Les gènes overmethylated dans la muqueuse gastrique Helicobacter pylori infectés sont déméthylés dans les cancers gastriques

Les gènes overmethylated à Helicobacter pylori
muqueuse gastrique sont infecté par déméthylés dans les cancers gastriques
Résumé de l'arrière-plan
Les sites à CpG de transition entre les gènes faiblement méthylés et rétroéléments densément méthylés sont overmethylated dans la muqueuse gastrique infectée par Helicobacter pylori
(H. pylori
) et ils sont undermethylated dans les cancers gastriques en fonction du niveau de perte d'hétérozygotie (LOH) événements. Cette étude
délimité les modèles de méthylation CpG transitoires de CpG-île et contenant -lacking gènes en vue des rétroéléments. Méthodes
Les sites à CpG transitoires de huit CpG-île-contenant des gènes et six CpG-île -lacking gènes ont été examinés semi-quantitative en effectuant une PCR marquage radio-isotope spécifique de méthylation dans des conditions strictes. Le niveau de la LOH dans les cancers gastriques a été estimée à l'aide des 40 marqueurs microsatellites sur huit chromosomes associés au cancer. Chaque gène a été marqué comme overmethylated ou undermethylated basée sur un niveau intermédiaire de transition de méthylation CpG commune dans le H. pylori
muqueuse gastrique séronégatifs.: Résultats
Les huit gènes CpG island examinés ont été overmethylated selon la proximité de la rétroélément le plus proche dans le H. pylori
muqueuse gastrique -positif. Les six CpG-île dépourvue de gènes ont été similaire méthylés dans la muqueuse gastrique -positif et séronégatifs de H. pylori. Dans les cancers gastriques, de longs segments de transition CpG des gènes CpG island éloignés des rétroéléments sont restés overmethylated, alors que le overmethylation de courts segments de transition CpG près des rétroéléments n'a pas été significative. Tant le CpG-île et contenant les gènes -lacking avaient tendance à être de moins en moins méthylé d'une manière LOH-dépendant du niveau des Conclusions
Les gènes overmethylated sous l'influence de la méthylation rétroélément dans le H. pylori
. - estomac infecté sont déméthylation dans les cancers gastriques influencés par LOH.
Contexte
Un modèle de souris infectées par Helicobacter pylori
(H. pylori
) a montré que les cellules souches de la moelle osseuse migrent vers la muqueuse gastrique et puis ils se différencient en cellules épithéliales gastriques [1]. Selon un modèle d'auto-organisation, les gènes fortement exprimés de base peuvent former un moyeu de transcription pour coordonner l'expression de nombreux autres gènes [2]. Un mécanisme de compensation de dosage suggère qu'il existe une corrélation inverse entre les gènes de ménage contenant CpG-îles et les gènes spécifiques de tissus manquant CpG-îles, qui tous deux partagent une quantité limitée de protéines nucléaires dans l'espace nucléaire [3, 4]. Les deux modèles d'auto-organisation et de compensation de dosage mettent en évidence que la co-régulation épigénétique de gènes spécifiques de l'estomac très actifs et gènes de ménage faiblement actifs facilite la trans-différenciation des cellules dérivées de la moelle dans l'estomac.
Les personnes infectées par H. pylori
subissent fréquemment une série de changements de la muqueuse gastrique, y compris les lésions précancéreuses et cancéreuses [5]. Bien que CpG île overmethylation qui peut entraîner l'inactivation des gènes associés au cancer est commun dans le H. pylori de la muqueuse gastrique infecté par, une association entre la overmethylation et l'expression de gènes individuels CpG île est ambiguë [6]. lésions précancéreuses et cancéreuses gastriques ont montré CpG île overmethylation ainsi que undermethylation l'échelle du génome, mais les deux changements de méthylation distincts ont montré aucune coopération pour l'évolution séquentielle des lésions précancéreuses et le cancer [7]. En outre, les gènes spécifiques de l'estomac fortement exprimés en jouant un rôle de maître dans la co-régulation de nombreux gènes ont démontré quelques changements de méthylation dans les cancers gastriques [4, 8]. En ce qui concerne l'expression du gène de coordonnées, il est nécessaire de préciser si les gènes spécifiques de l'estomac et les gènes domestiques subissent des changements sur- et sous-méthylation simultanées.
Les ADNs sont rétroéléments parasitaires autorépliquants qui occupent la moitié du génome humain [ ,,,0],9]. Le génome de l'hôte supprime l'effet de la mutation dangereuse des rétroéléments parasitaires via un mécanisme dépendant de la méthylation de l'ADN [10]. La zone de transition entre les gènes faiblement méthylés et les rétroéléments densément méthylés, tels que la marge CpG-île et le site de début de transcription manque CpG-îles, est méthylé à des degrés divers d'une manière tissu de type dépendant [4, 11, 12 ]. La méthylation des sites CpG de transition change dynamiquement en réponse à la trans-différenciation de cellules stromales de la moelle osseuse et les (LOH), des événements de perte d'hétérozygosité dans les cancers gastriques [12-15]. Une autre étude précédente a également décrit que le «rivage CpG-island" est liée à la régulation de la différenciation cellulaire et la carcinogenèse [16]. Il est intéressant de nombreux sites CpG de transition et rétroéléments de gènes adjacents sont simultanément undermethylated sur- ou dans un tissu donné [11, 17], ce qui indique que les changements de méthylation simultanées dans de nombreux gènes sont sous l'influence de la méthylation rétroélément. Pendant ce temps, la plupart des îles riches en CpG sont faiblement méthylée ou non méthylée dans la plupart des types de tissus, et les sites riches en CpG ne conviennent pas pour l'analyse de méthylation dynamique adjacentes aux régions de contrôle de gène [12, 13, 15, 18]. Par conséquent, les sites CpG de transition, plutôt que CpG riches îles, sont susceptibles de servir de positions de pivot méthylation qui reflètent les modèles concurrents de méthylation associés à l'infection par H. pylori et l'évolution du cancer.
Cette étude étudié les modèles de transition-CpG méthylation des gènes CpG insulaires et les gènes spécifiques estomac manquant CpG-îles dans H. pylori
infectés par la muqueuse gastrique et les cancers gastriques. La méthylation variable de sites de transition-CpG était semi-quantitative estimée sous PCR (MSP) conditions spécifiques de méthylation rigoureuses qui ont produit des bandes d'ADN claires [4, 8]. Une augmentation ou une diminution de la méthylation CpG transitoire de chaque gène a été déterminée sur la base sur une méthylation intermédiaire dans le H. pylori
de la muqueuse gastrique séronégatifs.
Méthodes
Collection d'échantillons de tissus
non-cancéreuse des échantillons de tissus ont été prélevés sur les patients ambulatoires consécutifs qui ont subi une endoscopie gastrique d'Avril 2008 à Octobre 2009 à l'hôpital St. Paul, l'Université catholique de Corée. Au cours de l'examen endoscopique, deux échantillons de tissus adjacents ont été obtenus à partir de la partie antrale et le corps de l'estomac, respectivement. Un échantillon de biopsie a été fixé au formol pour l'examen histologique et l'autre spécimen de biopsie a été utilisée pour l'extraction de l'ADN. Le pathologiste a confirmé une teneur en cellules de l'épithélium gastrique de plus de 80% de pureté dans les tissus de biopsie. l'infection de H. pylori a été examinée selon la méthode d'imprégnation d'argent Warthin-Starry. Cette étude a inclus 50 corps et antre paires dans H. pylori de cas séronégatifs avec un âge moyen de 53,2 et 50 et le corps antre paires dans H. pylori
cas -positif avec un âge moyen de 55,6. Il y avait 25 hommes et 25 femmes dans les cas séronégatifs de H. pylori et 26 hommes et 24 femmes dans les pylori
cas -positifs H.. Les tissus de cancer gastrique ont été obtenus à partir des échantillons pathologiques de 48 22 patients masculins et féminins (âge moyen: 63,7), qui a subi une résection chirurgicale entre Mars 2005 et Décembre 2008 à l'hôpital St. Paul, l'Université catholique de Corée. Le stade de la tumeur clinicopathologique a été déterminée selon les tumeurs-Node-Metastasis (TNM) critères [19]. Tous les sujets ont donné leur consentement éclairé et cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel. Préparation des tissus
et la modification de l'ADN bisulfite
Les biopsies fraîches ont été utilisés pour faisable analyse semi-quantitative MSP, parce que la formaline fixe ADN de tissus ont tendance à être mal amplifié après modification bisulfite [8]. Pour l'analyse de microsatellites, l'ADN a été extrait des tissus de tumeur inclus dans la paraffine fixés au formol comme décrit précédemment [20, 21]. Les échantillons de tumeurs ont été microdisséquées à l'aide d'un scalpel chirurgical sous un stéréomicroscope. Tous les tissus cancéreux microdissection contenait une teneur en cellules cancéreuses de plus de 80%. En utilisant un tampon d'extraction d'ADN (0,5% de Tween-20, 1 mM d'EDTA pH 8,0, 50 mM de Tris pH 8,0, 0,5 mg /mL de proteinase K), les échantillons de biopsie et des tissus microdissection ont été digérés à 37 ° C pendant 24 heures. Environ 1000 cellules ont été mises en incubation avec 20 ul de tampon d'extraction d'ADN après quoi un kit d'isolement d'ADN (A1120, Promega, Madison, WI, USA) a été utilisé pour extraire l'ADN génomique selon les instructions du fabricant. ADN tissulaire
a été modifié en utilisant du bisulfite de sodium comme décrit par ailleurs [8, 11-13]. Brièvement, l'ADN génomique de 1 pg a été traitée avec 10 pi de NaOH 3 M pendant 15 min à 37 ° C. Ensuite, l'ADN dénaturé a été mélangé avec 1,04 ml de 2,3 M bisulfite de sodium et 60 ul de 10 mM d'hydroquinone, ce qui a été chauffé à 50 ° C pendant 12 heures. L'ADN traité au bisulfite, qui a été purifié en utilisant une résine de purification ADN Wizard (Promega, Madison, WI, USA), a été désulfoné avec NaOH 3 M et on précipite avec de l'éthanol, puis on l'a dissous dans 35 ul de tampon 5 mM de Tris (pH 8,0) .
radioisotopes-étiquetage analyse de la méthylation semiquantitatif
analyse comparative du microréseau et SAGE (analyse en série de l'expression génique) des données a révélé que le nombre de transcrits comptés dans les données de SAGE représente avec précision une grande différence dans l'activité de gènes entre les gènes spécifiques estomac et gènes de ménage [4]. Les sites de transition-CpG des gènes spécifiques à l'estomac (pGa5 et
PGC) [22], les gènes de la muqueuse-guérison (TFF1
et TFF2
) [23], associée-cancer du gènes (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A
et RUNX3
) [15, 24-27], et les gènes non-gastriques (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN
et KRT6A
) [28-32] ont été sélectionnés (tableau 1). Les sites de MSP, les séquences et les conditions sont indiqués dans le fichier supplémentaire 1. Une teneur en GC basse et une séquence répétitive dans la transition-CpG site de méthylation variable souvent montré des bandes de MSP faibles ou des marbrures en raison de la réduction de la complexité des séquences nucléotidiques suivantes bisulfite traitement [4, 8, 33]. Afin d'augmenter la spécificité de l'amplification transitoire CpG, chaque jeu d'amorces de MSP a été conçu pour contenir 3-5 sites CpG et pour englober une petite taille de l'amplicon et la réaction a été conduite MSP dans des conditions stringentes avec l'utilisation de dTTP-isotope radioactif tel que décrit précédemment [4, 8, 11, 12]. En bref, 10 ul d'un mélange PCR qui contenait 1 pl ADN modifié bisulfite, 1 uCi de α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 uM dATP, dCTP et dGTP, 25 uM de dTTP, 1 pmol d'amorces, 0,1% de Tween 20 et 0,3 unité de Taq polymérase de a été amplifié par 32 cycles de PCR dans des conditions de démarrage à chaud PCR. Les résultats de méthylation représentatifs sont présentés dans la figure 1A.Table 1 Le rétroélément le plus proche et la transcription des 14 gènes sélectionnés avec et sans îlots CpG
Gene
îles
CpG
le plus proche rétroélément
No. des transcriptions exprimé dans l'estomac


Nom de la famille
Distance au site d'initiation de la transcription

CDH1
Oui
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Oui
Alu
1,7 kb
7
PPARG
Oui
Alu
2,3 kb 3
CDKN2A
Oui
LTR
2,4 kb 1
TRAPPC2L

Oui
Alu
14
DUSP6
Oui
Alu de 3,8 kb
6,6 kb 8
MLH1

Oui
Alu
6,6 kb
0
RUNX3
Oui
LTR
8,3 kb
0
pGa5
Non
Alu
1,2 kb
734
PGC
No
Alu
33
TFF1
Pas de 1,6 kb
Alu
0,5 kb
11
TFF2
Non
2,7 kb de L1
632
MSLN
No
Alu 50
KRT6A
No
Alu
4,2 kb
1,4 kb 1
les informations concernant les îlots CpG, rétroéléments et le nombre de transcrits exprimés dans l'estomac a été obtenue à partir des données publiées antérieurement [4].
Figure 1 l'analyse semi-quantitative de la méthylation (A) et le clonage et le séquençage (B) dans les sites CpG de transition. La méthylation des sites CpG transitoire a été évaluée en effectuant une analyse de méthylation semi-quantitatif (A) et il a été vérifié avec le clonage et le séquençage de l'amorce commune (B). (A) Un total de 14 sites de transition-CpG ont été examinés dans le H. pylori
pylori
-positifs muqueuse gastrique et le cancer lésion séronégatifs et H. normale des patients atteints de cancer gastrique. La densité de la méthylation a été calculée en fonction de la proportion de l'intensité de la méthylation (M) de la bande contre la méthylation totale (U) et l'intensité de la bande de méthylation. La densité de la méthylation de chaque site CpG a été classé en 5 niveaux avec 20% minimum de -methylation. Le statut de méthylation de chaque gène a été classé comme undermethylation (sous-) ou overmethylation (sur-) basée sur un niveau de méthylation intermédiaire (inter) du pylori
muqueuse gastrique normale -négatif H.. (B) Les résultats représentatifs du clonage et de séquençage du PCR commun. Les sites à CpG transitoires de la CDH1
, CDKN2A
et les gènes RUNX3 de ont été analysés par le clonage et le séquençage du produit de PCR commun. Les ADN génomiques représentés dans la figure 1A ont été utilisés pour comparer les résultats de MSP avec les résultats de séquençage. Les cercles ouverts et fermés indiquent les résidus de cytosine non méthylés et méthylés, respectivement. Les boîtes rectangulaires indiquent les sites d'amorce MSP évaluation semi-quantitative de. De transition de méthylation CpG variation
La condition PCR de chaque amorce ensemble MSP a été validé en traçant la courbe standard en fonction de différents mélanges d'intensité de la bande à partir des produits de MSP avec ADN universel méthylé et non méthylé contrôle [11, 18]. L'ADN génomique traité avec de l'ADN méthylase (CpGenome méthylé ADN Universal, Chemicon, Temecula, CA, USA) et amplifié par une amorce universelle (5'-GCC ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') ont été utilisés pour le méthylé universel et ADN de contrôle non méthylé, respectivement. Sur la base de la courbe standard, la densité de méthylation du site CpG transitoire a été calculé en utilisant la formule suivante: méthylation proportion (%) = (intensité de méthylation /(méthylation + intensité de la méthylation)) x 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Afin de valider la reproductibilité de la densité de méthylation variable à l'aide d'une analyse semi-quantitative, la classification de niveau 5 avec 20% d'augmentation de la classification et -methylation 10 niveaux avec 10% d'augmentation -methylation ont été comparés aux échantillons de tissus appariés. L'analyse comparative des échantillons appariés a été effectué en utilisant les ADN doubles des 40 tissus et de 48 paires de tissus 1 cm adjacents, en plus de 100 paires de tissus de l'antre et du corps qui ont été obtenus à partir du 50 H.pylori
- tissus de l'estomac négatifs et les tissus de l'estomac -positif de 50 H. pylori (Figure 2). Figure 2: Analyse de la méthylation de variables dans les sites CpG de transition. (A et B) La reproductibilité de la classification 5 niveaux avec 20% -methylation incrément (A) et 10 au niveau des classifications avec 10% -methylation incrément (B) a été vérifiée par la proportion des échantillons de tissus appariés montrant aucune différence dans le niveau de méthylation. Les ADN doubles du même tissu (barres fermées), une paire de tissus de 1 cm adjacents (barres grises) et une paire de sinus maxillaire et les tissus du corps (barres vides) ont été comparés. (C et D) Analyse d'un niveau de méthylation intermédiaire. La fréquence des cas undermethylated et overmethylated a été estimé sur la base d'un niveau intermédiaire couvrant deux niveaux (20% méthylation) (C) et un niveau (10% méthylation) (D) de la classification 10 niveaux communs dans H. pylori
- muqueuse gastrique négatif.
le taux de chaque site transitoire-CpG dans la muqueuse gastrique -positif et -négatif du H. pylori overmethylation a été calculé par la proportion relative des cas overmethylated à la somme totale de la sur- et sous cas -methylated. taux de overmethylation -Associated Le H. pylori de a été calculée en utilisant le H. pylori
--positif à négative rapport de chaque taux transitoire-CpG-overmethylation. Il a été utilisé pour évaluer la relation entre la méthylation des sites CpG de transition et la distance entre le site d'initiation de la transcription et le rétroélément le plus proche (figure 3). La figure 3 H.pylori de la méthylation des gènes induite par CpG-island et contenant -lacking en fonction de la distance par rapport aux rétroéléments les plus proches et l'activité de transcription. Un total de 14 sites de transition-CpG ont été regroupées en huit gènes CpG island (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
et RUNX3
) et six gènes dépourvus de CpG-îles (pGa5
,
PGC, TFF1
, TFF2
, MSLN
et KRT6A
). La distance génétique-rétroélément a été estimé entre les sites de démarrage de la transcription et les plus proches Alu, L1 ou LTR rétroéléments. taux de méthylation induite par le H. pylori de était représentée par le H. pylori
--positif à négative rapport du taux de overmethylation. Le taux de overmethylation a été calculée en fonction de la proportion relative des cas overmethylated à la somme totale des cas sur- et sous-méthylés. L'activité de transcription de chaque gène a été montré que le nombre de transcrits exprimés [4].
Clonage et séquençage du site de méthylation variable
Les résultats MSP de sites CpG transitoires ont été reconfirmé avec le clonage et le séquençage du PCR commun des ensembles d'amorces englobant à la fois aux sites méthylés et non méthylés CpG (figure 1B) [4, 11, 12]. Les produits de PCR des jeux d'amorces communes ont été clonées dans le T & Un vecteur de clonage (Real Biotech, Taipei, Taiwan). Le séquençage de l'ADN a été réalisée pour 10 clones des vecteurs communs de PCR en utilisant le kit de terminaison BigDye (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) et un séquenceur d'ADN automatisé ABI (PE Biosystmes, Warrington, Royaume-Uni). Parce que les jeux d'amorces communes couvrant les régions CpG pauvres ont produit divers degrés de méthylation selon la condition PCR, nous avons ajusté la condition PCR de l'amorce commune définie pour obtenir la densité de méthylation qui était similaire dans les deux l'essai MSP semi-quantitative et analyse des résultats du séquençage des 10 clones communs-PCR. allèles microsatellites
Pour l'analyse de LOH basée sur la PCR, un total de 40 marqueurs microsatellites sur huit chromosomes associés au cancer (3p, 4p, 5q, 8p, 9p , 13q, 17p et 18q) et les lignes directrices pour la notation du statut de LOH et MSI ont été utilisés comme décrit ailleurs [20, 21]. Le profil allélique des 40 séquences microsatellites examinées dans chaque cas a été initialement classées en MSI basée sur la présence de nouveaux allèles du marqueur homozygote et la perte allélique unilatérale du marqueur hétérozygote. Selon le nombre de chromosomes LOH-positif, le niveau de LOH a été marqué comme bas niveau (deux ou trois pertes chromosomiques, LOH-L) et de haut niveau (quatre ou plus de pertes chromosomiques, LOH-H) LOH. Un ou pas de pertes chromosomiques ont été classés dans le niveau de base (LOH-B) pour le cancer de type diffus et dans le faible niveau de type intestinal et mixte, respectivement, en fonction de leur sous-type histologique correspondant.
Analyse statistique
test exact de Fisher a été utilisé pour comparer les changements sur- et sous-méthylation entre la muqueuse gastrique séronégatifs ou -positif de H. pylori et les cancers gastriques, avec la signification attribuée à des valeurs inférieures à P
valeurs inférieures à 0,01 . t
Le test de Student a été utilisé pour comparer les différences de méthylation entre les tissus non cancéreux et cancéreux gastriques, avec la signification attribuée à des valeurs inférieures à P
valeurs inférieures à 0,05. L'évaluation statistique a été réalisée en utilisant le logiciel statistique SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).: Résultats
méthylation variation dans les tissus noncancerous
Un total de 14 sites de transition-CpG ont été choisis à partir de huit gènes CpG island (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
et RUNX3
) et six CpG gènes (pGa5
,
PGC, TFF1
, TFF2
, MSLN
et KRT6A
) (tableau 1) d'île en-défaut. La reproductibilité de transition CpG emplacement amplifié par chaque jeu d'amorces de MSP a été évaluée avec les ADN doubles du même tissu, une paire de tissus de 1 cm adjacents et une paire de tissus de l'antre et du corps (figure 2A et 2B). 92% des 40 ADN doubles, 73% des 48 paires de tissus de 1 cm adjacents, et 58% des 100 corps et antre paires ont été notés comme les mêmes niveaux de méthylation dans la classification 5 niveaux. Les mêmes sécable cas des expériences dupliquées étaient environ 25% plus fréquentes dans la classification 5 niveau que dans la classification de niveau 10.
Un niveau intermédiaire de la variable de transition de méthylation CpG a été analysée en utilisant 1.400 amplicons MSP du 14 les sites de transition-CpG obtenus à partir de 100 H. pylori
échantillons d'estomac séronégatifs (Figure 2C et 2D). Dans la classification de niveau 10, la fraction d'un niveau de méthylation commun unique (38%) était si faible que le niveau intermédiaire a été déterminé sur la base de deux niveaux communs. 937 (67%) des 1.400 amplicons MSP ont été classés dans un niveau intermédiaire dans les 100 tissus. niveaux de méthylation intermédiaires de huit marges CpG insulaires ont tendance à être inférieurs à ceux des six sites insulaires dépourvue de CpG (tableau 2). Dans l'ensemble, les grandes fractions de tissus individuels d'estomac (67%) et des paires de tissus de 1 cm adjacents (73%) ont montré que les sites CpG transitoires ont été méthylés dans une gamme de densités similaires variant entre environ 20%. Par conséquent, un niveau intermédiaire couvrant deux niveaux (20% méthylation) de la classification de niveau 10 a été utilisé pour déterminer la sur- ou sous-méthylés état des sites transitoires-CpG dans l'mucosa.Table gastrique 2 La fréquence de sous et sur- cas méthylés comme déterminé en fonction des niveaux intermédiaires de méthylation communes dans le H. pylori de la muqueuse gastrique séronégatifs (n = 100)
nom Gene
densité de méthylation
intermédiaire
No. des cas méthylés sous-
No. des cas de méthylation intermédiaires
No. des cas méthylés sur-
CpG île contenant des gènes
CDH1
0 - 20%
0
79
21
ARRDC4

0 - 20%
0
80
20
PPARG

0 - 20%
0
60
40
CDKN2A

0 - 20%
0
54
46
TRAPPC2L
40 - 60%
13
81
6
DUSP6
20 - 40%
26
62
12
MLH1
20 - 40%
20
61
19
RUNX3
30 - 50%
5
53
42
CpG île manque gènes
pGa5
40 - 60%
10
78
12
PGC
40 - 60 29 67
4
TFF1
%
20 - 40%
11
52
37
TFF2
30 - 50%
36
60 4
MSLN
60 - 80%
0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
relation entre H. pylori
- overmethylation associée soit l'activité de transcription ou de rétroéléments
les fréquences des cas sur- et sous-méthylés ont été comptées séparément pour estimer les modifications de la variable de méthylation des sites CpG de transition (tableau 3). Sur l'analyse des cas overmethylated, toutes les marges CpG insulaires étaient significativement overmethylated dans le H. pylori
infectés par l muqueuse gastrique et aucun des-île dépourvue de CpG des sites a montré une différence significative de la fréquence des cas overmethylated . Sur l'analyse des cas undermethylated, la fréquence du TFF1
gène undermethylated était très faible dans le H. pylori
muqueuse gastrique -positif (P
= 0,003). Les données de méthylation de la moelle osseuse a été cité à partir d'une étude précédente, en utilisant le même protocole de marquage radio-isotope MSP [4]. Dans la moelle osseuse, le
PGC, TFF1
, MSLN
et RUNX3
gènes étaient complètement méthylé, alors que la plupart des gènes CpG insulaires étaient complètement unmethylated.Table 3 Comparaison de la fréquence de sur- et les gènes undermethylated détectés dans les tissus gastriques non-cancéreuses et cancéreuses
Gene

tissu noncancerous
microsatellites génotype de cancers gastriques (%)
moelle osseuse

H.
négatif pylori (n = 100)
H.
positive pylori (n = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29)

LOH-H
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18)
(%)

fréquence Overmethylation
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24)
3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 *
3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
1 ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9 (69)
16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 *
3 (23)
3 (10)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
MLH1
19
37 *
4 (31)
17 (59) *
11 ( 46)
3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
pGa5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4
10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38)
3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4 3
4 (31)
4 (14)
1 (4)
0 (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) *
16 (55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17)
3 (75)
3 (17)
Undermethylation fréquence
CDH1

0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25)
16 (89)
DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50)
18 (100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
1 (25)
17 (94)
RUNX3
5 1
0 (0 )
1 (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
pGa5
10
14
0 (0 )
3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) *
3 (75)
0 (0)
TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33)
3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
1 (3)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23)
3 (10)
3 (13)
1 (25)
5 (28)
Les cancers gastriques ont été classés en LOH au niveau de référence (LOH-B) , bas niveau LOH (LOH-L), LOH de haut niveau (LOH-H) et l'instabilité des microsatellites (MSI). Les détails sont décrits dans la section matériel et méthodes.
* H. cancers de la muqueuse gastrique et gastriques -positif de pylori ont été comparés à H. pylori
-négatif muqueuse gastrique. Des différences significatives ont été déterminées en utilisant le test exact de Fisher (P
< 0,01).
La relation entre la méthylation transitoire-CpG et la distance à l'rétroélément le plus proche a été évaluée en utilisant le H. pylori
taux de overmethylation -Associated (figure 3). Dans les gènes CpG island, le taux de overmethylation -Associated H. pylori était plus élevée que pour la distance du plus proche rétroélément est devenue plus courte. On a comparé l'îlot CpG dépourvue des gènes qui n'a montré aucune différence significative entre la méthylation de la muqueuse et -positif -négatif de la bactérie H. pylori ont été méthylés quelle que soit la distance de la rétroélément le plus proche. Le plus la méthylation des sites CpG de transition entre l'estomac et de la moelle osseuse en fonction de l'activité de transcription (Tableau 1 et Figure 4). Le groupe de gènes CpG île qui était faiblement active dans l'estomac était plus méthylé dans les tissus séronégatifs et -positif de H. pylori que celle dans la moelle osseuse. De l'îlot CpG dépourvue TFF2
et les gènes de pGa5 qui ont été plus fortement exprimé dans l'estomac, au niveau du gène de la TFF2 de méthylation moyen était plus faible que dans la moelle osseuse (1,9) que dans le H. pylori
séronégatifs (2,6, P = 0,015
) et de la muqueuse -positif (2,7, P = 0,015
). Le niveau du gène de la pGa5 de méthylation moyen était similaire dans la moelle osseuse (3,1) et de H. pylori
séronégatifs (3,0) et des muqueuses -positif (3.0). Le
PGC et les gènes spécifiques de l'estomac de TFF1, qui étaient faiblement active dans la muqueuse gastrique par rapport aux gènes spécifiques de l'estomac à deux maîtres, étaient densément méthylé dans la moelle osseuse (niveau moyen de la méthylation, 4.3 et 4.8). La figure 4 méthylation dans la moelle osseuse et les tissus non cancéreux et cancéreux gastriques. Le niveau moyen de la méthylation dans la moelle osseuse (●), H. pylori
muqueuse gastrique séronégatifs (■), H. pylori
muqueuse gastrique -positif (♦) et les cas de LOH au niveau de référence (

• métastases muqueuses Peu fréquent aux stomach
• CD44 mais pas l'expression de CD24 est liée à un mauvais pronostic chez les non-cardia adénocarcinome du CD44 stomach