Diversiteit in bacterie-gastheer interacties binnen de soort Helicobacter heilmannii sensu stricto

Diversiteit in bacterie-gastheer interacties binnen de soort Helicobacter heilmannii
sensu stricto
De abstracte Helicobacter (H.) heilmannii
sensu stricto (ss) is een zoönotische bacterie die van nature koloniseert de maag van honden en katten . Bij mensen is dit micro-organisme geassocieerd met gastritis, maagzweren en mucosa geassocieerde lymfoïde weefsel (MALT) lymfomen. Weinig informatie beschikbaar is over de pathogenese van H. heilmannii
S.S. infecties in mensen en het is niet bekend of de verschillen in virulentie bestaan ​​binnen deze soort. Daarom werd een Mongoolse gerbil model gebruikt om bacterie-gastheer interacties van 9 H. heilmannii
S.S. bestuderen stammen. Het kolonisatievermogen van de stammen, de intensiteit van gastritis en genexpressie van verschillende inflammatoire cytokines in de maag werden bij 9 weken na experimentele infectie. De inductie van een antrum-dominante chronische actieve gastritis met de vorming van lymfatische aggregaten werd aangetoond voor 7 stammen. High-level antrale kolonisatie werd gezien 4 stammen, terwijl kolonisatie van 4 andere stammen was beperkter en één stam werd niet gedetecteerd in de maag 9 weken na infectie. Alle stammen induceren van een chronische actieve gastritis veroorzaakt een opregulatie van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β in het antrum. Een verlaagde expressie van antrale H + /K + ATPase werd waargenomen in de maag na infectie met 3 zeer kolonisatie stammen en 2 zeer koloniseren spanningen die een verhoogde gastrine expressie in de fundus. In geen van de H. heilmannii
s.s.-geïnfecteerde groepen, IFN-γ expressie werd opgereguleerd. Deze studie toont aan diversiteit in bacterie-gastheer interacties binnen de soort H. heilmannii
S.S. en dat de pathogenese van maag infecties met dit micro-organisme is niet identiek aan die van de H. pylori-infectie
.
Inleiding
Helicobacter (H.) pylori
is de meest voorkomende soorten Helicobacter
koloniseert het maagslijmvlies van de mens en is geassocieerd met gastritis, maagzweren en maagkanker [1-3]. Naast H. pylori
, andere morfologisch onderscheiden non-H. Helicobacter pylori
(NHPh) soorten, ook wel H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] zijn geassocieerd met maagklachten bij mensen [5-10]. NHPh vertegenwoordigt een groep van nauw verwante maar verschillende soorten bacteriën, vooral te vinden in verschillende diersoorten, zoals de H. felis
, H. Salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
sensu stricto (ss), H. cynogastricus Kopen en H. baculiformis
bij honden en katten en H. suis
bij varkens [5, 7, 10-15]. Deze micro-organismen worden gekenmerkt door hun zeer veeleisende aard, die tot nu toe heeft geresulteerd in een beperkt aantal in vitro isolaten wereldwijd beschikbaar.
H. heilmannii
S.S. is pas onlangs geïsoleerd en gekweekt in vitro [16]. Er werd vastgesteld bij wilde katten en humane gastrische biopten, maar wordt meestal gevonden in de gastrische mucosa van katten en honden met een prevalentie van 20 tot 100% [5-7, 10, 12]. Hoewel deze bacterie is geassocieerd met chronische actieve gastritis bij honden en katten [12], de pathogene betekenis raadselachtig blijft en waarschijnlijk stamafhankelijk. Bij mensen, H. heilmannii
S.S. is aangetroffen in 8-19% van gastrische biopten met histologisch bewijs van infectie NHPh [5, 8, 10]. Infectie met deze bacterie bij de mens is geassocieerd met gastritis, maagzweren en mucosa geassocieerde lymfoïde weefsel (MALT) lymfomen [5, 8, 10, 17, 18]. Verschillende
infectie studies bij experimentele diermodellen uitgevoerd om onderzoek naar de pathogenese van H. pylori
infecties bij mensen. In contrast, weinig informatie beschikbaar te maken met de pathogenese van H. heilmannii
S.S. infecties bij mensen. Deze bacterie werd vermeerderd in muizen gedurende maximaal 28 maanden en kon MALT lymfoom induceren in de magen van deze dieren [18]. Maar in dit muizenexperiment, gehomogeniseerd maagweefsel werd gebruikt als inoculum. Dit betekent dat andere micro-organismen met H. heilmannii
S.S., waarvan de resultaten kunnen beïnvloeden werden geïnoculeerd, zoals eerder is [19] beschreven. Dus beter inzicht in de pathogenese van menselijke maag ziekte geassocieerd met H. heilmannii
S.S. verkrijgen experimentele infectie studies met zuivere kweken van deze micro-organismen essentieel. Daarom was het doel van het huidige onderzoek naar de bacterie-gastheer interacties van 9 H. heilmannii
S.S. bestuderen stammen, geïsoleerd uit het maagslijmvlies van verschillende katten. De Mongoolse gerbil model is eerder aangetoond dat een bruikbaar diermodel Helicobacter gerelateerde
maagproblemen van mens bestuderen en werd daarom gebruikt in de onderhavige studie [19-21].
Materialen en methoden Bacteriële
stammen
Negen stammen van H. heilmannii
ss werden verkregen van het maagslijmvlies van verschillende katten en aangewezen ASB1 (= type stam, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 en ASB14. Bacteriën werden gekweekt op bifasische Brucella
agarplaten (Oxoid, Basingstoke, UK) aangevuld met 20% (v /v) foetaal kalfsserum (HyClone, Logan, UT, USA), 5 mg /L amphothericin B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, New York, USA), Skirrow (Oxoid, bevat 10 mg /l vancomycine, 5 mg /L trimethoprim lactaat en 2500 U /L polymyxine B), Vitox supplement (Oxoid) en 0,05% HCl (pH 5). Na incubatie onder microaerobic omstandigheden (85% N 2, 10% CO 2, 5% O 2; 37 ° C), werden de bacteriën geoogst en de eindconcentratie werd ingesteld op 7 x 10 8 levende bacteriën /ml, zoals bepaald door het tellen in een Neubauer telkamer
dieren, huisvesting en experimentele procedure
Specifieke pathogeenvrije (SPF) vrouwelijke vijf weken oude Mongoolse gerbils (CRL. MON (Tum), n
= 48) werden verkregen van Charles River Laboratories (Lille, Frankrijk). De dieren werden gehuisvest in filter top kooien (1500 cm 2) op geautoclaveerd houtkrullen en geautoclaveerd hooi. Ze werden ad libitum een ​​geautoclaveerd commerciële dieet (Teklad 2018S, met 18% eiwit; Harlan, Nederland) en geautoclaveerd water. Voor elk van de 9 H. heilmannii
S.S. geteste stammen, 5 dieren werden intragastrisch 3 maal geïnoculeerd 2 dagen interval 300 pl van een bacteriële suspensie. Drie dieren werden ingeënt met Brucella
bouillon (pH 5, Oxoid) en dienden als negatieve controles. Inoculatie werd uitgevoerd onder korte isofluraananesthesie (2,5%) met een kogel getipt sondenaald. 9 weken na de eerste inoculatie werden de dieren gedood door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie met isofluraan (5%). De maag en de twaalfvingerige darm van elk gerbil werden weggesneden en monsters werden genomen voor histopathologisch onderzoek en kwantitatieve real-time (RT) -PCR analyse. Ondernemingen De in vivo experiment werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Faculteit Diergeneeskunde, Gent University, België (EC 2011/090).
histopathologie en immunohistochemie
een langsdoorsnede, gerekend vanaf het einde van de voormaag en omvattende antrum en de fundus van de maag en een deel van het duodenum, werd gesneden langs de grotere kromming en gefixeerd in 10% fosfaat gebufferde formaline, verwerkt door standaardwerkwijzen en ingebed in paraffine voor lichtmicroscopie. Drie opeenvolgende secties van 5 urn werden gesneden. Na deparaffinisatie en hydratatie, werd warmte-geïnduceerde antigen herstel uitgevoerd in citraatbuffer (pH 6). Endogene peroxidase activiteit en niet-specifieke reacties te blokkeren, werden objectglaasjes geïncubeerd met 3% H 2O 2 in methanol (5 min) en 30% geitenserum (30 min), respectievelijk. Het eerste deel werd gekleurd met hematoxyline /eosine (H &E) voor de intensiteit van de gastritis score volgens de Bijwerken Sydney System [22], maar met enkele wijzigingen zoals eerder beschreven [19]. Op het tweede deel, werd epitheelcelproliferatie bepaald door immunohistochemische kleuring met een muis monoklonaal anti-Ki67 antilichaam (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, België). Ki67-positieve epitheelcellen werden geteld in 5 willekeurige hoge krachtvelden op het niveau van de gastrische putten (vergroting: 400 x), zowel in antrum en fundus. Het gemiddelde van de positieve cellen werd berekend voor elke experimentele groep in beide regio
maag pariëtale cellen werden geïdentificeerd aan het derde gedeelte van immunohistochemische kleuring voor waterstof kalium ATPase een muis monoklonaal antilichaam (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, UK). Incubatie met primaire antilichamen gericht tegen Ki67 en waterstof kalium ATPase werd gevolgd door incubatie met een HRP-gelabeld secundair antilichaam (Envision Link Mouse K4007, DakoCytomation, Heverlee, België) voor visualisatie.
DNA-extractie en kwantificering van het koloniseren H. heilmannii
ss in de maag en het duodenum
Uit elke woestijnrat, werden monsters van de fundus en het antrum van de maag en het duodenum genomen. Weefselmonsters werden bewaard in 1 mL later RNA (Ambion, Austin, TE, USA) bij -70 ° C tot RNA- en DNA-extractie. Weefselmonsters werden gehomogeniseerd (MagNALyser, Roche, Mannheim, Duitsland) en RNA en DNA werden gescheiden met TriReagent RT (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Het aantal koloniserende H. heilmannii
S.S. per mg maagweefsel werd bepaald in DNA monsters met een H. heilmannii
s.s.-specifieke kwantitatieve RT-PCR. Voor het genereren van de standaard, deel van de ureAB
gencluster (1224 bp) van H. heilmannii
S.S. ASB1 werd geamplificeerd met behulp van primers U430F en U1735R, zoals eerder beschreven [6]. De standaard bestond uit 10-voudige verdunningen beginnend bij-10 8 PCR amplicons per 10 gl reactiemengsel. Eén pi van geëxtraheerde DNA-matrijs werd in een 10 gl reactiemengsel bestaande uit 0,25 pi van beide primers in het 1224 bp fragment, een 212 bp PCR product (sense primer: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', antisense-primer: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG GCA ATG TCC AAG-3', annealing temperatuur 58 ° C), 3,5 gl HPLC water en 5 ui SensiMix SYBR ™ No-ROX (Bioline Ltd Reagents , UK). Beide standaarden en monsters werden in duplo op een CFX96 ™ RT-PCR-systeem met C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA, USA). De Bio-Rad CFX Manager (versie 1.6) software werd gebruikt voor de berekening van de drempelwaarde cycli (Ct) -waarden en smeltcurve analyse van geamplificeerd DNA. De gemiddelde waarden van de duplo werden gebruikt voor het kwantificeren van H. heilmannii
S.S. DNA in de weefselmonsters.
RNA bereiding en genexpressie
Totaal RNA uit de weefselmonsters, werd gezuiverd met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Zuiverheid RNA werd aangetoond door meting van de verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm NanoDrop die in alle gevallen ongeveer 2. De RNA-concentratie in elk monster werd ingesteld op 1 ug /ul en cDNA werd gesynthetiseerd onmiddellijk na zuivering met gebruik van RNA iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Hoeveelheden van cDNA (1/5 verdunning) werden gebruikt als template voor kwantitatieve RT-PCR voor het meten van genexpressie. Het mRNA expressieniveaus van verschillende cytokinen (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ en TNF-α), gastrine en H + /K + ATPase werden gekwantificeerd. De huishoudelijke genen GAPDH, β-actine Kopen en HPRT
werden opgenomen als referentie genen. Primersequenties worden getoond in Tabel 1 [23-28]. Voor alle doelgenen en vindplaats genen, de primer efficiënties waren tussen 1,9 en 2,1. Reacties werden uitgevoerd in 10 ul volume met 1 pi cDNA, 0,05 pl van beide primers, 3,9 gl HPLC water en 5 ui SensiMix SYBR ™ No-ROX. Het experimentele protocol voor PCR-reactie (40 cycli) werd uitgevoerd op een CFX96 ™ RT-PCR-systeem met C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad): denaturatie gedurende 15 minuten bij 95 ° C, gevolgd door amplificatie cycli bij 95 ° C gedurende 20 s, hybridisatie bij 60 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 73 ° C gedurende 30 s. Controlereacties zonder reverse transcriptase stap werd uitgevoerd om DNA verontreiniging van de RNA monsters uitgesloten. No-template-control reactiemengsels werden opgenomen en alle monsters werden uitgevoerd in tweevoud. De Ct-waarden werden genormaliseerd op het geometrische gemiddelde van de Ct-waarden van de referentie 3 genen, waarna genormaliseerde mRNA niveaus werden berekend met de 2 -ΔΔCt methode [29] .table 1 Primerparen.
Primers
Sequence (5 '→ 3')
Cytokinen
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA CAG AGC AGC CAT TCA GAG
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
IFN-γ RV24
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
Gastrine
Gastrine FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
Gastrine RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( pariëtale cellen)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
Reference genen
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
GAPDH RV26
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actine FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
β-actine RV28
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Primer paren gebruikt voor het meten de mRNA expressie van IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ, TNF-α, gastrine en H + /K + ATPase getoond. De huishoudelijke genen GAPDH, β-actine Kopen en HPRT
werden opgenomen als referentie genen.
Statistische analyse
Normaliteit en variantie homogeniteit van de gegevens werden geanalyseerd met behulp van Shapiro-Wilk normaliteit testen en testen Levene voor homogeniteit van afwijkingen. Gastritis scores, kolonisatie capaciteit en ATPase en gastrine genexpressie vergeleken tussen verschillende geïnfecteerde groepen en controles met behulp Kruskall-Wallis analyse, gevolgd door Mann-Whitney U Electronics Test. Cytokine expressie en het aantal Ki67-positieve cellen werden geanalyseerd met variantieanalyse met Bonferroni post hoc-test. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij p ≤ 0,05
. SPSS Statistics 21 software (IBM) werd gebruikt voor alle analyses.
Resultaten
infectie met virulente H. heilmannii
S.S. stammen induceert een antrum-dominante chronische actieve gastritis
De maag van alle controle dieren vertoonden een normale histomorphology (figuur 1a). Ontsteking in de maag van gerbils geïnfecteerd met H. heilmannii
S.S. stammen ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 en ASB14 werd gekenmerkt door een chronische actieve gastritis met de vorming van lymfatische aggregaten in de lamina propria en submucosa van het antrum van de maag (figuur 1b). De mucosale dikte was enigszins verhoogd en slechts enkele neutrofielen werden gedetecteerd. Daarentegen H. heilmannii
S.S. stammen ASB7 en ASB9 heeft expliciet antrale ontsteking en slechts een lichte verhoging van lymfocytische celaantal werd waargenomen in de lamina propria van het antrum van de maag (figuur 1c) veroorzaken. In alle H. heilmannii
s.s. geïnfecteerde gerbils, beperkt ontstekingsverschijnselen werden gedetecteerd in de fundus van de maag (aanvullende bestandsinformatie 1). De antrale ontsteking scores van elk individueel dier worden getoond in figuur 2d. Een statistisch significant verschil tussen ontsteking scores voor gerbils geïnoculeerd met ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 en ASB14 vergelijking met de controlegroep werd aangetoond (Mann-Whitney U Electronics Test, p
< 0,05, figuur 2d). Figuur 1 H &E kleuring van het antrum van de maag gerbil. Normale histologie van het antrum van een schijn-geïnoculeerde negatieve controle dier (a). Expliciete lymfocytische infiltratie van de lamina propria en de submucosa onder vorming van lymfoïde follikels (pijlen) in het antrum van een gerbil geïnoculeerd met H. heilmannii
S.S. ASB1 (b). Milde tot lymfocytische infiltratie (pijlen) van de lamina propria afwezig in het antrum van een gerbil ingeënt met H. heilmannii
S.S. ASB7 (c). Bar = 30 urn Figuur 2 Colonization capaciteit van.
H. heilmannii S.S. stammen en maagontsteking score na experimentele infectie. Kolonisatie capaciteit wordt weergegeven als log10-waarden van H. heilmannii
S.S. bacteriën per mg weefsel gedetecteerd met kwantitatieve RT-PCR in de fundus (a) en het antrum (c) van de maag en de twaalfvingerige darm (b). Resultaten onder de detectielimiet (2,39 log bacteriën per mg weefsel) werden als 0. Antral ontsteking (d) werd gescoord op een schaal van 0 tot 4 (0: geen infiltratie met mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen; 1: milde diffuse infiltratie met mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen of de aanwezigheid van een kleine (50-200 cellen) aggregaat van ontstekingscellen; 2: matige diffuse infiltratie met mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen en /of de aanwezigheid van 2-4 inflammatoire pellet; 3: gemarkeerd diffuse infiltratie met mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen en /of de aanwezigheid van ten minste vijf inflammatoire aggregaten; 4: diffuse infiltratie van grote gebieden met grote aggregaten van mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen) .Individual gerbils afgebeeld als gegevens rond het gemiddelde ( lijnen). Statistisch significante verschillen ten opzichte van de dieren te controleren, zijn aangegeven met * (Mann-Whitney U
test, p Restaurant < 0,05)
Colonization capaciteit van H. heilmannii
S.S.. stammen in de maag en de twaalfvingerige darm
Detectie van H. heilmannii
S.S. DNA met kwantitatieve RT-PCR op 9 weken na infectie bleek hoog niveau van kolonisatie ASB1, ASB2, ASB3 en ASB6 in de maag (Figuur 2a-c). Daarentegen kolonisatie van ASB7, ASB11, ASB13 en ASB14 was beperkt terwijl ASB9 niet in de maag (Figuur 2a-c) gedetecteerd. In het algemeen, de kolonisatie capaciteit van de fundus (Figuur 2a) was lager dan in het antrum (figuur 2c) voor alle geteste stammen en het laagste aantal bacteriën werd gedetecteerd in het duodenum (Figuur 2b). Daarnaast werd een duidelijk verband zien tussen de kolonisatie capaciteit van de H. heilmannii
S.S. stammen en de maagontsteking scores in het antrum van de maag (figuur 2c-d).
Virulent H. heilmannii
S.S. stammen veroorzaken maag antrale epitheelcelproliferatie
Resultaten van de maag epitheelcelproliferatie scoren in het antrum van de maag zijn weergegeven in figuur 3c. Aanzienlijk hogere aantallen Ki67-positieve prolifererende epitheelcellen werden waargenomen in het antrum van ASB1- en ASB6 geïnfecteerde gerbils, vergeleken met de controlegroep (ANOVA, p
< 0,05, Figuur 3a-b). Aantallen Ki67-positieve cellen werden matig verhoogd ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- en ASB14 geïnfecteerde gerbils, hoewel niet statistisch significant. H. heilmannii
S.S. stammen ASB7 en ASB9 heeft een toename van gastrische epitheelcelproliferatie veroorzaken. Bovendien werden significant hogere aantallen prolifererende epitheelcellen aangetoond in het antrum van ASB1-, ASB2- en ASB6-geïnfecteerde gerbils, vergeleken met gerbils geïnfecteerd met ASB7 en ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figuur 3 Gastric antrale epitheelcel proliferatie. Ki67 kleuring van het antrum van een gerbil geïnoculeerd met H. heilmannii
S.S. ASB1 (b) met een groter aantal prolifererende epitheelcellen vergelijking met sham-geïnoculeerde negatieve controle dier (a). De snelheid van epitheliale celproliferatie werd bepaald door het tellen Ki67-positieve epitheelcellen in 5 willekeurige hoge krachtvelden op het niveau van de gastrische putten (vergroting: 400 x) in het antrum van de maag gerbil (c). Het gemiddelde aantal Ki67-positieve cellen worden in elke experimentele groep. Significante verschillen tussen H. heilmannii
S.S.-geënt en controle dieren worden aangegeven met * (ANOVA, p Restaurant < 0,05). Significante verschillen in vergelijking met ASB7 en ASB9 geënte groepen worden aangeduid met + en # respectievelijk (ANOVA, p Restaurant < 0,05).
In de fundus van alle H. heilmannii
-ss besmet gerbils, de epitheliale celproliferatiesnelheid niet significant hoger dan in controledieren (aanvullende bestandsinformatie 2).
Cytokine genexpressie in de maag als reactie op H. heilmannii
ss infectie
De lokale host immuunrespons tegen H. heilmannii
S.S. infectie gekenmerkt door meten van de mRNA-expressie van IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 en TNF-α in de maag van de gerbils. Resultaten worden getoond in tabel 2 en in figuur 2 4.Table Statistische analyse van mRNA expressieniveaus.
Antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPase
Gastrine
Mean Ct-Ctrefa
p-waarde B
Mean Ct-Ctref
p-waarde
gemiddelde Ct-Ctref
p-waarde
gemiddelde Ct-Ctref
p-waarde
ASB1
6.92 ± 0.29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1,000
3.70 ± 2.11 *
0.050
7.20 ± 1.68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8.15 ± 1.26
1,000
2.42 ± 5.01
0,513
5.94 ± 2.49 *
0.050
ASB3
6.55 ± 0.80 *
0.008
7.54 ± 0.37
1,000
3.49 ± 2.28 *
0.050
7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6.12 ± 0.67 *
0.001
7.99 ± 0.90
1,000
2,23 ± 1,99 *
0.050
5.33 ± 2.39 *
0.025
ASB7
10.25 ± 0.37
1.000
7.98 ± 0.52
1,000
0.45 ± 2.51
0,724
7.12 ± 1.54
0.180
ASB9
9.03 ± 2.54
1,000
8.55 ± 0.71
1.000
0.79 ± 0.03
0,564
8.11 ± 1.58
1,000
ASB11
7.47 ± 0.15
0,499
10.45 ± 0.95 *
0.004
1.32 ± 1.45
0,248
7.67 ± 1.25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9.54 ± 1.55 *
0,044
3,80 ± 0.34
0,083
8.10 ± 0.93
0,456
ASB14
7.07 ± 0.52
0,054
8.51 ± 0.97
1,000
3.81 ± 3.11
0,127
7.77 ± 2.96
0,881
Negatieve controle
9.71 ± 1.13
- 7.08 ± 0.65
- 0,15 ± 1,82
- 8,70 ± 0,62 -
getoond wordt de statistische analyse van IL-1β, IFN-γ en H + /K + ATPase mRNA expressie in het antrum en gastrine mRNA expressie in de fundus van de maag gerbil op 9 weken na experimentele infectie. Cytokine-expressie werd geanalyseerd door analyse van de variantie met een Bonferroni post hoc-test. H + /K + ATPase en gastrine genexpressie vergeleken tussen verschillende geïnfecteerde groepen en controles met behulp Kruskall-Wallis analyse, gevolgd door Mann-Whitney U Electronics Test. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij p ≤ 0,05
. SPSS Statistics 21 software (IBM) werd gebruikt voor alle analyses
gemiddelde Ct-Ctref. Voor elke experimentele groep, het gemiddelde van de genormaliseerde Ct-waarden ± standaarddeviatie worden weergegeven
bp
-waarde. : de exacte p-waarden
worden gegeven
* statistisch significante verschillen ten opzichte van de niet-geïnfecteerde controlegroep (p
≤ 0,05)
Figuur 4 mRNA expressie niveaus van cytokines IL-1β en IFN.. y in het antrum van de maag. Cytokine mRNA expressieniveaus in de fundus en het antrum van de maag werden onderzocht met kwantitatieve RT-PCR. Expressieniveaus van IL-1β (a) en IFN-γ (b) in het antrum getoond. Gegevens zijn weergegeven als voudige verandering in genexpressie genormaliseerd tot 3 referentie genen en vergelijking met de negatieve controlegroep wordt beschouwd als 1. Gegevens worden getoond als gemiddelde ± standaarddeviatie. Significante verschillen in expressie tussen geënte groepen en negatieve controlegroep zijn aangegeven met * p
< 0,05 (ANOVA). Ondernemingen De pro-inflammatoire cytokine IL-1β is een krachtige remmer van maagzuurafscheiding [30] en speelt een rol in de acute fase van ontsteking [31]. Expressie van IL-1β werd up-gereguleerd in het antrum van de maag van gerbils geïnfecteerd met H. heilmannii
S.S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 en ASB14, in vergelijking met de negatieve controle dieren (figuur 4a). Voor gerbils geïnoculeerd met ASB7 en ASB9 geen up-regulatie van IL-1β waargenomen. Ondernemingen De Th1 cytokine IFN-γ, een handtekening markering van de Th1-gepolariseerde respons [24, 32], vertoonde een verminderde expressie in de antrum gerbils geïnfecteerd met ASB11 en ASB13 (figuur 4b), vergeleken met de controledieren. verhuur No significante verschillen in expressie tussen geïnfecteerde en sham geïnoculeerd gerbils kan worden waargenomen voor IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 en TNF-α.
pariëtale cellen H + /K + ATPase mRNA expressie wordt neerwaarts gereguleerd als reactie op kolonisatie met H. heilmannii
ss verhuur No duidelijk verlies van pariëtale cellen kunnen worden gevisualiseerd door immunohistochemische kleuring in de fundus en het antrum van de H. heilmannii
ss-geïnfecteerde gerbils vergeleken met de niet-geïnfecteerde controles (gegevens niet getoond). Echter, kwantitatieve RT-PCR toonde een duidelijke afname in de expressie van maag-H + /K + ATPase in het antrum van de gerbils geïnfecteerd met ASB1, ASB3 en ASB6 (Figuur 5 en Tabel 2). In vergelijking met de controledieren met mRNA expressieniveaus ingesteld op 1,0, de gemiddelde relatieve expressie was 0,09 ± 2,11 voor ASB1-, 0,10 ± 2,28 voor ASB3- en 0,24 ± 1,99 voor ASB6 geïnfecteerde gerbils, respectievelijk. Geen significante verandering in expressie werd waargenomen in de fundus van de H. heilmannii
s.s. geïnfecteerde gerbils. Figuur 5 mRNA-expressieniveau van H + /K + ATPase in het antrum van de maag. Waterstof kalium ATPase mRNA-expressieniveau in de maag werd onderzocht met kwantitatieve RT-PCR. H + /K + ATPase mRNA-expressieniveau in het antrum wordt weergegeven. Gegevens zijn weergegeven als voudige verandering in genexpressie genormaliseerd tot 3 referentie genen en vergelijking met de negatieve controlegroep wordt beschouwd als 1. Gegevens worden getoond als gemiddelde ± standaarddeviatie. Significante verschillen in expressie tussen geënte groepen en negatieve controlegroep zijn aangegeven met * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Virulent H. heilmannii
S.S. stammen induceren verhoogde gastrine expressie in de fundus
peptide hormoon gastrine stimuleert de secretie van maagzuur door pariëtale cellen. Een storing in de expressie kan leiden tot hypergastrinemia. De expressie van gastrine werd sterk opgereguleerd in de fundus van gerbils geïnfecteerd met ASB2 en ASB6 op 9 weken na infectie (Figuur 6 en Tabel 2). In vergelijking met controle dieren, de gemiddelde relatieve expressie was 6,79 ± 2,49 voor ASB2- en 10.35 ± 2.39 voor ASB6 geïnfecteerde gerbils. In het antrum van de maag, geen up-regulatie van gastrine expressie werd gedetecteerd. Figuur 6 mRNA expressie van gastrine in de fundus van de maag. Gastrine mRNA-expressieniveau in de maag werd onderzocht met kwantitatieve RT-PCR. Getoond wordt de expressie niveau in de fundus. Gegevens zijn weergegeven als voudige verandering in genexpressie genormaliseerd tot 3 referentie genen en vergelijking met de negatieve controlegroep wordt beschouwd als 1. Gegevens worden getoond als gemiddelde ± standaarddeviatie. Significante verschillen in expressie tussen geënte groepen en negatieve controlegroep zijn aangegeven met * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
test).
Discussie
Op 9 weken na de inenting, een chronische actieve gastritis in het antrum van de maag werd waargenomen in gerbils experimenteel geïnfecteerd met 7 van de 9 H. heilmannii
ss stammen getest in deze studie (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 en ASB14). De lamina propria en submucosa werden massaal lymfocyten geïnfiltreerd, waardoor de vorming van lymfoïde follikels. De H. heilmannii
S.S. stammen werden voornamelijk gedetecteerd in het antrum en in mindere mate in de fundus en het duodenum. Bij mensen geïnfecteerd met NHPh, kolonisatie en ontsteking ook hoofdzakelijk in het antrum van de maag [5, 33-35]. Dit bevestigt dat Mongoolse gerbils zijn een geschikt model te bestuderen H. heilmannii
S.S. infecties bij de mens, zoals ook getoond H. suis
[19] en H. pylori
[20, 21]. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Genoom sequentie-analyse van de Helicobacter pylori-stammen geassocieerd met maagzweren en maagkanker
• Antimicrobiële activiteit, acute toxiciteit en cytobeschermende effect van Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore te extraheren in een rat ethanol-HCl maagzweer model