Diversidad en las interacciones bacteria-huésped dentro de la especie Helicobacter heilmannii stricto sensu

Diversidad en las interacciones bacteria-huésped dentro de la especie Helicobacter heilmannii
stricto sensu
Resumen
Helicobacter (H.) heilmannii
stricto sensu (SS) es una bacteria zoonótica que coloniza el estómago de forma natural de los perros y gatos . En los seres humanos, este microorganismo se ha asociado con la gastritis, enfermedad de úlcera péptica y la mucosa tejido linfoide asociado (MALT). Hay poca información disponible acerca de la patogénesis de H. heilmannii
S. S. infecciones en los seres humanos y se desconoce si existen diferencias en la virulencia dentro de esta especie. Por lo tanto, se utilizó un modelo de gerbo de Mongolia para estudiar las interacciones bacteria-anfitrión de 9 H. heilmannii
s.s. son. La capacidad de colonización de las cepas, la intensidad de la gastritis y la expresión de genes de diversas citoquinas inflamatorias en el estómago se determinaron a las 9 semanas después de la infección experimental. La inducción de una gastritis crónica activa antro-dominante con formación de agregados linfocítica se demostró por 7 cepas. colonización antral de alto nivel se observó para 4 cepas, mientras que la colonización de otras 4 cepas era más restringida y una cepa no se detectó en el estómago a las 9 semanas después de la infección. Todas las cepas que inducen una gastritis crónica activa causaron una sobre regulación de la citoquina proinflamatoria IL-1β en el antro. Una expresión antral reducido de H + /K + ATPasa fue visto en el estómago después de la infección con 3 cepas altamente colonizadoras y 2 cepas altamente colonizadoras causado una expresión de gastrina aumentado en el fondo de ojo. En ninguno de los grupos heilmannii
infectados por S. S. H., la expresión de IFN-γ fue hasta reguladas. Este estudio demuestra la diversidad en las interacciones bacteria-huésped dentro de la especie H. heilmannii
S. S. y que la patogénesis de las infecciones gástricas con este microorganismo no es idéntica a la de un H. pylori
infección
. Introducción
Helicobacter (H.) pylori
es la más frecuente de Helicobacter
especies colonizar la mucosa gástrica de seres humanos y se ha asociado con la gastritis, enfermedad de úlcera péptica y cáncer gástrico [1-3]. Además de H. pylori
, otros no-H morfológicamente distintos. Helicobacter pylori
(NHPH) especies, también se hace referencia como H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] se han asociado con la enfermedad gástrica en humanos [5-10]. NHPH representa un grupo de especies bacterianas estrechamente relacionadas pero distintas, que se encuentra principalmente en diferentes especies animales, tales como H. felis
, H. salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
stricto sensu (ss), H. cynogastricus
y H. baculiformis Hoteles en gatos y perros y H. suis Hoteles en cerdos [5, 7, 10-15]. Estos microorganismos se caracterizan por su naturaleza extremadamente exigente, que hasta ahora ha dado lugar a un número limitado de cepas aisladas in vitro disponibles en todo el mundo.
H. heilmannii
S. S. sólo recientemente ha sido aislado y cultivadas in vitro [16]. Se ha detectado en felinos salvajes y en las biopsias gástricas humanas, pero se encuentran con mayor frecuencia en la mucosa gástrica de perros y gatos, con una prevalencia que oscila entre 20 y 100% [5-7, 10, 12]. Aunque esta bacteria se ha asociado con la gastritis crónica activa en gatos y perros [12], su significado patogénico sigue siendo enigmática y es probablemente dependiente de la cepa. En los seres humanos, H. heilmannii
S. S. se ha detectado en 8-19% de las biopsias gástricas con evidencia histológica de infección NHPH [5, 8, 10]. La infección con esta bacteria en los seres humanos se ha asociado con la gastritis, enfermedad de úlcera péptica y tejido linfoide asociado a las mucosas (MALT) [5, 8, 10, 17, 18].
Varios estudios de infección en modelos animales experimentales han sido realizados para investigar la patogénesis de H. pylori
infecciones en los seres humanos. Por el contrario, hay poca información disponible frente a la patogénesis de H. heilmannii
S. S. infecciones en los seres humanos. Esta bacteria se ha propagado en ratones durante un máximo de 28 meses y fue capaz de inducir linfoma MALT en el estómago de estos animales [18]. Sin embargo, en este experimento ratón, se utilizó tejido gástrico se homogeneizaron como inóculo. Esto implica que otros microorganismos se inocularon junto con H. heilmannii
S. S., lo que podría influir en los resultados, como se ha descrito anteriormente [19]. Por lo tanto, para obtener un mejor conocimiento de la patogénesis de la enfermedad gástrica humana asociada con H. heilmannii
S. S., los estudios de infección experimental con cultivos puros de este microorganismo son esenciales. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue estudiar las interacciones bacteria-huésped de 9 H. heilmannii
S. S. cepas, aisladas de la mucosa gástrica de diferentes gatos. El modelo de jerbo de Mongolia ha sido previamente demostrado que es un modelo animal útil para estudiar Helicobacter
patología gástrica -related en los seres humanos y por lo tanto fue utilizado en el presente estudio [19 a 21].
Material y métodos
bacteriana cepas
Nueve cepas de H. heilmannii
ss se obtuvieron de la mucosa gástrica de diferentes gatos y ASB1 designado (= tipo de cepa, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 y ASB14. Las bacterias se cultivaron en bifásicas Brucella
placas de agar (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado con 20% (v /v) de suero de ternera fetal (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), 5 mg /L anfotericina B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, Nueva York, EE.UU.), Skirrow (Oxoid, contiene 10 mg /L de vancomicina, 5 mg /L de lactato de trimetoprim y 2500 U /L de polimixina B), Vitox suplemento (Oxoid) y 0,05% de HCl (pH 5). Después de la incubación en condiciones microaeróbicas (85% N 2, 10% de CO 2, 5% de O 2; 37 ° C), las bacterias se recogieron y la concentración final se ajustó a 7 × 10 8 bacterias viables /ml, según lo determinado por recuento en una cámara de recuento Neubauer
animales, la vivienda y procedimiento experimental
específico libres de patógenos (SPF) de cinco semanas de edad, hembras jerbos de Mongolia (Crl:. MON (Tum), n
= 48) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Lille, Francia). Los animales fueron alojados en jaulas de filtro superior (1500 cm 2) en virutas de madera tratados en autoclave y heno en autoclave. Ellos fueron alimentados ad libitum con una dieta comercial en autoclave (TEKLAD 2018S, que contiene 18% de proteínas; Harlan, Países Bajos) y el agua tratada en autoclave. Para cada uno de los 9 H. heilmannii
s.s. cepas probadas, 5 animales fueron inoculados por vía intragástrica 3 veces en 2 días de intervalo, con 300 l de una suspensión bacteriana. Tres animales fueron inoculados con Brucella
caldo (pH 5, Oxoid) y sirvieron como controles negativos. La inoculación se llevó a cabo bajo anestesia con isoflurano breve (2,5%), usando una aguja de alimentación forzada con punta de bola. A las 9 semanas después de la primera inoculación, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia con isoflurano profunda (5%). El estómago y el duodeno de cada jerbo se resecaron y se tomaron muestras para el examen histopatológico y en tiempo real (RT) Análisis-PCR cuantitativa. Francia El experimento in vivo fue aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Medicina Veterinaria, Gante Universidad, Bélgica (CE 2011/090).
histopatología e inmunohistoquímica
Una sección longitudinal, partiendo del extremo de la panza y que comprende el antro y el fondo del estómago y parte del duodeno, se cortó a lo largo de la curvatura mayor y se fija en 10% de formalina tamponada con fosfato, procesados ​​por métodos estándar y se incluyeron en parafina para microscopía de luz. Se cortaron tres secciones consecutivas de 5 micras. Después de la desparafinación y la hidratación, la recuperación de antígeno inducida por calor se llevó a cabo en tampón de citrato (pH 6). Para bloquear la actividad de peroxidasa endógena y reacciones no específicas, los portaobjetos se incubaron con 3% de H 2O 2 en metanol (5 min) y 30% de suero de cabra (30 min), respectivamente. La primera sección se tiñó con hematoxilina /eosina (H & E) para anotar la intensidad de la gastritis de acuerdo con el Sistema de Actualización de Sydney [22], pero con algunas modificaciones, tal como se describe anteriormente [19]. En la segunda sección, la proliferación de células epiteliales se determinó mediante tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ki67 (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Bélgica). células epiteliales Ki67 positivas fueron contados en 5 elegido al azar de alta potencia campos a nivel de las fosas gástricas (magnificación: 400 ×), tanto en antro y fondo de ojo. El promedio del número de células positivas se calculó para cada grupo experimental en ambas regiones de estómago
se identificaron las células parietales en la tercera sección por tinción inmunohistoquímica para el potasio hidrógeno ATPasa usando un anticuerpo monoclonal de ratón (1/200;. Abcam Ltd, Cambridge, Reino Unido). La incubación con anticuerpos primarios dirigidos contra Ki67 y ATPasa de potasio hidrógeno fue seguido por incubación con un anticuerpo secundario marcado con HRP (Envision Enlace ratón K4007, DakoCytomation, Heverlee, Bélgica) para la visualización.
Extracción de ADN y la cuantificación de la colonización de H. heilmannii
ss en el estómago y el duodeno
De cada jerbo, se tomaron muestras de la del fondo de ojo y el antro del estómago y del duodeno. Las muestras de tejido se almacenaron en 1 ml de ARN más tarde (Ambion, Austin, TE, EE.UU.) a -70 ° C hasta que ARN y ADN-extracción. Las muestras de tejido se homogeneizaron (MagNALyser, Roche, Mannheim, Alemania) y el ARN y el ADN se separaron usando TriReagent RT (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El número de colonización de H. heilmannii
S. S. por mg se determinó tejido gástrico en las muestras de ADN usando un H. heilmannii
s.s. específica cuantitativa de RT-PCR. Para la generación de la norma, parte de la ureAB
grupo de genes (1224 pb) a partir de H. heilmannii
s.s. ASB1 se amplificó usando los cebadores U430F y U1735R, como se describe anteriormente [6]. El estándar constaba de 10 veces diluciones a partir de 10 8 amplicones de PCR para cada 10 l de mezcla de reacción. Una l de plantilla de ADN extraído se suspendió en una mezcla de reacción 10 l que consiste en 0,25 l de ambos cebadores localizados dentro del fragmento de 1224 pares de bases, para producir un producto de PCR 212 pb (cebador sentido: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', cebador antisentido: HH_RVQ: 5'-GCT GTA CCA GAG ACG ATG AAG TCC-3', temperatura de hibridación 58ºC), 3,5 l de agua HPLC y 5 l SensiMix ™ SYBR n-ROX (Bioline Ltd Reactivos , REINO UNIDO). Ambos patrones y las muestras se realizaron por duplicado en un sistema CFX96 ™ RT-PCR con un termociclador de C1000 (Bio-Rad, Hercules CA, EE.UU.). El (versión 1.6) de software Bio-Rad CFX Manager fue utilizado para el cálculo de los ciclos umbral (Ct)-valores y análisis de curva de fusión del ADN amplificado. Los valores medios de los duplicados se utilizaron para la cuantificación de H. heilmannii
s.s. ADN en las muestras de tejido. Preparación de ARN y la expresión génica

ARN total, a partir de las muestras de tejido, se purificó usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza del ARN se demuestra midiendo la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm con NanoDrop que en todos los casos fue de aproximadamente 2. La concentración de ARN en cada muestra se ajustó a 1 g /l y se sintetizó ADNc inmediatamente después de la purificación de ARN usando iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Las alícuotas de cDNA (1/5 de dilución) se utilizaron como molde para la RT-PCR cuantitativa para medir la expresión génica. Los niveles de expresión de ARNm de diferentes citoquinas (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ y TNF-α), gastrina y H + /K + ATPasa se cuantificaron. Los genes de limpieza GAPDH, β-actina
y HPRT
se incluyeron como genes de referencia. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1 [23-28]. Para todos los genes diana y genes de referencia, las eficiencias de cebadores fueron entre 1,9 y 2,1. Las reacciones se realizaron en 10 volúmenes l que contenía 1 l de ADNc, 0,05 l de ambos cebadores, 3,9 l de agua HPLC y 5 l SensiMix ™ SYBR No-ROX. El protocolo experimental para la reacción PCR (40 ciclos) se realizó en un sistema de RT-PCR CFX96 ™ con un ciclador térmico de C1000 (Bio-Rad): desnaturalización durante 15 min a 95 ° C, seguido de ciclos de amplificación a 95 ° C durante 20 s, hibridación a 60 ° C durante 30 s y extensión a 73 ° C durante 30 s. Las reacciones de control sin la etapa de la transcriptasa inversa se llevaron a cabo para excluir la contaminación de ADN de las muestras de ARN. Sin plantilla y controles se incluyeron mezclas de reacción y todas las muestras se realizaron por duplicado. Los valores Ct se normalizaron a la media geométrica de los valores Ct de los genes de referencia 3, después de lo cual los niveles de ARNm normalizados se calcularon utilizando el 2 -ΔΔCt método [29] .Tabla 1 Primer pares.
cebadores
secuencia (5 '→ 3') guía empresas citoquinas IL-1β
FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL- 1β RV23
CAC CTT GGA GAC TTT TTC TA hotels, IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG sobre Il-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA CAG CAG CAG CAT GAG TCA hotels, IL-6 RV
CCG CCG ATT TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC hotels, IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA hotels, IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC hotels, IL-12p40 FW
GAC ACG ACC ACC TCC AAA GT hotels, IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA hotels, IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC hotels, IL-17 RV23
AGG AGG ACC ATC TCT TGC TG
IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
RV24 IFN-γ
GAA GAA GTA AGA GAC CTG AAT G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
TNF-α RV23
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
gastrina
gastrina FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
gastrina RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPasa ( células parietales)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG CAC TGA TG
ATP4b RV
AAG AAG CTT TCC TAC GAC GTG CAG
referencia genes GAPDH
FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
RV26 GAPDH
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actina FW28
CCA CCA AGG ACC GCG AGA TGA C
RV28 β-actina
AGG CAT GTA GGT GGT GCC GCC AGA C
pares de cebadores utilizado para medir se muestran los niveles de expresión de ARNm de IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-gamma, TNF-a, gastrina y H + /K + ATPasa. Los genes de limpieza GAPDH, β-actina
y HPRT
se incluyeron como genes de referencia.
El análisis estadístico
normalidad y homogeneidad de varianza de los datos se analizaron mediante el uso de Shapiro-Wilk prueba de normalidad y el test de Levene para la homogeneidad de las varianzas. puntuaciones de gastritis, la capacidad de colonización y la expresión de la ATPasa y el gen de la gastrina se compararon entre los diferentes grupos infectados y controles utilizando el análisis de Kruskall-Wallis, seguido de una U de Mann-Whitney
prueba. la expresión de citoquinas y el número de las células Ki67 positivas se analizaron mediante análisis de la varianza con una prueba de Bonferroni post hoc. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p
≤ 0,05. Se utilizó el software SPSS Statistics 21 (IBM) para todos los análisis.
Resultados
La infección con H. heilmannii virulenta
S. S. cepas induce una gastritis crónica activa antro-dominante
El estómago de todos los animales de control mostraron una histomorfología normal (Figura 1a). La inflamación en el estómago de los jerbos infectados con H. heilmannii
s.s. cepas ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 y ASB14 se caracterizó por una gastritis crónica activa con la formación de agregados linfocitarios en la lámina propia y la submucosa del antro del estómago (Figura 1b). El grosor de la mucosa se aumentó ligeramente y se detectaron pocos neutrófilos. En contraste, H. heilmannii
s.s. cepas ASB7 y ASB9 no causaron inflamación antral explícita y sólo un leve aumento en el número de células linfocítica se observó en la lámina propia del antro del estómago (Figura 1c). En todos H. heilmannii
jerbos infectados con S. S., se detectaron signos limitados de la inflamación en el fondo del estómago (archivo adicional 1). Las puntuaciones de inflamación antrales de cada animal individual se muestran en la Figura 2d. Una diferencia estadísticamente significativa entre las puntuaciones de inflamación de los jerbos inoculados con ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 y ASB14 en comparación con se demostró el grupo de control (U de Mann-Whitney U
prueba, p Hotel < 0,05, Figura 2d). Figura 1 H & E tinción del antro del estómago de un jerbo. histología normal del antro de un animal de control negativo sham-inoculado (a). infiltración linfocítica explícita de la lámina propia y la submucosa con la formación de folículos linfoides (flechas) en el antro de un gerbil inoculados con H. heilmannii
s.s. ASB1 (b). Mild ausentarse infiltración linfocítica (flechas) de la lámina propia en el antro de un gerbil inoculados con H. heilmannii
s.s. ASB7 (c). Bar = 30 micras.
Capacidad Figura 2 La colonización de H. heilmannii S. S. cepas y valoración de la inflamación gástrica después de la infección experimental. capacidad de colonización se muestra como valores log10 de H. heilmannii
S. S. bacterias por mg de tejido, detectados con RT-PCR cuantitativa en el fondo de ojo (a) y el antro (c) del estómago y el duodeno (b). Los resultados por debajo del límite de detección (log 2,39 bacterias por mg de tejido) se establecieron como 0. antro inflamación (d) se puntuó en una escala de 0 a 4 (0: sin infiltración con células mononucleares y /o polimorfonucleares; 1: infiltración difusa suave con mononuclear y /o células polimorfonucleares o la presencia de un agregado pequeño (50-200 células) de células inflamatorias; 2: infiltración difusa moderada con mononuclear y /o células polimorfonucleares y /o la presencia de agregados 2-4 inflamatorias; 3: marcado infiltración difusa con células mononucleares y /o polimorfonucleares y /o la presencia de al menos cinco agregados inflamatorias; 4: difusa infiltración de grandes regiones con grandes agregados de mononucleares y /o células polimorfonucleares) jerbos .Individual se representan como figuras alrededor de la media ( líneas). Diferencias estadísticamente significativas en comparación con los animales control se indican con * (U de Mann-Whitney
prueba, p Hotel < 0,05) la capacidad
La colonización de H. heilmannii
S. S.. Las tensiones en el estómago y el duodeno
La detección de H. heilmannii
S. S. ADN con RT-PCR cuantitativa a las 9 semanas después de la infección reveló la colonización de alto nivel de ASB1, ASB2, ASB3 y ASB6 en el estómago (Figura 2a-c). Por el contrario, la colonización de ASB7, ASB11, ASB13 y ASB14 era más restringida mientras ASB9 no se detectó en el estómago (Figura 2a-c). En general, la capacidad de colonización en el fondo de ojo (Figura 2a) fue menor que en el antro (figura 2c) para todas las cepas ensayadas y el menor número de bacterias se detectó en el duodeno (Figura 2b). Además, una clara asociación se observó entre la capacidad de colonización de la H. heilmannii
s.s. cepas y las puntuaciones de inflamación gástrica en el antro del estómago (figura 2c-d).
virulento H. heilmannii
S. S. cepas causan proliferación de células epiteliales antral gástrica
Resultados de la puntuación gástrico proliferación de células epiteliales en el antro del estómago se muestran en la Figura 3c. un número significativamente mayor de células epiteliales en proliferación Ki67 positivas se observaron en el antro de ASB1- y jerbos ASB6 infectadas, en comparación con el grupo de control (ANOVA, p
< 0,05, Figura 3a-b). El número de células Ki67 positivas se incrementaron moderadamente en ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- y jerbos infectados por ASB14, aunque no estadísticamente significativa. H. heilmannii
S. S. cepas ASB7 y ASB9 no causaron un aumento de la proliferación de células epiteliales gástricas. Además, un número significativamente mayor de la proliferación de las células epiteliales se demostraron en el antro de ASB1-, ASB2-, y jerbos ASB6 infectadas, en comparación con los jerbos infectados con ASB7 y ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figura 3 proliferación de células epiteliales antral gástrica. tinción Ki67 del antro de un hámster inoculado con H. heilmannii
S. S. ASB1 (b) que muestra un número mayor de la proliferación de células epiteliales en comparación con un animal de control negativo sham-inoculado (a). La tasa de proliferación de células epiteliales se determinó contando las células epiteliales Ki67 positivas en 5 elegido al azar de alta potencia campos a nivel de las fosas gástricas (magnificación: 400 ×) en el antro del estómago jerbo (c). Los números medios de células Ki67 positivas se muestran en cada grupo experimental. Las diferencias significativas entre H. heilmannii
S. S.-inoculados y animales de control se indican con * (ANOVA, p Hotel < 0,05). Diferencias significativas en comparación con ASB7 y grupos ASB9 inoculado se indican con + y #, respectivamente (ANOVA, p Hotel < 0,05).
En el fondo de toda H. heilmannii
jerbos infectados ss, el epitelio la tasa de proliferación celular no fue significativamente mayor en comparación con los animales control (archivo adicional 2).
expresión génica de citocinas en el estómago en respuesta a H. ss heilmannii
La infección
respuesta inmune del huésped local hacia H. heilmannii
S. S. la infección se caracterizó midiendo el nivel de expresión de ARNm de IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 y TNF-α en el estómago de los jerbos. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 2 4.Table El análisis estadístico de los niveles de expresión de mRNA.
antro
del fondo de ojo
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPasa
gastrina
media Ct-Ctrefa
p-valorB
media ct-Ctref
valor p
media ct-Ctref
valor p
media ct-Ctref
p-valor
ASB1
6,92 ± 0,29 * 0,031

6,87 ± 0,60
1.000
3,70 ± 2,11 * 0,050

7,20 ± 1,68 0,101

ASB2
7,48 ± 1,42 0,231

8,15 ± 1,26
1.000
2,42 ± 5,01 0,513

5,94 ± 2,49 * 0,050

ASB3
6,55 ± 0,80 * 0,008

7,54 ± 0,37
1.000
3,49 ± 2,28 * 0,050

7,71 ± 1,17 0,101

ASB6
6.12 ± 0.67 *
0,001
7.99 ± 0.90
1.000
2,23 ± 1,99 * 0,050

5,33 ± 2,39 * 0,025

ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
1.000
0,45 ± 2,51 0,724

7,12 ± 1,54 0,180

ASB9
9,03 ± 2,54
1.000 ± 8.55
0,71
1.000
0,79 ± 0,03 0,564

8.11 ± 1.58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15 0,499

10,45 ± 0,95 * 0,004

1,32 ± 1,45 0,248

7,67 ± 1,25 0,289

ASB13
7,72 ± 1,17 0,523

9,54 ± 1,55 * 0,044

3.80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93 0,456

ASB14
7,07 ± 0,52 0,054

8,51 ± 0,97
1.000
3.81 ± 3.11
0,127
7,77 ± 2,96 0,881
control negativo

9,71 ± 1,13
- 7.08 ± 0.65
- 0,15 ± 1,82 -
8,70 ± 0,62
- se muestra el análisis estadístico de IL-1β, IFN-γ y la expresión del ARNm H + /K + ATPasa en la expresión de ARNm de antro y gastrina en el fondo del estómago gerbil a las 9 semanas después de la infección experimental. Expresión de citoquinas se analizó mediante análisis de la varianza con una prueba de Bonferroni post hoc. expresión H + /K + ATPasa y el gen de la gastrina se comparó entre los diferentes grupos infectados y controles utilizando el análisis de Kruskall-Wallis, seguido de una U de Mann-Whitney
prueba. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p
≤ 0,05. software de SPSS Statistics 21 (IBM) se utilizó para todos los análisis
una media Ct-Ctref:. Para cada grupo experimental, se muestra la media de los valores Ct normalizado ± desviación estándar
pb
-valor. : se dan los p-valores exactos

* diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo control no infectado (p ≤ 0,05
): perfil Figura 4 niveles de mRNA expresión de las citoquinas IL-1β e IFN.. gamma en el antro del estómago. Citoquinas mRNA niveles de expresión en el fondo de ojo y el antro del estómago fueron examinados por RT-PCR cuantitativa. Se muestran niveles de expresión de IL-1β (a) y IFN-γ (b) en el antro. Los datos se presentan como el cambio de veces en la expresión génica normalizada a 3 genes de referencia y con respecto al grupo de control negativo que se considera como 1. Los datos se muestran como medias ± desviación estándar. Diferencias significativas en el nivel de expresión entre los grupos inoculados y el grupo de control negativo se indican con * p Hotel < 0,05 (ANOVA).
La citoquina pro-inflamatoria IL-1β es un potente inhibidor de la secreción de ácido gástrico [30] y desempeña un papel en la fase aguda de la inflamación [31]. La expresión de IL-1β fue hasta reguladas en el antro del estómago de los jerbos infectados con H. heilmannii
S. S. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 y ASB14, en comparación con los animales control negativo (Figura 4a). Para jerbos inoculados con ASB7 y ASB9, sin regulación de IL-1β fue visto. México La citoquinas Th1 IFN-γ, un marcador de la firma de la respuesta Th1-polarizado [24, 32], mostró una disminución en la expresión de la antro de jerbos infectados con ASB11 y ASB13 (Figura 4b), en comparación con los animales de control.
No hay diferencias significativas en la expresión entre los jerbos infectados y simulada inoculado podría ser observados para IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 y TNF-α.
parietal celular H + /K + expresión de ARNm ATPasa es el regulado en respuesta a la colonización por H. heilmannii
ss
hay una clara pérdida de células parietales podría ser visualizado por tinción inmunohistoquímica en el fondo de ojo y el antro del H. heilmannii
jerbos SS-infectados en comparación con los controles no infectados (datos no mostrados). Sin embargo, RT-PCR cuantitativa mostró una clara disminución de la expresión de los gástrica H + /K + ATPasa en el antro de los jerbos infectados con ASB1, ASB3 y ASB6 (Figura 5 y Tabla 2). En comparación con los animales control con niveles de expresión de ARNm establecidos a 1,0, la expresión relativa media fue de 0,09 ± 2,11 para ASB1-, 0,10 ± 2,28 y 0,24 para ASB3- ± 1.99 para los jerbos infectados ASB6, respectivamente. Ningún cambio significativo en la expresión se observó en el fondo de ojo de los heilmannii
jerbos infectados con S. S. H.. Figura nivel de expresión de ARNm de 5 H + /K + ATPasa en el antro del estómago. El hidrógeno de potasio ATPasa nivel de expresión de ARNm en el estómago fue examinado por RT-PCR cuantitativa. se muestra el nivel de expresión mRNA H + /K + ATPasa en el antro. Los datos se presentan como el cambio de veces en la expresión génica normalizada a 3 genes de referencia y con respecto al grupo de control negativo que se considera como 1. Los datos se muestran como medias ± desviación estándar. Diferencias significativas en el nivel de expresión entre los grupos inoculados y el grupo de control negativo se indican con * p ≤ 0,05
(U de Mann-Whitney
prueba).
virulento H. heilmannii
S. S. cepas de inducir aumento de la expresión de gastrina en el fondo de ojo
la hormona gastrina péptido estimula la secreción de ácido gástrico por las células parietales. Una alteración en su expresión puede conducir a la hipergastrinemia. La expresión de gastrina fue altamente regulados hasta en el fondo de los jerbos infectados con ASB2 y ASB6 a las 9 semanas después de la infección (Figura 6 y Tabla 2). En comparación con los animales de control, la expresión relativa media fue de 6,79 ± 2,49 para ASB2- y 10,35 ± 2,39 para jerbos ASB6 infectados. En el antro del estómago, no se detectó la sobre regulación de la expresión de gastrina. Figura 6 nivel de expresión de ARNm de gastrina en el fundus del estómago. nivel de expresión de ARNm de gastrina en el estómago fue examinado por RT-PCR cuantitativa. Se muestra el nivel de expresión en el fondo de ojo. Los datos se presentan como el cambio de veces en la expresión génica normalizada a 3 genes de referencia y con respecto al grupo de control negativo que se considera como 1. Los datos se muestran como medias ± desviación estándar. Diferencias significativas en el nivel de expresión entre los grupos inoculados y el grupo de control negativo se indican con * p ≤ 0,05
(U de Mann-Whitney
prueba).
Discusión
A las 9 semanas después de la inoculación, la gastritis crónica activa en el antro del estómago se observó en los jerbos infectados experimentalmente con 7 de 9 H. heilmannii
ss cepas analizadas en este estudio (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 y ASB14). La lámina propia y la submucosa se infiltraron masivamente con linfocitos, lo que resulta en la formación de folículos linfoides. El H. heilmannii
S. S. cepas se detectaron principalmente en el antro y en menor medida en el fondo de ojo y el duodeno. En los seres humanos infectados con NHPH, la colonización y la inflamación también se producen principalmente en el antro del estómago [5, 33-35]. Esto confirma que los jerbos mongoles son un modelo apropiado para estudiar H. heilmannii
S. S. infecciones en los seres humanos, como también se ha demostrado para H. suis
[19] y H. pylori
[20, 21]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• análisis de la secuencia del genoma de cepas de Helicobacter pylori asociados con la ulceración gástrica y análisis de la secuencia del genoma cancer
• La actividad antimicrobiana, la toxicidad aguda y el efecto citoprotector del Crassocephalum vitellinum (Benth.) S. Moore extracto en una úlcera gástrica de rata etanol-HCl actividad antimicrobiana …