Los genes overmethylated en la mucosa gástrica infectada por Helicobacter pylori se desmetilados en los cánceres gástricos

Los genes overmethylated en Helicobacter pylori
mucosa gástrica se infectado con desmetilados en los cánceres gástricos
Resumen Antecedentes

los sitios CpG transición entre los genes metilados débilmente y retroelements densamente metilado son overmethylated en la mucosa gástrica infectada con Helicobacter pylori
(H. pylori
) y se undermethylated en los cánceres gástricos en función del nivel de pérdida de eventos de heterocigosidad (LOH). En este estudio se delineó los patrones de transición CpG de metilación de la isla CpG que contienen los genes y -lacking a la vista de los retroelements.
Métodos
Los sitios de transición CpG de ocho genes que contienen las islas CpG y seis de la isla CpG -lacking genes se examinaron semi-cuantitativamente mediante la realización de PCR radioisótopo-etiquetado metilación específica en condiciones rigurosas. El nivel de LOH en los cánceres gástricos se estimó utilizando los 40 marcadores microsatélites en ocho cromosomas asociados con el cáncer. Cada gen se puntuó como overmethylated o undermethylated basado en un nivel intermedio de transición CpG metilación común en el H. pylori
mucosa gástrica -negativo.
Resultados
Los ocho genes de la isla CpG examinados se overmethylated dependiendo la proximidad a la retroelement más cercana en el H. pylori
mucosa gástrica -positivo. Los seis genes-isla-que carecen de CpG se metilado de manera similar en el H. pylori
mucosa gástrica -positivos y negativos. En los cánceres gástricos, largos segmentos de transición de CpG de los genes isla CpG distantes de las retroelements permanecieron overmethylated, mientras que el overmethylation de segmentos de transición CpG cortas cerca de las retroelements no fue significativa. Tanto la isla CpG que contiene y -lacking genes tendido a ser cada vez menos metilado de una manera LOH-dependiente del nivel de
Conclusiones
Los genes overmethylated bajo la influencia de la metilación retroelement en el H. pylori.
- estómago infectadas se desmetilado en los cánceres gástricos influenciados por LOH.
Antecedentes
Un modelo de ratón infectado con Helicobacter pylori
(H. pylori
) ha ilustrado que las células madre de la médula ósea migran a la mucosa gástrica y entonces se diferencian en células epiteliales gástricas [1]. De acuerdo con un modelo de auto-organización, genes maestros altamente expresados ​​pueden formar un cubo de la transcripción para coordinar la expresión de muchos otros genes [2]. Un mecanismo de compensación de dosis propone que existe una correlación inversa entre los genes de limpieza que contienen CpG islas y los genes específicos de tejido que carecen de CpG islas, que ambos comparten una cantidad limitada de proteínas nucleares en el espacio nuclear [3, 4]. Tanto los modelos de auto-organización y la dosis de compensación de relieve que la epigenética co-regulación de genes específicos de estómago muy activos y los genes de limpieza débilmente activos facilita la trans-diferenciación de las células derivadas de la médula en el estómago.
Los individuos infectados con H. pylori
con frecuencia experimentan una serie de cambios en la mucosa gástrica incluyendo lesiones precancerosas y cancerosas [5]. Aunque overmethylation isla CpG que pueden dar lugar a la inactivación de los genes asociados con el cáncer es común en el H. pylori
infectado con mucosa gástrica, una asociación entre el overmethylation y la expresión de los genes individuales de la isla CpG es ambigua [6]. lesiones precancerosas y cancerosas gástricas han demostrado overmethylation CpG isla, así como undermethylation de todo el genoma, pero los dos cambios de metilación distintos mostró ninguna cooperación para la evolución secuencial de precáncer y cáncer [7]. Además, los genes de estómago específico altamente expresados ​​que juegan un papel principal en la co-regulación de numerosos genes han demostrado algunos cambios de metilación en los cánceres gástricos [4, 8]. Con respecto a la expresión coordinada de genes, es necesario definir si los genes específicos del estómago y los genes de limpieza se someten a cambios de sobre y sub-metilación concurrentes. México La retroelements son ADNs parasitarias auto-replicantes que ocupan la mitad del genoma humano [ ,,,0],9]. El genoma del huésped suprime el efecto de mutación de los peligrosos retroelements parásitos a través de un mecanismo dependiente de la metilación del ADN [10]. La zona de transición entre los genes débilmente metilado y los retroelements densamente metilados, tales como el margen de CpG-isla y el sitio de inicio de la transcripción que carecen de CpG-islas, se metila en diversos grados de una manera tejido de tipo dependiente de [4, 11, 12 ]. La metilación de sitios CpG de transición cambia dinámicamente en respuesta a la trans-diferenciación de células estromales de médula ósea y los eventos de pérdida de heterocigosidad (LOH) en el cáncer gástrico [12-15]. Otro estudio anterior también se ha descrito que la "costa de la isla CpG" está relacionado con la regulación de la diferenciación celular y la carcinogénesis [16]. Curiosamente, muchos sitios de transición de CpG y retroelements genes adyacentes son simultáneamente sobre o undermethylated en un determinado tejido [11, 17], lo que indica que los cambios en la metilación concurrentes en numerosos genes están bajo la influencia de la metilación retroelement. Mientras tanto, la mayoría de islas CpG ricas son débilmente metilado o no metilado en la mayoría de tipos de tejidos, y los sitios CpG ricas no son adecuados para el análisis de metilación dinámico adyacente a las regiones de control de genes [12, 13, 15, 18]. Por lo tanto, los sitios CpG de transición, en lugar de las islas CpG ricas, es probable que sirva como posiciones de pivote de metilación que reflejan los patrones de metilación concurrentes asociadas con la infección por H. pylori
y la evolución del cáncer.
Este estudio investigado los patrones de metilación de CpG de transición de los genes de la isla CpG y los genes específicos que carecen de estómago-CpG-islas en H. pylori
con infección mucosa gástrica y cáncer gástrico. La metilación variable de los sitios de transición de CpG era estimado semi-cuantitativamente en condiciones rigurosas-PCR específica de metilación (MSP) que produjeron las bandas de ADN claras [4, 8]. se determinó un aumento o disminución en la metilación de transición de CpG de cada gen en base a una metilación intermedia en el H. pylori
mucosa gástrica -negativa.
Métodos
Colección de muestras de tejido
no canceroso muestras de tejido se obtuvieron de los pacientes ambulatorios consecutivos que fueron sometidos a endoscopia gástrica entre abril de 2008 octubre de 2009 en el hospital de St. Paul, la Universidad Católica de Corea. Durante el examen endoscópico, dos muestras de tejido adyacentes se obtuvieron de la parte del antro del estómago y el cuerpo, respectivamente. Una muestra de la biopsia se fijaron con formalina para el examen histológico y la otra muestra de biopsia se utilizó para la extracción de ADN. El patólogo confirmó un contenido de células epiteliales gástricas de más de 80% de pureza en los tejidos de la biopsia. H. pylori
la infección se examinó mediante el método de impregnación de plata de Warthin-Starry. Este estudio incluyó a 50 antro y cuerpo pares de H. pylori
casos negativos-con una edad media de 53,2, y 50 del antro y del cuerpo pares en H. pylori
casos -positivos con una edad media de 55,6. Hubo 25 hombres y 25 mujeres en el H. pylori
casos negativos-y 26 hombres y 24 mujeres en los casos
pylori H. -positivos. Los tejidos de cáncer gástrico se obtuvieron de las muestras patológicas de 48 a 22 pacientes de ambos sexos (edad media: 63,7), que fueron sometidos a resección quirúrgica entre marzo de 2005 y diciembre de 2008 en el Hospital de St. Paul, la Universidad Católica de Corea. El estadio tumoral clínico patológica se determinó según los criterios del tumor-nódulo-metástasis (TNM) [19]. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito y este estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional. Preparación de tejidos
y modificación con bisulfito del ADN
Las muestras de biopsia frescos fueron utilizados para el análisis de MSP semicuantitativa factible, debido fijado en formol ADNs de tejido tienden a estar mal amplificado después de la modificación con bisulfito [8]. Para el análisis de microsatélites, el ADN fue extraído de los tejidos tumorales incluidas en parafina fijadas con formalina como se describe anteriormente [20, 21]. Las muestras de tumor se microdissected usando un bisturí quirúrgico bajo un estereomicroscopio. Todos los tejidos de cáncer de microdissected contenían un contenido de células de cáncer de más de 80%. El uso de tampón de extracción de ADN (0,5% de Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml de proteinasa K), las muestras de biopsia y tejidos microdissected se digirieron a 37 ° C durante 24 hr. Aproximadamente 1.000 células se incubaron con 20 l de tampón de extracción de ADN después de lo cual un kit de aislamiento de ADN (A1120, Promega, Madison, WI, EE.UU.) se utilizó para extraer el ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se modificó el ADN de tejidos
el uso de bisulfito de sodio como se describe en otra parte [8, 11 a 13]. Brevemente, el ADN genómico 1 mg se trató con 10 l de NaOH 3 M durante 15 minutos a 37 ° C. A continuación, el ADN desnaturalizado se mezcló con 1,04 ml de 2,3 M de bisulfito de sodio y 60 l de hidroquinona 10 mM y esto se calentó a 50 ° C durante 12 horas. El ADN tratado con bisulfito, que se purificó usando resina de purificación de ADN Wizard (Promega, Madison, WI, EE.UU.), se desulfonated con NaOH 3 M y se precipitó con etanol, y luego se disolvió en 35 l de tampón Tris 5 mM (pH 8,0) .
radioisótopos-etiquetado de análisis de metilación semicuantitativa
análisis comparativo de los microarrays y SAGE (Serial análisis de la expresión génica) de datos ha encontrado que el número de transcripciones contadas en los datos de SAGE representa con precisión una gran diferencia en la actividad de genes entre los genes específicos del estómago y los genes de limpieza [4]. Los sitios de transición CpG de los genes específicos de estómago (PGA5
y PGC
) [22], los genes de la mucosa de curación (TFF1
y TFF2
) [23], la relacionada con el cáncer genes (CDH1
, MLH1
, PPARg
, CDKN2A
y RUNX3
) [15, 24-27], y los genes no gástricas (ARRDC4
, dusp6
, TRAPPC2L
, MSLN Opiniones y KRT6A
) [28-32] fueron seleccionados (Tabla 1). Los sitios MSP, secuencias y condiciones se muestran en el archivo adicional 1. Un contenido GC bajo y una secuencia repetitiva en el sitio CpG metilación de transición variable menudo mostraron bandas MSP débiles o manchas debido a la reducción de la complejidad de las secuencias de nucleótidos siguientes bisulfito tratamiento [4, 8, 33]. Con el fin de aumentar la especificidad de la amplificación-CpG de transición, cada conjunto de cebadores MSP fue diseñado para contener 3-5 sitios CpG y para abarcar un pequeño tamaño de amplificación, y la reacción MSP se llevó a cabo en condiciones rigurosas con el uso de dTTP-radioisótopo tal como se describe anteriormente [4, 8, 11, 12]. Brevemente, 10 l de una mezcla de PCR que contenía 1 l de ADN modificado con bisulfito, 1 Ci de α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, EE.UU.), 62,5 mM dATP, dCTP y dGTP, dTTP 25 mM, 1 pmol de los cebadores, 0,1% de Tween 20 y 0,3 unidad de Taq polimerasa
fue amplificado por 32 ciclos de PCR bajo inicio caliente condiciones de PCR. Los resultados de metilación representativos se muestran en la Figura 1 1A.Table El retroelement más cercana y la transcripción de los 14 genes seleccionados con y sin islas CpG
Gene
Islands of CpG
más cercano retroelement
No. de las transcripciones expresado en el estómago

Fotos Título de la familia
Distancia al sitio de inicio de la transcripción

CDH1
Sí
Alu
0,3 kb página 19
ARRDC4
Sí
Alu
1,7 kb página 7
PPARg
Sí
Alu
2,3 kb página 3
CDKN2A
Sí
LTR
2,4 kb
1

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