De overmethylated gener i Helicobacter pylori-infekterade magslemhinnan är demetylerade i magcancer

De overmethylated gener i Helicobacter pylori
infekterade magslemhinnan är demetylerade i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Övergångs-CpG platser mellan svagt metylerade gener och tätt metylerade retroelements är overmethylated i magslemhinnan infekterade med Helicobacter pylori
(H. pylori
) och de är undermethylated i gastric cancer beroende på graden av förlust av heterozygositet (LOH) händelser. Denna studie avgränsas övergångs-CpG metylering mönster av CpG-ö-innehållande och -lacking gener med tanke på retroelements.
Metoder
Övergångs-CpG platser i åtta CpG-ö-innehållande gener och sex CpG-ö -lacking gener halv kvantitativt undersökt genom att utföra radioisotop-märkning metylering-specifik PCR under stringenta betingelser. Nivån på LOH i mag cancer uppskattades med hjälp av de 40 mikrosatellitmarkörer på åtta cancerassocierade kromosomer. Varje gen bedömdes som overmethylated eller undermethylated baserat på en medelnivå i övergångs-CpG metylering vanliga i H. pylori
-negativ magslemhinnan.
Resultat sälja The åtta CpG-öar undersökta generna overmethylated beroende på närheten till närmaste retroelement i H.pylori
-positiv magslemhinnan. De sex CpG-ö-saknar gener liknande metylerades i H. pylori
-positiv och -negativ magslemhinnan. I gastric cancer, långa övergångs-CpG segment av CpG-öar gener långt från retroelements förblev overmethylated, medan overmethylation korta övergångs-CpG segment nära de retroelements var inte signifikant. Både CpG-ön innehållande och -lacking gener tenderade att vara allt mindre metylerade i en LOH-nivåberoende sätt
slutsatser sälja The overmethylated gener under inflytande av retroelement metylering i H. pylori
. - infekterade magsäcken demetyleras i gastric cancer påverkas av LOH.
bakgrund Review, en musmodell infekterad med Helicobacter pylori
(H. pylori
) har visat att stamceller från benmärgen migrera till magslemhinnan och då de differentieras till gastric epitelceller [1]. Enligt en självorganisationsmodell, kan höggradigt uttryckta master-gener bildar en transkriptions nav för att koordinera expressionen av många andra gener [2]. En dos kompensationsmekanism föreslår att det finns en omvänd korrelation mellan hushållning gener som innehåller CpG-öar och vävnadsspecifika gener som saknar CpG-öar, som båda delar en begränsad mängd nukleära proteiner i kärnutrymmet [3, 4]. Både självorganisering och doseringsersättningsmodeller betona att den epigenetiska samreglering av högaktiva magen specifika gener och svagt aktiva hushållningsgener underlättar trans-differentiering av märghärstammande celler i magen.
Individer infekterade med H. pylori
genomgår ofta en serie av magslemhinnan förändringar inklusive precancerous och cancerous lesions [5]. Även CpG-ö overmethylation som kan leda till inaktivering av cancerassocierade gener är vanligt i H. pylori
infekterade magslemhinnan, är tvetydig en association mellan overmethylation och uttryck av individuella CpG-öar gener [6]. Gastric precancerous och cancerous lesions har visat CpG-ö overmethylation samt genomet hela undermethylation, men de två distinkta metylering förändringar visade inget samarbete för den sekventiella utvecklingen av precancer och cancer [7]. Dessutom har de höggradigt uttryckta magen specifika gener spelar en mästare roll i samreglering av flera gener visat några metylering förändringar i gastric cancer [4, 8]. När det gäller att samordna genuttryck, är det nödvändigt att beskriva om magen specifika gener och housekeeping-gener genomgår samtidiga över- och under metylering förändringar. Sälja The retroelements är självreplikerparasit DNA som upptar hälften av den mänskliga genomet [ ,,,0],9]. Värdgenomet undertrycker den farliga mutationen effekten av de parasit retroelements via en DNA-metylering-beroende mekanism [10]. Övergångsområdet mellan de svagt metylerade gener och tätt metylerade retroelements, såsom CpG-ön marginal och transkriptionsstartstället saknar CpG-öar, metyleras i olika grad i en vävnadstyp beroende sätt [4, 11, 12 ]. Metylering av övergångs-CpG platser förändras dynamiskt som svar på den trans differentiering av benmärgsstromaceller och förlust-of-heterozygositet (LOH) händelser i gastric cancer [12-15]. En annan tidigare studie har också beskrivit att "CpG-ö strand" är relaterade till regleringen av celldifferentiering och carcinogenes [16]. Intressant nog många övergångs-CpG platser och genprodukter-angränsande retroelements är samtidigt över- eller undermethylated i en given vävnad [11, 17], vilket tyder på att de samtidiga metylering förändringar i många gener är under inflytande av retroelement metylering. Samtidigt har de flesta CpG-rika öar är svagt metylerade eller ometylerade i de flesta vävnadstyper, och CpG-rika platser är inte lämpliga för analys av dynamiska metylering intill gen-kontrollregioner [12, 13, 15, 18]. Därför övergångs-CpG platser, snarare än CpG-rika öar, kommer sannolikt att fungera som sväng metylering positioner som speglar samtidiga metyleringsmönster samband med H. pylori
infektion och utvecklingen av cancer.
Denna studie sökte övergångs-CpG metylering mönster av CpG-öar gener och magen specifika gener som saknar CpG-öar i H. pylori
infekterade magslemhinnan och gastric cancer. Den rörliga metylering av övergångs-CpG platser var halv kvantitativt uppskattas under stringenta metylering-specifik PCR (MSP) villkor som producerade klara DNA-band [4, 8]. En ökning eller minskning i övergångs-CpG metylering av varje gen bestämdes baserat på en mellanliggande metylering i H.pylori
-negativ magslemhinna.
Metoder
Insamling av vävnadsprover
icke-cancerösa vävnadsprover togs från de på varandra följande öppenvårdspatienter som genomgick gastric endoskopi från april 2008 till oktober 2009 vid St Pauls sjukhus, katolska universitetet i Korea. Under endoskopisk undersökning, var två intilliggande vävnadsprover från magen antrum och kroppsdelen, respektive. En biopsiprov fixerades med formalin för histologisk undersökning och andra biopsiprov användes för DNA-extraktion. Patologen bekräftade en gastric epithelial cellhalt av mer än 80% renhet i biopsivävnader. H. pylori
infektion undersöktes med hjälp av Warthin-Starry silver impregneringsmetod. Denna studie inkluderade 50 antrum och kroppspar i H. pylori
-negativa fall med en medelålder på 53,2, och 50 antrum och kroppspar i H. pylori
-positiva fall med en medelålder på 55,6. Det fanns 25 män och 25 kvinnor i H. pylori
-negativa fall och 26 hanar och 24 honor i H. pylori
-positiva fall. Magsäckscancer vävnader erhölls från de patologiska exemplar av 48 manliga och 22 kvinnliga patienter (medelålder: 63,7), som genomgick kirurgisk resektion mellan mars 2005 och december 2008 St Pauls sjukhus, Katolska universitetet i Korea. Den clinicopathologic tumörstadium bestämdes enligt den tumör Node-metastaser (TNM) kriterier [19]. Alla försökspersonerna om deras skriftligt informerat samtycke och studien godkändes av Institutional Review Board.
Tissue förberedelse och bisulfit modifiering av DNA
De färska biopsiprover användes för genomförbara semikvantitativ MSP analys, eftersom formalinfixerade vävnads DNA tenderar att vara dåligt amplifieras efter bisulfit modifiering [8]. För mikrosatellitanalys, var DNA som extraherats från de formalinfixerade paraffininbäddade tumörvävnader såsom beskrivits tidigare [20, 21]. Tumörprover microdissected med hjälp av en kirurgisk skalpell under ett stereomikroskop. Alla de microdissected cancervävnader innehöll en halt cancercell av mer än 80%. Med användning av DNA-extraktionsbuffert (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinas K), biopsiprover och microdissected vävnader digererades vid 37 ° C under 24 h. Cirka 1000-celler inkuberades med 20 mikroliter av DNA-extraktionsbuffert, varefter ett DNA-isoleringskit (A1120, Promega, Madison, WI, USA) användes för att extrahera genomiskt DNA i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Tissue DNA modifierades med hjälp av natriumbisulfit som beskrivs på annat håll [8, 11-13]. I korthet sattes en xg genom-DNA behandlades med 10 mikroliter av 3 M NaOH under 15 min vid 37 ° C. Då den denaturerade DNA: t blandades med 1,04 ml 2,3 M natriumbisulfit och 60 mikroliter av 10 mM hydrokinon och detta värmdes vid 50 ° C under 12 timmar. Den bisulfit behandlade DNA, som renades med användning av Wizard DNA-rening harts (Promega, Madison, WI, USA), fram desulfonated med 3 M NaOH och fälldes med etanol, och sedan löstes i 35

• Mindre vanliga slemhinnor metastaser till stomach
• CD44 men inte CD24 uttryck är relaterad till dålig prognos i icke-cardia adenocarcinom i stomach