektion
Die lokale Immunantwort des Wirts gegen H. heilmannii
S.S. Infektion wurde durch Messen der mRNA Expression von IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 und TNF-α in den Magen des gerbils gekennzeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und in Figur 2 4.Table Die statistische Analyse der mRNA-Expressionsniveaus gezeigt.
Antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPase
Gastrin
mittlere Ct-Ctrefa
p-WertB
Mittlere ct-Ctref
p-Wert
mittlere ct-Ctref
p-Wert
mittlere ct-Ctref
p-Wert
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1.000
3,70 ± 2,11 *
0.050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0.231
8,15 ± 1,26
1.000
2,42 ± 5,01
0.513
5,94 ± 2,49 *
0.050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1.000
3,49 ± 2,28 *
0.050
7,71 ± 1,17
0.101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1.000
2,23 ± 1.99 *
0.050
5,33 ± 2,39 *
0.025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
1.000
0,45 ± 2,51
0.724
7,12 ± 1,54
0.180
ASB9
9,03 ± 2,54
1.000
8,55 ± 0,71
1.000
0,79 ± 0,03
0.564
8,11 ± 1,58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15
0.499
10,45 ± 0,95 *
0,004
1,32 ± 1,45
0.248
7,67 ± 1,25
0.289
ASB13
7,72 ± 1,17
0.523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ±
0,34 0,083
8,10 ± 0,93
0.456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1.000
3,81 ± 3.11
0,127
7,77 ± 2,96
0.881
Negative Kontrolle
9,71 ± 1,13
- 7,08 ± 0,65
- 0,15 ± 1,82
- 8,70 ± 0,62
- gezeigt, um die statistische Analyse von IL-1β, IFN-γ und H + /K + ATPase-mRNA-Expression in der Kieferhöhle und Gastrin-mRNA-Expression in den Fundus des Gerbils Magen bei 9 Wochen nach der experimentellen Infektion. Zytokin-Expression wurde durch Analyse der Varianz mit einer Bonferroni post hoc Test analysiert. H + /K + ATPase und Gastrin Genexpression wurden zwischen verschiedenen infizierten Gruppen und Kontrollen verglichen Kruskall-Wallis-Analyse, gefolgt von einem Mann-Whitney U
Test. Unterschiede waren statistisch signifikant betrachtet bei p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 Software (IBM) wurde für alle Analysen verwendet
eine mittlere Ct-Ctref. Für jede Versuchsgruppe, der Mittelwert der normalisierten Ct-Werte ± Standardabweichung gezeigt werden
bp
-Wertes. : die sind genau p
-Werten gegeben
* Statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollgruppe (p
≤ 0,05) 4 mRNA Expression von Zytokinen IL-1β und Abbildung
IFN-.. gamma im Antrum des Magens. Zytokin-mRNA-Expressionsniveaus in den Fundus und Antrum des Magens wurden durch quantitative RT-PCR untersucht. Expression von IL-1β (a) und IFN-γ (b) im Antrum gezeigt. Die Daten sind als fache Änderung der Genexpression normalisiert auf 3 Referenzgenen und relativ zu der negativen Kontrollgruppe dargestellt, die betrachtet wird als 1. Die Daten sind als Mittel + Standardabweichung dargestellt. Signifikante Unterschiede in Expressionsniveau zwischen geimpften Gruppen und negative Kontrollgruppe sind mit * p <
angegeben; 0,05 (ANOVA).
Die pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β ist ein potenter Inhibitor der Magensäuresekretion [30] und spielt eine Rolle in der akuten Phase der Entzündung [31]. Expression von IL-1β wurde mit H. im Antrum des Magens von Gerbils infiziert hochreguliert heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 und ASB14, im Vergleich zu den negativen Kontrolltieren (Abbildung 4a). Für Gerbils mit ASB7 und ASB9 inokuliert, keine Hochregulierung von IL-1β beobachtet wurde.
Die Th1 Zytokin IFN-γ, eine Signaturmarkierung des Th1-polarisierte Reaktion [24, 32], zeigte eine verminderte Expression in der Antrum gerbils mit ASB11 und ASB13 (Abbildung 4b) infiziert sind, im Vergleich zu den Kontrolltieren.
keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen infizierten und geimpften Schein gerbils konnte für IL-5, IL-6, IL-10, beobachtet werden IL-12p40, IL-17 und TNF-α.
parietal Zelle H + /K + ATPase mRNA-Expression in Reaktion nach unten geregelt mit H. Besiedlung heilmannii
ss
keine klaren Verlust von Belegzellen sein könnte durch immunhistochemische Färbung im Fundus und Antrum des H. visualisiert heilmannii
ss-infizierten Gerbils verglichen mit den nicht-infizierten Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Jedoch zeigte quantitative RT-PCR eine deutliche Abnahme bei der Expression von Magen-H + /K + ATPase im Antrum der infizierten gerbils mit ASB1, ASB3 und ASB6 (Abbildung 5 und Tabelle 2). Im Vergleich zu den Kontrolltieren mit Ebenen-mRNA-Expression auf 1,0, die mittlere relative Ausdruck betrug 0,09 ± 2,11 für ASB1-, 0,10 ± 2,28 für ASB3- und 0,24 ± 1,99 für ASB6-infizierten gerbils sind. Keine signifikante Veränderung der Expression wurde in den Fundus der heilmannii H. gesehen
S.S.-infizierten gerbils. Figur 5 mRNA Expression von H + /K + ATPase im Antrum des Magens. Wasserstoff Kalium-ATPase mRNA-Expressionsniveau in den Magen wurde durch quantitative RT-PCR untersucht. H + /K + ATPase mRNA Expressionsniveau im Antrum gezeigt. Die Daten sind als fache Änderung der Genexpression normalisiert auf 3 Referenzgenen und relativ zu der negativen Kontrollgruppe dargestellt, die betrachtet wird als 1. Die Daten sind als Mittel + Standardabweichung dargestellt. Signifikante Unterschiede in Expressionsniveau zwischen geimpften Gruppen und negative Kontrollgruppe von * p angegeben
≤ 0,05 (Mann-Whitney-U-
-Test).
Virulente H. heilmannii
S.S. Stämme induzieren erhöhte Expression Gastrin im Fundus
Das Peptidhormon Gastrin, die Sekretion von Magensäure durch Belegzellen stimuliert. Eine Störung in seinem Ausdruck kann zu Hypergastrinämie führen. Die Expression von Gastrin war stark hochreguliert im Fundus von Gerbils mit ASB2 und ASB6 bei 9 Wochen nach der Infektion (Figur 6 und Tabelle 2) infiziert. Im Vergleich zu den Kontrolltieren war die mittlere relative Expression 6,79 ± 2,49 für ASB2- und 10,35 ± 2,39 für ASB6-infizierten Gerbils. Im Antrum des Magens, keine Hochregulierung von Gastrin-Expression wurde nachgewiesen. Figur 6 mRNA Expression von Gastrin im Fundus des Magens. Gastrin-mRNA-Expressionsniveau in den Magen wurde durch quantitative RT-PCR untersucht. Dargestellt ist das Expressionsniveau im Fundus. Die Daten sind als fache Änderung der Genexpression normalisiert auf 3 Referenzgenen und relativ zu der negativen Kontrollgruppe dargestellt, die betrachtet wird als 1. Die Daten sind als Mittel + Standardabweichung dargestellt. Signifikante Unterschiede in Expressionsniveau zwischen geimpften Gruppen und negative Kontrollgruppe sind mit * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney-U-
-Test).
Diskussion
Um 9 Wochen nach der Impfung, um eine chronische aktive Gastritis angezeigt im Antrum des Magens wurde in gerbils experimentell infiziert mit 7 von 9 H. heilmannii beobachtet
ss in dieser Studie untersuchten Stämmen (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 und ASB14). Die Lamina propria und submucosa wurden massiv mit Lymphozyten infiltriert, bei der Bildung von lymphoiden Follikeln führt. Die H. heilmannii
S.S. Stämme wurden hauptsächlich im Antrum und in geringerem Maße auch in den Fundus und Duodenum nachgewiesen. Bei Menschen mit NPSH infiziert, Kolonisierung und Entzündungen kommen auch vor allem in der Antrum des Magens [5, 33-35]. Dies bestätigt, dass Mongolische Rennmäuse ein geeignetes Modell zu studieren H. heilmannii
S.S. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Genomsequenzanalyse von Helicobacter pylori-Stämme im Zusammenhang mit Magengeschwüren und Magenkrebs
• Die antimikrobielle Aktivität, die akute Toxizität und zytoprotektive Wirkung von Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore Extrakt in einem Ratten-Ethanol-HCl Magengeschwür-Modell