Diversidade nas interações bactéria-hospedeiro dentro da espécie Helicobacter heilmannii diversidade sensu stricto

em interações bactéria-hospedeiro dentro da espécie Helicobacter heilmannii
sensu stricto da arte abstracta
Helicobacter (H.) heilmannii
sensu stricto (ss) é uma bactéria coloniza zoonótica que, naturalmente, no estômago de cães e gatos. Nos seres humanos, esse microrganismo tem sido associada com a gastrite, a úlcera péptica e linfoma da mucosa tecido linfóide associado (MALT). Há pouca informação disponível sobre a patogênese da H. heilmannii
s.s. infecções em seres humanos e não se sabe se existem diferenças na virulência dentro desta espécie. Portanto, um modelo de gerbilo da Mongólia foi usado para estudar interações bactéria-hospedeiro de 9 H. heilmannii
s.s. estirpes. A capacidade de colonização de estirpes, a intensidade da gastrite e o gene de expressão de diversas citocinas inflamatórias no estômago foram determinados às 9 semanas após a infecção experimental. A indução de uma gastrite crónica activa antro-dominante, com formação de agregados linfocíticos foi mostrado para 7 estirpes. De Alto Nível de colonização antral foi visto para 4 estirpes, enquanto que a colonização de 4 outras estirpes era mais restrito e uma estirpe não foi detectado no estômago após a infecção em 9 semanas. Todas as estirpes induzem uma gastrite crónica activa causou um aumento da regulação da citoquina pró-inflamatória IL-1β no antro. A expressão reduzida de antral H + /K + ATPase foi observada no estômago após a infecção com 3 estirpes altamente colonizadoras e 2 estirpes altamente colonizadoras causou uma expressão aumentada de gastrina na região do fundo. Em nenhum dos grupos heilmannii
S.S.-infectadas H., expressão de IFN-γ foi regulado para cima. Este estudo demonstra a diversidade de interações bactéria-hospedeiro dentro da espécie H. heilmannii
s.s. e que a patogénese de infecções gástricas com este microorganismo não é idêntico ao de uma infecção por H. pylori
.
Introdução
Helicobacter (H.)
pylori é o mais prevalente de Helicobacter
espécies colonizar a mucosa gástrica de seres humanos e tem sido associada com a gastrite, a úlcera péptica e cancro gástrico [1-3]. Além de H. pylori
, outra morfologicamente distintas não-H. Helicobacter pylori
(NHPh) espécie, também conhecida como H. heilmannii
sensu lato (S.L.) [4] têm sido associadas com a doença gástrica em humanos [5-10]. NHPh representa um grupo de espécies de bactérias estreitamente relacionadas, mas distintas, encontradas principalmente em espécies animais diferentes, tais como H. felis
, H. salomonis
, H. bizzozeronii
, H. heilmannii
sensu stricto (ss), H. cynogastricus
e H. baculiformis
em gatos e cães e H. suis
em suínos [5, 7, 10-15]. Estes microrganismos são caracterizadas pela sua natureza extremamente exigente, que até agora resultou em um número limitado de in vitro isolados disponíveis em todo o mundo.
H. heilmannii
s.s. foi apenas recentemente isoladas e cultivadas in vitro [16]. Tem sido detectada em felino selvagem e em biópsias gástricas humanas, mas é mais frequentemente encontrada na mucosa gástrica de cães e gatos com uma prevalência variando de 20 a 100% [5-7, 10, 12]. Embora esta bactéria tem sido associada com a gastrite crónica activa em cães e gatos [12], o seu significado permanece enigmática patogénico e é provavelmente estirpe-dependente. Nos seres humanos, H. heilmannii
s.s. tem sido detectado em 8-19% das biópsias gástricas com evidência histológica de infecção NHPh [5, 8, 10]. A infecção com esta bactéria em seres humanos tem sido associada com a gastrite, a úlcera péptica e mucosa do tecido linfóide associado (MALT) [5, 8, 10, 17, 18].
Vários estudos de infecção em modelos animais experimentais foram realizadas a investigar a patogênese da infecção H. pylori
em seres humanos. Em contraste, há pouca informação disponível lidar com a patogênese da H. heilmannii
s.s. infecções em seres humanos. Esta bactéria tem sido propagado em ratos por até 28 meses e foi capaz de induzir o linfoma MALT nos estômagos desses animais [18]. No entanto, neste experimento de rato, homogeneizado de tecido gástrico foi usado como inoculo. Isto implica que outros microorganismos foram inoculadas juntamente com H. heilmannii
S.S., que possam influenciar os resultados, como tem sido descrito anteriormente [19]. Assim, para obter melhores insights sobre a patogênese da doença gástrica humana associada a H. heilmannii
S. S., estudos experimentais de infecção com culturas puras deste microrganismo são essenciais. Portanto, o objetivo do presente estudo foi estudar as interações bactéria-hospedeiro de 9 H. heilmannii
s.s. cepas, isoladas da mucosa gástrica de diferentes gatos. O modelo de gerbilo da Mongólia foi previamente demonstrado ser um modelo animal útil para o estudo patologia gástrica Helicobacter -relacionados
em seres humanos e, portanto, foi utilizado no presente estudo [19-21].
Material e métodos
bacteriana estirpes
Nove cepas de H. heilmannii
ss foram obtidos a partir da mucosa gástrica de diferentes gatos e ASB1 designado (= tipo de tensão, DSM 23983, [16]), ASB2, ASB3, ASB6, ASB7, ASB9, ASB11, ASB13 e ASB14. As bactérias foram cultivadas em bifásicos Brucella
placas de agar (Oxoid, Basingstoke, UK) suplementado com 20% (v /v) de soro fetal de vitela (Hyclone, Logan, UT, EUA), 5 mg /L de anfotericina B (Fungizone, Brystal -Myers Squibb, Nova Iorque, EUA), Skirrow (Oxoid, contém 10 mg /L de vancomicina, 5 mg /l de lactato trimetoprim e 2500 U /L polimixina B), suplemento Vitox (Oxoid) e 0,05% de HCl (pH 5). Após incubação sob condições microaeróbias (85% N 2, 10% de CO 2, 5% O 2; 37 ° C), as bactérias foram colhidas e a concentração final foi ajustado para 7 × 10 8 bactérias viáveis ​​/mL, como determinado por contagem, numa câmara de contagem Neubauer
Animals, habitação e procedimento experimental
Specific-livre de patógenos (SPF) do sexo feminino de cinco semanas de idade gerbilos da Mongólia (Crl:. MON (Tum), N
= 48) foram obtidos de Charles River Laboratories (Lille, França). Os animais foram alojados em gaiolas de topo de filtro (1500 cm 2) em aparas de madeira autoclavada e feno autoclavado. Eles foram alimentados ad libitum uma dieta comercial autoclavado (Teklad 2018S, que contém 18% de proteína; Harlan, Holanda) e água autoclavada. Para cada um dos 9 H. heilmannii
s.s. estirpes testadas, 5 animais foram inoculados por via intragástrica 3 vezes em 2 dias de intervalo, com 300 mL de uma suspensão bacteriana. Três animais foram inoculados com Brucella
caldo (pH 5, Oxoid) e serviram como controlos negativos. A inoculação foi realizada sob anestesia com isoflurano breve (2,5%), usando uma agulha de gavagem com ponta de esfera. Às 9 semanas após a primeira inoculação, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, sob anestesia profunda isoflurano (5%). Do estômago e do duodeno de cada gerbil foram ressecados e foram colhidas amostras para exame histopatológico e em tempo real (RT) Análise-PCR quantitativo.
O experimento in vivo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina Veterinária, Ghent Universidade, Bélgica (CE 2011/090).
histopatologia e imuno-histoquímica
um corte longitudinal, a partir do final da pança e compreendendo o antro e do fundo do estômago e do duodeno parte, foi cortada ao longo da curvatura maior e fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato, processadas através de métodos padrão e embebidos em parafina para microscopia de luz. Três secções consecutivas de 5 um foram cortadas. Após desparafinização e hidratação, recuperação de antigénio induzida por calor foi realizada em tampão de citrato (pH 6). Para bloquear a actividade da peroxidase endógena e as reacções não específicas, as lâminas foram incubadas com 3% H 2O 2 em metanol (5 min) e soro de cabra a 30% (30 min), respectivamente. A primeira parte foi corada com hematoxilina /eosina (H & E) para marcar a intensidade da gastrite de acordo com o sistema Sydney [22], mas com algumas modificações, tal como descrito anteriormente [19]. Na segunda secção, a proliferação de células epiteliais foi determinado por coloração imuno-histoquímica utilizando um anticorpo monoclonal de ratinho anti-Ki67 (25/01; Menarini Diagnostics, Zaventem, Bélgica). células epiteliais Ki67-positivas foram contadas em 5 campos escolhidos aleatoriamente de potência alta ao nível dos poços gástricos (ampliação: 400 ×), tanto no antro e do fundo do olho. A média da contagem de células positivas foi calculada para cada grupo experimental em ambas as regiões do estômago
células parietais foram identificados na terceira secção por coloração imuno-histoquímica para o hidrogénio de potássio ATPase utilizando um anticorpo monoclonal de rato (1/200;. Abcam Ltd, de Cambridge, Reino Unido). A incubação com os anticorpos primários dirigidos contra Ki67 e potássio hidrogénio ATPase foi seguida de incubação com um anticorpo secundário marcado com HRP (Envision ligação rato K4007, DakoCytomation, Heverlee, Bélgica) para visualização.
Extracção de ADN e quantificação de colonizar H. heilmannii
ss no estômago e no duodeno
De cada gerbilo, foram tomadas amostras do fundo do útero e o antro do estômago e do duodeno. As amostras de tecido foram armazenadas em 1 mL de ARN posterior (Ambion, Austin, TE, EUA), a -70 ° C até RNA- DNA e de extracção. As amostras de tecido foram homogeneizadas (MagNALyser, Roche, Mannheim, Alemanha) e o RNA e DNA foram separados utilizando TriReagent RT (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O número de colonizar H. heilmannii
s.s. por mg de tecido gástrico foi determinada nas amostras de ADN utilizando um H. heilmannii
S.S.-específica RT-PCR quantitativo. Para a geração do padrão, parte do agrupamento de genes ureAB o
(1224 pb) a partir de H. heilmannii
s.s. ASB1 foi amplificado utilizando iniciadores U430F e U1735R, como descrito anteriormente [6]. O padrão consistiu de 10-fold-diluições a partir de 10 8 amplicons de PCR para cada 10 mL de mistura de reacção. Um ul de molde de ADN extraído foi suspenso numa mistura de reacção de 10 uL que consiste em 0,25 mL de ambos os iniciadores localizados dentro do fragmento de 1224 pb, para originar um produto de PCR de 212 pb (iniciador de sentido directo: HH_SP1: 5'-CTT TCT CCT GGT GAA GTG ATT CTC-3 ', iniciador anti-sentido: HH_RVQ: 5'-GCT CCA GTA GAG GCA ATG AAG TCC-3', a temperatura de recozimento de 58 ° C), 3,5 ul de água HPLC e 5 uL SensiMix ™ SYBR n-ROX (Bioline Ltd. Reagentes , Reino Unido). Ambos os padrões e as amostras foram testadas em duplicado em um sistema CFX96 ™ RT-PCR com um termociclador de C1000 (Bio-Rad, Hercules CA, EUA). A (versão 1.6) software Bio-Rad CFX Manager foi utilizado para o cálculo de ciclos de limite (TC) -Valores e análise de curva de fusão do ADN amplificado. Os valores médios dos duplicados foram utilizados para quantificação de H. heilmannii
s.s. ADN nas amostras de tecido.
Preparação de RNA e expressão do gene
ARN total, a partir das amostras de tecido, foi purificado utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Pureza de ARN foi demonstrada medindo a razão de absorvância a 260 nm e 280 nm com NanoDrop que em todos os casos foi de aproximadamente 2. A concentração de ARN em cada amostra foi ajustada a 1 ug /uL e o ADNc foi sintetizado imediatamente após purificação usando ARN iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Alíquotas de ADNc (diluição 1/5) foram utilizados como um molde para a RT-PCR quantitativa para medir a expressão do gene. Os níveis de diferentes citocinas (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-γ e TNF-α), gastrina e H + /K de expressão de ARNm + ATPase foram quantificados. Os genes housekeeping GAPDH, β-actina
e HPRT
foram incluídos como genes de referência. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela 1 [23-28]. Para todos os genes-alvo e genes de referência, as eficiências de iniciadores foram entre 1,9 e 2,1. As reacções foram realizadas em volumes de 10 ul contendo 1 uL de ADNc, 0,05 mL de ambos os iniciadores, 3,9 ul de água HPLC e 5 uL SensiMix ™ SYBR n-ROX. O protocolo experimental para a reacção de PCR (40 ciclos) foi realizada num sistema de RT-PCR CFX96 ™ com um termociclador de C1000 (Bio-Rad): desnaturação durante 15 minutos a 95 ° C, seguido de ciclos de amplificação a 95 ° C durante 20 s, emparelhamento a 60 ° C durante 30 s e extensão a 73 ° C durante 30 s. As reacções de controlo sem o passo da transcriptase reversa foram implementados para evitar a contaminação de ADN das amostras de RNA. No-modelo de controle de misturas de reação foram incluídos e todas as amostras foram testadas em duplicado. O CT-valores foram normalizados para a média geométrica dos valores do Ct-a partir dos genes de referência 3, após o que os níveis de mRNA normalizados foram calculados utilizando a 2 -ΔΔCt método de [29] .table 1 Os pares de iniciadores.
Primers
Sequência (5 '→ 3')
citocinas
IL-1β FW23
GGC AGG TGG TAT CGC TCA TC
IL 1β RV23
CAC CTT GGA TTT GAC TTC TA
IL-5 FW
AGA GAA GTG TGG CGA GGA GAG ACG
IL-5 RV
ACA GGG CAA TCC CTT CAT CGG
IL-6 FW
CAA AGC CAG AGC CAT GAG TCA
IL-6 RV
GCC ATT CCG TCT GTG ACT CCA GTT TCT CC
IL-10 FW
GGT TGC CAA GCC TTA TCA GA
IL-10 RV
GCT GCA TTC TGA GGG TCT TC
IL-12p40 FW
GAC ACG ACC TCC ACC AAA GT
IL-12p40 RV
CAT TCT GGG ACT GGA CCC TA
IL-17 FW23
AGC TCC AGA GGC CCT CGG AC
IL-17 RV23
AGG ACC AGG ATC TCT TGC TG em IFN-γ FW24
CCA TGA ACG CTA CAC ACT GCA TC
RV24 IFN-γ
GAA GTA GAA AGA GAC AAT CTG G
TNF-α FW23
GCT CCC CCA GAA GTC GGC G
RV23 TNF-α
CTT GGT GGT TGG GTA CGA CA
gastrina
gastrina FW25
GCC CTG GAA CCG CAA CA
gastrina RV25
TTC TTG GAC AGG TCT GCT TTG AA
H + /K + ATPase ( células parietais)
ATP4b FW
GGG GGT AAC CTT GAG ACC TGA TG em ATP4b RV
AAG AAG TAC CTT TCC GAC GTG CAG
genes referências
GAPDH FW26
AAC GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAC G
RV26 GAPDH
CAA CAT ACT CGG CAC CGG CAT CG
HPRT FW27
CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA G
HPRT RV27
AGC TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT
β-actina FW28
CCA AGG CCA ACC GCG AGA TGA C
RV28 β-actina
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
Os pares de primers usado para medir os níveis de expressão de mRNA de IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-y, TNF-a, gastrina e H + /K + ATPase são mostrados. Os genes housekeeping GAPDH, β-actina Comprar e HPRT
foram incluídos como genes de referência.
Análise estatística
normalidade e homogeneidade de variância dos dados foram analisados ​​por meio do teste de normalidade de Shapiro-Wilk eo teste de Levene para a homogeneidade de variâncias. pontuações gastrite, capacidade de colonização e expressão do gene da ATPase e gastrina foram comparadas entre os diferentes grupos infectados e os controlos utilizando análise de Kruskall-Wallis, seguido por um Mann-Whitney U
teste. expressão de citocinas e o número de células de Ki67-positivas foram analisados ​​por análise de variância com um teste de Bonferroni post hoc. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 software (IBM) foi utilizado para todas as análises.

Resultados da infecção com virulenta H. heilmannii
s.s. cepas induz uma gastrite crónica activa antro dominante
O estômago de todos os animais de controlo apresentaram um histomorfologia normal (Figura 1a). Inflamação no estômago de gerbos infectados com H. heilmannii
s.s. estirpes ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14 foi marcado por uma gastrite crónica activa, com formação de agregados linfocítica na lâmina própria e submucosa do antro do estômago (Figura 1b). A espessura da mucosa foi ligeiramente aumentada e apenas alguns foram detectados neutrófilos. Em contraste, H. heilmannii
s.s. estirpes ASB7 e ASB9 não causar inflamação antral explícita e apenas um ligeiro aumento no número de células linfocítica foi observado na lâmina do antro do estômago (Figura 1c). Em todos H. heilmannii
gerbos s.s. infectadas, apenas sinais limitados de inflamação foram detectados no fundo do estômago (arquivo adicionais 1). As pontuações da inflamação antrais de cada animal são apresentados na Figura 2D. A diferença estatisticamente significativa entre a pontuação da inflamação para gerbos inoculados com ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14 em comparação com o grupo controle foi demonstrado (Mann-Whitney U
teste, p Art < 0,05, Figura 2d). Figura 1 a H & E de coloração do antro do estômago de um gerbilo. histologia normal do antro de um animal de controlo negativo inoculados simulada (a). infiltração linfocítica explícita da lamina propria e submucosa com a formação de folículos linfóides (setas) no antro de um hamster inoculado com H. heilmannii
s.s. ASB1 (b). Leve a ausentar infiltração linfocitária (setas) da lâmina no antro de um gerbil inoculadas com H. heilmannii
s.s. ASB7 (c). Barra = 30 um.
Figura 2 capacidade de colonização da H. heilmannii s.s. estirpes e pontuação inflamação gástrica após a infecção experimental. capacidade de colonização é mostrado como log10 valores de H. heilmannii
s.s. bactérias por mg de tecido, detectadas com quantitativo de RT-PCR na região do fundo (a) e o antro (c), do estômago e do duodeno (b). Os resultados abaixo do limite de detecção (2,39 log de bactérias por mg de tecido) foi definido como 0. Antral inflamação (d) foi avaliado numa escala de 0 a 4 (0: Sem infiltração de células mononucleares e /ou polimorfonucleares; 1: infiltração difusa leve com mononucleares e /ou células polimorfonucleares ou a presença de um pequeno agregado (50-200 células) de células inflamatórias; 2: infiltração difusa moderada com mononucleares e /ou células polimorfonucleares e /ou a presença de agregados de 2-4 inflamatórias; 3: marcado infiltração difusa com células mononucleares e /ou polimorfonucleares e /ou a presença de pelo menos cinco agregados inflamatórias; 4: difuso de grandes regiões de infiltração com grandes agregados de células mononucleares e /ou células polimorfonucleares) .Individual gerbilos são representadas como valores em torno da média ( linhas). diferenças estatisticamente significativas em comparação com os animais de controlo são indicados por * (Mann-Whitney U
teste, p Art < 0,05) Capacidade
colonização da H. heilmannii
s.s.. estirpes no estômago e duodeno
Detecção de H. heilmannii
s.s. ADN com RT-PCR quantitativo em 9 semanas após a infecção revelou colonização de alto nível de ASB1, ASB2, ASB3 e ASB6 no estômago (Figura 2A-C). Em contraste, a colonização de ASB7, ASB11, ASB13 e ASB14 era mais restrito enquanto ASB9 não foi detectado no estômago (Figura 2A-C). Em geral, a capacidade de colonização na região do fundo (Figura 2a) foi menor do que no antro (Figura 2c) para todas as estirpes testadas e o menor número de bactérias foi detectado no duodeno (Figura 2b). Além disso, uma associação clara foi observada entre a capacidade de colonização da H. heilmannii
s.s. estirpes e as pontuações da inflamação gástrica no antro do estômago (Figura 2c-d).
virulento H. heilmannii
s.s. estirpes causar proliferação epitelial do antro gástrico célula
Os resultados da pontuação proliferação de células epiteliais gástricas no antro do estômago são mostrados na Figura 3C. números significativamente maiores de células epiteliais em proliferação Ki67-positivas foram observados no antro de ASB1- e gerbos infectados com ASB6, em comparação com o grupo de controlo (ANOVA, p
< 0,05, Figura 3a-b). Número de células Ki67-positivas foram moderadamente aumentado em ASB2-, ASB3-, ASB11-, ASB13- e gerbos ASB14-infectados, embora não estatisticamente significativo. H. heilmannii
s.s. estirpes ASB7 e ASB9 não causar um aumento da proliferação de células epiteliais gástricas. Além disso, números significativamente maiores de células epiteliais em proliferação foram demonstradas no antro de ASB1-, ASB2-, e gerbos infectados com ASB6, em comparação com os gerbos infectados com ASB7 e ASB9 (ANOVA, p
< 0,05). Figura 3 a proliferação de células epiteliais do antro gástrico. coloração Ki67 do antro de um gerbil inoculadas com H. heilmannii
s.s. ASB1 (b) mostra um maior número de células epiteliais em proliferação em comparação com um animal de controlo negativo inoculados simulada (a). A taxa de proliferação das células epiteliais foi determinado por contagem de células epiteliais Ki67-positivas nos cinco campos escolhidos aleatoriamente de potência alta ao nível dos poços gástricos (ampliação: 400 ×) no antro do estômago gerbilo (c). Os números médios de células Ki67-positivas são mostrados em cada grupo experimental. Diferenças significativas entre H. heilmannii
S.S.-inoculado e os animais de controlo são indicadas por * (ANOVA, p
< 0,05). diferenças significativas em comparação com ASB7 e grupos ASB9 inoculados são indicadas por + e # respectivamente (ANOVA, p Art < 0,05).
No fundo de olho de todos H. heilmannii gerbos infectados com ss
, o epitelial taxa de proliferação celular não foi significativamente maior em comparação com os animais controle (arquivo adicional 2). expressão do gene
de citocinas no estômago em resposta a H. ss heilmannii
infecção
A resposta imune host local no sentido de H. heilmannii
s.s. infecção foi caracterizado medindo o nível de expressão de ARNm de IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 e TNF-α no estômago dos gerbilos. Os resultados são apresentados na Tabela 2 e na Figura 2 4.Table A análise estatística dos níveis de expressão de ARNm.
Antrum
Fundus
IL-1β
IFN-γ

H + /K + ATPase
gastrina
média Ct-Ctrefa
p-valorB
média Ct-Ctref
valor-p
média Ct-Ctref
valor-p
Ct-Ctref
p-valor médio
ASB1
6,92 ± 0,29 *
0,031
6,87 ± 0,60
1.000
3,70 ± 2,11 *
0,050
7,20 ± 1,68
0,101
ASB2
7,48 ± 1,42
0,231
8,15 ± 1,26
1.000
2,42 ± 5,01
0,513
5,94 ± 2,49 *
0,050
ASB3
6,55 ± 0,80 *
0,008
7,54 ± 0,37
1.000
3,49 ± 2,28 *
0,050
7,71 ± 1,17
0,101
ASB6
6,12 ± 0,67 *
0,001
7,99 ± 0,90
1.000
2,23 ± 1,99 *
0,050
5,33 ± 2,39 *
0,025
ASB7
10,25 ± 0,37
1.000
7,98 ± 0,52
1.000
0,45 ± 2,51
0,724
7,12 ± 1,54
0,180
ASB9
9,03 ± 2,54
1.000
8,55 ± 0,71
1.000
0,79 ± 0,03
0,564
8,11 ± 1,58
1.000
ASB11
7,47 ± 0,15
0,499
10,45 ± 0,95 * 0,004

1,32 ± 1,45
0,248
7,67 ± 1,25
0,289
ASB13
7,72 ± 1,17
0,523
9,54 ± 1,55 *
0,044
3,80 ± 0,34
0,083
8,10 ± 0,93
0,456
ASB14
7,07 ± 0,52
0,054
8,51 ± 0,97
1.000
3,81 ± 3,11
0,127
7,77 ± 2,96
0,881 Controle
negativo
9,71 ± 1,13
- 7,08 ± 0,65
- 0,15 ± 1,82
- 8,70 ± 0,62
- é mostrada a análise estatística de IL-1β, IFN-γ e expressão de H + /K + ATPase ARNm na expressão de ARNm antro e gastrina no fundo do estômago gerbilo às 9 semanas após a infecção experimental. a expressão das citocinas foi analisada por análise de variância com um teste de Bonferroni post hoc. expressão de H + /K + ATPase e o gene da gastrina foram comparadas entre os diferentes grupos infectados e os controlos utilizando análise de Kruskall-Wallis, seguido por um Mann-Whitney U
teste. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p
≤ 0,05. SPSS Statistics 21 software (IBM) foi utilizado para todas as análises of a média Ct-Ctref:. Para cada grupo experimental, a média dos CT-valores normalizados ± desvio-padrão são mostrados
bp
-valor. : as p
exatas -Valores são dadas
* diferenças estatisticamente significativa em relação ao grupo controle não infectado (p
≤ 0,05)
Figura 4 níveis de expressão de mRNA das citocinas IL-1β e IFN-.. y no antro do estômago. Os níveis de expressão de mRNA de citocinas no fundus e antro do estômago foram examinadas por RT-PCR quantitativo. Os níveis de expressão de IL-1β (a) e IFN-γ (b) no antro são mostrados. Os dados são apresentados como a variação vezes na expressão de genes normalizados para 3 genes de referência e em relação ao grupo de controlo negativo, que é considerado como 1. Os dados estão apresentados como médias ± desvio padrão. diferenças significativas no nível de expressão entre os grupos inoculados e grupo controle negativo são indicados por * p Art < 0,05 (ANOVA).
A citocina pró- inflamatória IL-1β é um inibidor potente da secreção de ácido gástrico [30] e desempenha um papel na fase aguda da inflamação [31]. Expressão de IL-1β foi regulada para cima no antro do estômago de gerbos infectados com H. heilmannii
s.s. ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14, em comparação com os animais do controlo negativo (Figura 4A). Para gerbilos inoculados com ASB7 e ASB9, não sobre-regulação de IL-1β foi visto.
A citocina Th1 IFN-γ, um marcador de assinatura da resposta Th1 polarizadas [24, 32], exibiu uma expressão diminuída na antro de gerbos infectados com ASB11 e ASB13 (Figura 4b), em comparação com os animais de controlo.
Não houve diferenças significativas na expressão entre os gerbos infectados e inoculadas de forma simulada pode ser observado para a IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17 e TNF-α.
parietal celular H + /K + ATPase expressão de mRNA é regulada em resposta à colonização com H. heilmannii
ss
Sem clara perda de células parietais poderia ser visualizadas por coloração imuno-histoquímica, no fundo do olho e do antro do H. heilmannii gerbos infectados-ss
em comparação com os controles não infectados (dados não mostrados). No entanto, RT-PCR quantitativa mostrou uma clara diminuição na expressão de gástrica H + /K + ATPase no antro dos gerbilos infectados com ASB1, ASB3 e ASB6 (Figura 5 e Tabela 2). Em comparação com os animais de controlo com níveis de expressão de ARNm definida como 1,0, a expressão relativa média foi de 0,09 ± 2,11 para ASB1-, 0,10 ± 2,28 para 0,24 ± ASB3- e 1,99 para os gerbos infectados com ASB6, respectivamente. Nenhuma mudança significativa na expressão foi observada no fundo do H. heilmannii
S.S. gerbos infectados. Figura nível de expressão de ARNm 5 de H + /K + -ATPase no antro do estômago. Hidrogenossulfato de potássio nível de expressão de ARNm de ATPase no estômago foi examinada por RT-PCR quantitativo. nível de expressão de H + /K + ATPase ARNm no antro é mostrado. Os dados são apresentados como a variação vezes na expressão de genes normalizados para 3 genes de referência e em relação ao grupo de controlo negativo, que é considerado como 1. Os dados estão apresentados como médias ± desvio padrão. diferenças significativas no nível de expressão entre os grupos inoculados e grupo controle negativo são indicados por * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
teste).
virulento H. heilmannii
s.s. estirpes induzem a expressão aumentada de gastrina no fundo do olho
A gastrina hormônio peptídeo estimula a secreção de ácido gástrico pelas células parietais. Uma perturbação na sua expressão pode levar a hipergastrinemia. A expressão de gastrina foi altamente sobre-regulada no fundus de gerbos infectados com ASB2 ASB6 e às 9 semanas após a infecção (Figura 6 e Tabela 2). Em comparação com animais de controlo, a expressão relativa média foi de 6,79 ± 2,49 para ASB2- e 10,35 ± 2,39 para gerbos infectados com ASB6. No antro do estômago, não sobre-regulação da expressão de gastrina foi detectado. Figura nível de expressão de mRNA 6 de gastrina no fundo do estômago. nível de expressão de ARNm de gastrina do estômago foi examinada por RT-PCR quantitativo. É mostrado o nível de expressão na região do fundo. Os dados são apresentados como a variação vezes na expressão de genes normalizados para 3 genes de referência e em relação ao grupo de controlo negativo, que é considerado como 1. Os dados estão apresentados como médias ± desvio padrão. diferenças significativas no nível de expressão entre os grupos inoculados e grupo controle negativo são indicados por * p
≤ 0,05 (Mann-Whitney U
teste).
Discussão
Aos 9 semanas após a inoculação, a gastrite crónica activa no antro do estômago foi observada em gerbilos infectados experimentalmente com 7 de 9 H. heilmannii
SS cepas testadas neste estudo (ASB1, ASB2, ASB3, ASB6, ASB11, ASB13 e ASB14). A lâmina própria e submucosa foram maciçamente infiltrado com linfócitos, resultando na formação de folículos linfóides. O H. heilmannii
s.s. estirpes foram detectados principalmente no antro e em menor grau no fundo do útero e o duodeno. Nos seres humanos infectados com NHPh, colonização e inflamação também ocorrem principalmente no antro do estômago [5, 33-35]. Isto confirma que gerbilos da Mongólia são um modelo adequado para estudar H. heilmannii
s.s. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• análise da sequência do genoma do Helicobacter pylori associada a úlcera gástrica e câncer gástrico
• A atividade antimicrobiana, toxicidade aguda e efeito citoprotetor de crassocephalum vitellinum (. Benth) S. Moore extrair em um modelo de úlcera gástrica de ratos etanol-HCl