Į overmethylated genų Helicobacter pylori infekuotų skrandžio gleivinės yra demetilinamas skrandžio vėžio

Į overmethylated genų Helicobacter pylori pervežimas -infected skrandžio gleivinę yra demetilinamas skrandžio vėžio
Anotacija
faktai
pereinamojo-CpG svetainių tarp silpnai denatūruotu genų ir tankiai denatūruotu retroelements yra overmethylated į skrandžio gleivinę užsikrėtę Helicobacter pylori
(H. pylori
) ir jie yra undermethylated į skrandžio vėžio, priklausomai nuo praradimo heterozigotiškumu (LOH) įvykių lygiu. Šis tyrimas apibrėžta pereinamojo laikotarpio-CpG metilinimas modelius CpG salų, kurių sudėtyje yra ir -lacking genus, atsižvelgiant į retroelements.
Metodai Viesbutis The pereinamojo-CpG svetainių aštuonių CpG salų, kurių sudėtyje yra genų ir šešių CpG-saloje -lacking genai buvo pusiau kiekybiškai išnagrinėjo atliekant radioizotopas ženklinimas metilinimas-konkretų PGR pagal griežtas sąlygas. Iš LOH lygis skrandžio vėžio buvo įvertintas naudojant 40 mikrosatelitinius žymekliai aštuonis vėžį susijusios chromosomų. Kiekvienas genas buvo įmušė įvartį, kaip overmethylated arba undermethylated remiantis vidutinio lygio pereinamojo-CpG metilinimo paplitusi H. pylori
neigiamojo skrandžio gleivinę.
Rezultatai Viesbutis The aštuonių CpG salų genų tirtų buvo overmethylated priklausomai nuo arti iki artimiausios retroelement į H. pylori
-positive skrandžio gleivinę. Šeši CpG-island-trūksta genai buvo panašiai metilinti H. pylori
-positive ir negative skrandžio gleivinę. Skrandžio vėžio, ilgas pereinamasis-CpG segmentuose CpG salų genų toli nuo retroelements liko overmethylated, tuo tarpu trumpas pereinamasis-CpG segmentų artimų į retroelements overmethylation nebuvo reikšmingas. Tiek CpG salų, kurių sudėtyje yra ir -lacking genai linkę būti decreasingly metilo į LOH lygio priklausomu būdu
Išvados Viesbutis The overmethylated genų pagal iš retroelement metilinimo įtaka H. pylori pervežimas. - užkrėstų skrandis yra demetilinamas skrandžio vėžio daro įtaką LOH.
faktai
pelės modelį užsikrėtę Helicobacter pylori
(H. pylori pervežimas) iliustravo, kad kaulų čiulpų kamieninės ląstelės migruoja į skrandžio gleivinę ir tada jie atskirti į skrandžio epitelinių ląstelių [1]. Pagal savarankiško organizavimo modelio, labai išreikšti tikrųjų genai gali sudaryti transkripcijos šakotuvą koordinuoti daugelio kitų genų [2] išraiška. Vaisto kompensavimo mechanizmas siūlo, kad yra atvirkštinis ryšys tarp namų ruošos genai, kurių sudėtyje yra CpG-saloms ir audinių specifinių genų trūksta CpG-salas, kurios abi dalijasi ribotą kiekį branduolinių baltymų branduolinės erdvėje [3, 4]. Tiek saviorganizacija ir dozavimo kompensavimo modeliai pabrėžti, kad epigenetinius bendrai reguliavimas labai aktyvi skrandžio konkrečių genų ir silpnai veikiančių namų ruošą genų palengvina Trans-diferenciaciją čiulpų kilmės ląstelių skrandį.
Asmenys, užsikrėtę H. pylori
dažnai pasitikrinti skrandžio gleivinės pokyčių serijos, įskaitant ikivėžinius ir vėžinių pakitimų [5]. Nors CpG salų overmethylation, kad gali sukelti vėžį susijusios genų nukenksminti yra paplitusi H. pylori
-infected skrandžio gleivinę, tarp į overmethylation ir saviraiškos atskirų CpG salų genų asociacija yra dviprasmiškas [6]. Skrandžio ikivėžinių ir vėžinių pakitimų parodė CpG salų overmethylation taip pat genomo undermethylation, tačiau dvi skirtingos metilinimo pokyčiai neparodė bendradarbiavimą dėl eilės evoliucija precancer ir vėžys [7]. Be to, labai išreikštos skrandžio konkrečiai genai žaidžia meistras vaidmenį bendro reguliavimo daugelio genų parodė keletą metilinimo pokyčiai skrandžio vėžio [4, 8]. Su pagarba koordinuoti genų ekspresiją, būtina apibrėžti, jei skrandžio konkrečiai genai ir buities genai atlikti vienu metu per daug ir pagal-metilinimo pokyčiai.
Retroelements yra savarankiškai pakartoti parazitinių DNR, kurios užima pusę žmogaus genomo [ ,,,0],9]. Priimančioji genomo slopina pavojingas mutacijos poveikį parazitinių retroelements per DNR metilinimo priklauso nuo mechanizmo [10]. Pereinamasis plotas tarp silpnai metilinti genų ir tankiai metilintų retroelements, pavyzdžiui, CpG-salos atsargos arba transkripcijos pradžios vietoje trūksta CpG-salos, metilinamas įvairių laipsnių į audinio tipo priklausomu būdu [4, 11, 12 ]. Pereinamojo laikotarpio-CpG svetainių metilinimas keičia dinamiškai reaguojant į trans-diferenciacijos kaulų čiulpų stromos ląstelėse ir netekus heterozigotiškumo (Loh) įvykių skrandžio vėžio [12-15]. Kitas Ankstesnis tyrimas taip pat buvo aprašyta, kad "CpG salų kranto" yra susijęs su ląstelių diferenciacijos ir kancerogeninio poveikio [16] Reglamentas. Įdomu tai, kad daugelis pereinamasis-CpG svetaines ir genų greta retroelements vienu metu per daug arba undermethylated tam tikroje audinio [11, 17], nurodant, kad vienu metu metilinimo pokyčiai daugelio genų pagal retroelement metilinimo įtakos. Tuo tarpu dauguma CpG turtingas salos silpnai metilo arba nemetilintas daugumoje audinių tipų, o CpG turtingas svetaines netinka dinaminės metilinimo šalia genų kontrolės regionuose [12, 13, 15, 18] analizė. Todėl, pereinamojo laikotarpio, CpG svetaines, o ne CpG turtingas salų, gali tarnauti kaip švytavimo-metilinimas pozicijų, kad atspindėtų vienu metu metilinimas modelius, susijusius su H. pylori infekcija
ir vėžio vystymosi.
Šis tyrimas tyrė pereinamosios CpG metilinimas modelius CpG salų genų ir skrandžio konkrečių genų trūksta CpG-salų H. pylori pervežimas -infected skrandžio gleivinę ir skrandžio vėžio. Kintamasis metilinimo pereinamasis-CpG svetainių buvo pusiau kiekybiškai įvertintas pagal griežtus metilinimas konkrečių PGR (JEP) sąlygų, kad pagamintų aiškius DNR juostų [4, 8]. Padidėjimas ar sumažėjimas pereinamojo-CpG metilinimo kiekvieno geno buvo nustatoma remiantis tarpiniu metilinimo į H. pylori pervežimas neigiamojo skrandžio gleivinę.
Metodai
kolekcija audinių mėginių
nevėžinės audinio mėginiai buvo imami iš eilės ambulatoriškai, kuriems buvo atlikta skrandžio endoskopija nuo 2008 balandžio iki 2009 metų spalio Šv Pauliaus ligoninė, katalikiškojo universiteto Korėjoje. Per endoskopinio tyrimo, dviejų gretimų audinio mėginiai buvo paimti iš skrandžio Ertmė ir kūno dalį, atitinkamai. Vienas biopsijos mėginys buvo susietas su formalinu už histologinis nagrinėjimo ir kitų biopsijos egzempliorius buvo naudojami DNR ekstrakcijai. Patologas patvirtino skrandžio epitelio ląstelių kiekis yra didesnis kaip 80% grynumo į biopsijos audiniuose. H. pylori
infekcija buvo tiriama naudojant Warthin-Žvaigždėtas sidabro impregnavimo metodą. Šiame tyrime dalyvavo 50 Ertmė ir kūno poras H. pylori
negative atvejus, kurių amžiaus vidurkis 53,2 ir 50 Ertmė ir kūno poras H. pylori
-positive atvejais su amžiaus vidurkis 55,6. Nebuvo 25 vyrai ir 25 moterys į H. pylori
negative atvejais ir 26 vyrai ir 24 moterys iš H. pylori
-positive atvejais. Skrandžio vėžio audiniuose buvo gauti iš patologinių egzempliorių 48 vyrų ir 22 moterų pacientams (amžiaus vidurkis: 63,7), kuriems buvo atlikta chirurginė rezekcija nuo 2005 kovo iki 2008 m gruodžio Šv Pauliaus ligoninė, katalikiškojo universiteto Korėjoje. Clinicopathologic naviko stadija buvo nustatomas atsižvelgiant į naviko-limfmazgius Metastazė (TNM) kriterijais [19]. Visi dalykai, jei jų rašytinį informuoto sutikimo ir šis tyrimas patvirtino institucinę ekspertizės valdyba.
Audinių preparatuose ir bisulfito modifikacija DNR Viesbutis The šviežių biopsijos buvo naudojami įmanoma pusiau kiekybiniam MSP analizės, nes formalinu fiksuotų audinio DNR linkę būti prastai papildyta po bisulfito modifikacijos [8]. Už mikrosatelitiniai analizės, DNR buvo ekstrahuojama iš formalinu fiksuoto parafine navikų audiniuose, kaip aprašyta anksčiau [20, 21]. Naviko egzemplioriai buvo microdissected naudojant chirurginį skalpelį pagal stereomikroskopais. Visi iš microdissected vėžio audiniai, kurie yra yra vėžinių ląstelių kiekis yra didesnis nei 80%. Naudojant DNR išskyrimo buferinio tirpalo (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA, pH 8,0, 50 mmol Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinazės K), biopsijos mėginiai ir microdissected audiniai buvo suardomas 37 ° C temperatūroje 24 val. Maždaug 1000 ląstelės buvo inkubuojami su 20 pL DNR išskyrimą buferyje, po kurio DNR išskyrimas rinkinys (A1120, Promega, Madison, WI, JAV) buvo panaudotas, kad ištrauktų genominę DNR pagal gamintojo instrukcijas.
Audinių DNR buvo pakeistas naudojant natrio bisulfite kaip aprašyta kitur [8, 11-13]. Trumpai, 1 mikrogramų genominės DNR buvo gydomi 10 pL 3 M NaOH 15 min 37 ° C temperatūroje. Tada denatūruotas DNR buvo sumaišyti su 1,04 ml 2,3 M natrio bisulfito ir 60 pL 10 mM hidrochinono ir tai buvo pašildytas iki 50 ° C temperatūroje 12 val. Bisulfito apdorojimo DNR, kuri buvo gryninamas naudojant vedlys DNR valymo dervos (Promega, Madison, WI, JAV), buvo desulfonated su 3 M NaOH ir nusodinama etanoliu, ir tada buvo ištirpinta 35 pL 5 mM Tris buferiu (pH 8,0) .
Radioisotope ženklinimas pusiau kiekybiniai testo metilinimo analizė
lyginamoji analizė mikrogardeliq ir šalavijas (Serijos analizė genų ekspresijos) duomenimis nustatė, kad nuorašai skaičiuojami "Sage duomenų, tiksliai atspindi didelį skirtumą genų veiklos tarp skrandžio konkrečiai genai ir namų genai [4]. Pereinamojo laikotarpio-CpG svetainės skrandžio konkrečių genų (PGA5 parsisiųsti ir PGC
) [22], gleivinės gijimo genai (TFF1 parsisiųsti ir TFF2
) [23], vėžys susijusi genai (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A parsisiųsti ir RUNX3
) [15, 24-27], o ne skrandžio genų (ARRDC4
, DUSP6
TRAPPC2L
, MSLN parsisiųsti ir KRT6A
) [28-32] buvo atrinkti (1 lentelė). MSP svetaines, sekas ir sąlygos rodomi papildomų failų 1. mažas GC kiekis ir pasikartojantis seka metilinimo kintamųjų pereinamuoju-CpG svetainėje dažnai parodė silpnąsias arba dergimas MSP juostas dėl sumažinto sudėtingumo nukleotidų sekų po bisulfitu gydymas [4, 8, 33]. Tam, kad padidinti pereinamuoju-CpG amplifikacijos specifiškumą, kiekvienas MSP pradmenų rinkinio buvo sukurta siekiant būti 3-5 CpG vietas ir apima mažą amplikono dydį, ir JEP reakcija buvo atliktas esant griežtoms sąlygoms su naudojant dTTF-radioizotopų, kaip aprašyta anksčiau [4, 8, 11, 12]. Trumpai tariant, 10 pL PGR mišinio, kuriame buvo 1 iL bisulfite modifikuotą DNR, 1 μCi iš a- 32P dTTF (PerkinElmer, Bostonas, MA, JAV), 62,5 mkm dATF, dCTP ir dGTP, 25 mkm dTTF 1 pmol gruntai, 0,1% Tween 20 ir 0,3 vienetas Taq polimerazės
sustiprino 32 PGR ciklų pagal karšto pradėti PGR sąlygas. Tipinės metilinimo rezultatai rodomi 1A.Table 1 pav Artimiausias retroelement ir 14 atrinktų genus su ir be CpG salų
Gene
transkripcijos
CpG salos
Artimiausia retroelement

Nr pareikštos nuorašai į skrandį


pavadinimas šeimai
Atstumas iki transkripcijos starto svetainėje

CDH1
Taip
aliuminio
0.3 KB
19
ARRDC4
Taip
aliuminio
1.7 KB
7
PPARG

Taip
aliuminio
2.3 KB
3
CDKN2A
Taip
LTR
2.4 KB
1
TRAPPC2L

Taip
aliuminio
3.8 KB
14
DUSP6
Taip
aliuminio
6.6 KB
8
MLH1

Taip
aliuminio
6.6 KB
0
RUNX3
Taip
LTR
8,3 kb
0
PGA5

Nėra
aliuminio
1.2 kb
734
PGC
Nėra
aliuminio
1.6 KB
33
TFF1
Ne
aliuminio
0,5 kb
11
TFF2
Nėra
L1
2,7 kb
632
MSLN
Nėra
Alu
1.4 KB
50
KRT6A
Nėra
Alu
4.2 KB
1
informaciją apie CpG salas, retroelements ir išreikštų nuorašai numerį skrandis buvo gauta iš anksčiau paskelbtais duomenimis [4].
1 paveikslas pusiau kiekybinis metilinimo analizė (A) ir klonavimą ir seka (b) pereinamojo-CpG svetainėse. Iš pereinamasis-CpG vietų metilinimas buvo įvertintas atliekant pusiau kiekybinį metilinimo analizę (A) ir ji buvo patikrintas naudojant klonavimo ir sekos nustatymas bendrosios grunto (B). (A) 14 pereinamosios CpG svetainių iš viso buvo nagrinėjamas H. pylori pervežimas negative ir H. pylori
-positive normalų skrandžio gleivinės ir vėžio pažeistą skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Metilinimo tankis buvo apskaičiuojamas pagal metilinimo (M), juostos intensyvumo palyginti su bendru unmethylation (U) ir metilinimas juostos intensyvumo proporcingai. Metilinimo tankis kiekvienoje CpG svetainėje buvo suskirstyti į 5 lygius su 20% -methylation prieaugio. Metilinimo statusas kiekvieno geno buvo klasifikuojama kaip undermethylation (nepakankamai) arba overmethylation (per daug), remiantis tarpiniu metilinimo lygio (tarp) į H. pylori
negative normalų skrandžio gleivinę. (B) Tipiniams rezultatai klonavimo ir sekos nustatymas bendro PGR. Pereinamojo laikotarpio-CpG aikštelių CDH1
, CDKN2A
ir RUNX3
genų buvo analizuojami klonavimo ir sekos bendrą PGR produktą. Genomo DNR atstovaujamos 1A pav buvo naudojamas palyginti MSP rezultatus su sekos sudarymo rezultatus. Atvirosios ir uždarosios apskritimai rodo nedenatūruotą ir denatūruoti citozino likučius, atitinkamai. Stačiakampio dėžės nurodyti MSP gruntas svetaines buvo patvirtinti.
Pusiau kiekybiniai testo vertinimas pereinamuoju-CpG metilinimo variacijos Viesbutis The PGR būklės kiekvieno MSP pradmenimis, atidedant standartinę kreivę pagal įvairius mišinius juostos intensyvumas iš JEP produktų su universali metilo ir nemetilintas kontrolė DNR [11, 18]. Genomo DNR gydomi DNR metilazę (CpGenome Universal denatūruotu DNR, Chemicon, Temecula, CA, JAV) ir sustiprina universalus gruntas (5'-CCG AKTAS CGA GNN NNN NAT GTG "G-3") buvo naudojami universalūs metilo ir nemetilintas kontrolė DNR, atitinkamai. Remiantis standartine kreive, metilinimo tankis pereinamojo-CpG svetainėje buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: metilinimas santykis (%) = (metilinimo intensyvumą /(metilinimas + unmethylation intensyvumo)) × 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Norėdami patvirtinti kintamojo metilinimo tankis naudojant pusiau kiekybiniai testo analizę atgaminimas, 5 lygio klasifikacija su 20% -methylation prieaugio ir 10-lygis klasifikacija su 10% -methylation prieaugio buvo palyginti suporuotas audinių pavyzdžius. Lyginamoji analizė suporuotas mėginių buvo atliktas naudojant dubliuoti PNI iš 40 audinių ir 48 poras 1 cm-gretimuose audiniuose, be 100 porų Ertmė ir kūno audinių, kurie buvo gauti iš 50 H. pylori UAB - neigiami skrandžio audiniai ir 50 H. pylori
-positive skrandžio audiniai (2 pav.) 2 pav analizė kintamojo metilinimo pereinamuoju-CpG svetainėse. (A ir b) 5 lygio klasifikavimo atkuriamumas su 20% -methylation prieaugio (A) ir 10 lygio klasifikacijos su 10% -methylation prieaugio (B) buvo patikrinta pagal suporuotas audinių mėginių nepateikdamas jokių skirtumų proporcijos iš metilinimo lygis. buvo palyginti pasikartojančios DNR to paties audinio (uždari barai), iš 1-CM-gretimuose audiniuose (pilkos juostos) pora ir iš antralinėje dalyje ir organizmo audiniuose (atviri barai) pora. (C ir D) analizė tarpinį metilinimo lygiu. Iš undermethylated ir overmethylated atvejais dažnis buvo nustatyta remiantis tarpinis lygis, apimanti du lygius (20% metilinimo) (C) ir vieną lygį (10% metilinimas) (D) 10-lygio klasifikavimo bendrus H pylori
- neigiamas skrandžio gleivinė.
overmethylation norma kiekvienos pereinamosios-CpG svetainės H. pylori
-positive ir negative skrandžio gleivinės buvo apskaičiuojamas santykinė overmethylated atvejais bendra suma per didelis ir pagal metilintas atvejai. H. pylori
-associated overmethylation norma buvo apskaičiuota naudojant H. pylori
-positive-į-neigiamas santykis kiekvienos pereinamosios CpG-overmethylation norma. Tai buvo įvertinti tarp pereinamojo laikotarpio-CpG svetainių metilinimo ir tarp transkripcijos starto vietos ir artimiausios retroelement (3 paveikslas) atstumo santykius. 3 pav H. pylori
indukuotų metilinimo CpG-sala, kurių sudėtyje yra ir -lacking genų pagal atstumą iki artimiausio retroelements ir transkripcijos veikla. Iš 14 pereinamosios CpG svetainių iš viso buvo suskirstyti į aštuonias CpG salų genų (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
ir RUNX3
) ir šešių genai trūksta CpG-salos (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN parsisiųsti ir KRT6A
). Genas-retroelement atstumas buvo įvertintas tarp transkripcijos starto vietų ir artimiausiuose L1 arba Ltr aliuminio, retroelements. H. pylori
indukuotų metilinimas norma atstovavo H. pylori pervežimas -positive-to-neigiamas santykis overmethylation norma. Overmethylation norma apskaičiuojama pagal santykinės proporcijos overmethylated bylų bendros sumos per didelis ir pagal-denatūruotu atvejais. Transkripcijos veikla kiekvieno geno buvo parodyta su pareikštos nuorašai skaičius [4].
Klonavimas ir seka metilinimo kintamųjų svetainėje
MSP rezultatus pereinamojo-CpG svetainių buvo dar kartą patvirtino su klonavimo ir sekos bendros PGR gruntas rinkiniai, apimančios nedenatūruotą ir denatūruoti CpG svetaines (1b pav) [4, 11, 12]. PGR produktai bendrų pradmenų rinkinius buvo klonuotas į T & A klonavimo vektorių (Real Biotech, Taipėjus, Taivanas). DNR sekos buvo atlikta 10 klonų bendrų PGR vektorių naudojančių BigDye Nutraukimas Kit (PE BIOSYSTEMS Foster City, CA, JAV) ir "ABI automatizuota DNR sequencer (PE Biosystmes, Warrington, Jungtinė Karalystė). Dėl bendros gruntas rinkinius, kuriuos sudaro CpG-menkas regionus gaminami įvairaus laipsnio metilinimo pagal PGR būklės, mes pakoregavo PGR būklę bendros pradmenimis gauti metilinimo tankį, kuris buvo panašus tiek pusiau kiekybiniam MSP tyrimu, o sekos rezultatai 10 "common-PGR klonų.
analizė mikrosatelitiniai alelių
dėl PGR pagrįstas LOH analizė, kaip 40 mikrosatelitinių žymenų iš viso dėl aštuonių vėžį susijusios chromosomų (3p, 4p, 5q, 8p, 9p , 13q, 17p ir 18q) ir dėl netikėtai iš LOH ir MSI statusą gairės buvo naudojamas kaip aprašyta kitoje [20, 21]. Alelių aprašymą iš 40 mikrosatelitinių sekų tirtų kiekvienu atveju iš pradžių buvo suskirstytos į MSI remiantis naujais alelių buvimo homozigotiniu persekiotoją ir vienašališkai alelių praradimas heterozigotinės persekiotoją. Atsižvelgiant į iš LOH-teigiamas chromosomų skaičius, buvo įmušė iš LOH lygis kaip žemo lygio (dviejų arba trijų chromosomų nuostolių, LOH-L) ir aukšto lygio (keturi arba daugiau chromosomų nuostolius, LOH-H) LOH. Vienas ar nėra chromosomų nuostoliai buvo suskirstyti į pradine lygio (LOH-B) difuzinis tipo vėžiu ir į žemo lygio žarnyno ir mišraus tipo, atitinkamai, priklausomai nuo jų atitinkamą histologinio potipio.
Statistinė analizė
tikslus Fišerio testas buvo naudojamas lyginant per daug ir pagal-metilinimo pokyčiai tarp H. pylori
negative ar -positive skrandžio gleivinės ir skrandžio vėžio, su reikšmingumo priskirtas vertybių žemiau P
vertes, mažesnes 0,01 , Į Stjudento t
testas buvo naudojamas lyginant metilinimo skirtumus tarp skrandžio noncancerous ir vėžinių audinių, su reikšmingumo priskirtas vertybių žemiau P
vertės yra mažesnės kaip 0,05. Statistinis įvertinimas buvo atliktas naudojant statistinę programinės įrangos paketą "SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV).
Rezultatai
metilinimas-variacijos noncancerous audinių
pagal 14 pereinamosios CpG svetainių iš viso buvo pasirinktas iš aštuonių CpG salų genų (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1 parsisiųsti ir RUNX3
) ir šešių CpG -island-trūksta genų (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN parsisiųsti ir KRT6A
) (1 lentelė). Skirtinų pereinamojo laikotarpio-CpG vietoje amplifikuoto kiekvienos MSP pradmenų rinkinį atkuriamumas buvo įvertintas su pasikartojančios DNR tos pačios audinio, iš viso 1 cm-gretimuose audiniuose pora ir iš Ertmė ir kūno audinių pora (2A pav ir 2B). 92% iš 40 dublikatus DNR, 73% iš 48 1 cm-gretimų audinių poromis, ir 58% iš 100 Ertmė ir kūno porų buvo įmušė kaip tų pačių metilinimo lygių 5-lygio klasifikaciją. Tie patys įmetė bylų dubliuoti eksperimentų buvo maždaug 25% dažnesni 5 lygio klasifikavimo nei 10 lygio klasifikaciją.
Buvo analizuojami naudojant 1400 MSP amplikonų iš 14 tarpinis lygis kintamojo pereinamuoju-CpG metilinimo pereinamasis-CpG svetainėse, pagaminti iš 100 H. pylori
negative skrandžio mėginius (2c ir 2d pav.) Į 10-lygio klasifikaciją, vieno bendro metilinimo lygio (38%) frakcija buvo toks mažas, kad tarpinis lygis buvo nustatomas remiantis dviejų bendrųjų lygių. 937 (67%) iš 1400 JEP Amplikonų buvo suskirstyti į tarpinį lygį 100 audinių. Tarpiniai metilinimo lygis aštuonių CpG salų ribų linkę būti mažesnės nei šešis CpG salų-trūksta vietų (2 lentelė). Apskritai, didelių frakcijas, atskirų skrandžio audinių (67%) ir 1 cm-gretimų audinių porų (73%) parodė, kad pereinamojo laikotarpio-CpG vietos buvo metilinti panašių tankių svyruoja nuo maždaug 20% ​​intervale. Todėl tarpinis lygis, apimanti dviejų lygių (20% metilinimas) iš 10 lygio klasifikacija buvo naudojama siekiant nustatyti per daug arba nepakankamai denatūruotas statuso pereinamojo-CpG svetainių skrandžio mucosa.Table 2 d nepakankamai ir per daug dažnio metilinti atvejais nustatoma remiantis tarpiniais metilinimo lygio paplitusi H. pylori
negative skrandžio gleivinės (n = 100)
Genų vardas

Tarpinis metilinimas tankis
Nr rimo denatūruotu atvejais
Nr tarpinių metilinimas atvejais
Nr per didelio denatūruotu atvejais
CPG-saloje, kurioje yra genai
CDH1
0 - 20%
0
79
21
ARRDC4

0 - 20%
0
80
20
PPARG

0 - 20%
0
60
40
CDKN2A

0 - 20%
0
54
46
TRAPPC2L
40 - 60%
13
81
6
DUSP6
20 - 40%
26
62
12
MLH1
20 - 40%
20
61
19
RUNX3

30 - 50%
5
53
42
CpG salų trūksta genų
PGA5
40 - 60%
10
78
12
PGC
40 - 60:%
29
67
4
TFF1

20 - 40%
11
TFF2
52
37 30 -%
36 50
60
4
MSLN
60 - kaip 80%
0
88
12
KRT6A
60 - kaip 80%
17
65
18
Sąryšis tarp Helicobacter pylori UAB - susijęs overmethylation arba retroelements ar transkripcijos veikla
į perkarbamilinto ir nepilnai denatūruotu atvejais dažnius atskirai buvo skaičiuojami įvertinti pakitimus kintamojo metilinimo pereinamojo-CpG vietų (3 lentelė). Remiantis overmethylated atvejų analizė, visi CpG salų skirtumai buvo gerokai overmethylated į H. pylori
-infected skrandžio gleivinę ir nė vienas iš CpG salų-trūksta vietų parodė reikšmingą skirtumą į overmethylated atvejų dažnumas , Remiantis undermethylated atvejais analizės, iš undermethylated TFF1 pervežimas geno dažnis buvo žymiai žemas H. pylori pervežimas -positive skrandžio gleivinė (p
= 0,003). Metilinimo duomenys kaulų čiulpų citavo iš ankstesniame tyrime, naudojant tą patį Radioisotope ženklinimas MSP protokolą [4]. Kaulų čiulpuose, The PGC
, TFF1
, MSLN parsisiųsti ir RUNX3
genų buvo visiškai metilo, o dauguma CpG salų genų buvo visiškai unmethylated.Table 3 Palyginimas per daug dažnio ir undermethylated genai aptikti skrandžio nevėžinės ir vėžinių audinių
Genų

noncancerous audinį

MIKROSATELITŲ genotipo skrandžio vėžio (%)
kaulų čiulpų

H. pylori
neigiamas
(N = 100)
H. pylori
teigiamas
(N = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29)

LOH-O
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18)
(%)

Overmethylation dažnis
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24)
3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 *
3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
1 ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9
(69) 16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 *
3 (23)
3 (10)
1 (4)
2 (50)
(0)
MLH1
19

37 *
4 (31) 17 (59) *
0 11 ( 46)
3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
PGA5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4
10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38)
3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4
3
4 (31)
4 (14)

1 (4) (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) *
0 16 (55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17)
3 (75)
3 (17)
Undermethylation dažnis
CDH1
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25) 16 (89)
DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50)
18 (100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
1 (25)
17 (94)
RUNX3
5
1
0 (0 )
1 (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
PGA5
10
14
0 (0 )
3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) * pervežimas 3 (75) pervežimas: 0 (0) pervežimas TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33)
3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
1 (3)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23)
3 (10)
3 (13)
1 (25)
5 (28)
skrandžio vėžio buvo suskirstyti į pradinį lygio LOH (LOH-B), , žemo lygio LOH (LOH-L), aukšto lygio LOH (LOH-H) ir mikrosatelitinis nestabilumo (MSI). Šie duomenys yra aprašyti Medžiaga ir metodai skyriuje.
* H. pylori
-positive skrandžio gleivinę ir skrandžio vėžio buvo lyginamas su H. pylori pervežimas negative skrandžio gleivinę. Reikšmingi skirtumai buvo nustatyti naudojant Fisher'io testą (p
< 0,01).
Tarp pereinamosios CpG metilinimo ir atstumas iki artimiausio retroelement santykius buvo įvertintas naudojant H. pylori
-associated overmethylation norma (3 pav.) Per CpG salų genų, H. pylori
-associated overmethylation norma buvo didesnė kaip artimiausią retroelement atstumas tapo trumpesnis. CpG-sala trūksta genus, kurie neparodė jokių reikšmingų metilinimo skirtumas tarp H. pylori
-positive ir negative gleivinės buvo denatūruotas nepriklausomai nuo artimiausio retroelement atstumo.
Pereinamojo laikotarpio-CpG svetainių metilinimas buvo lyginamas tarp skrandžio ir kaulų čiulpų požiūriu transkripcijos veikla (1 lentelė ir 4 pav.) CpG salų genų grupė, kuri buvo mažai aktyvūs skrandyje buvo daugiau metilo į H. pylori
negative ir -positive audinių, nei, kad kaulų čiulpuose. Iš CpG salų-trūksta TFF2
ir PGA5
genų, kurie buvo labiausiai išreikštą skrandžio, vidutinis metilinimas lygis TFF2
genas buvo mažesnis nei kaulų čiulpuose (1,9) nei H.pylori
neigiamojo (2.6 P
= 0,015) ir -positive gleivinė (2.7 P
= 0,015). Vidutinė metilinimas lygis PGA5
geno buvo panašus kaulų čiulpuose (3.1) ir H. pylori pervežimas negative (3.0) ir -positive gleivinės (3.0). PGC parsisiųsti ir TFF1
skrandžio konkrečiai genai, kurie buvo silpnai aktyvi skrandžio gleivinės, lyginant su dviejų pagrindinių skrandžio konkrečių genų, buvo tankiai metilo kaulų čiulpuose (vidutiniškai metilinimo lygis, 4.3 ir 4.8). 4 pav kaulų čiulpų metilinimas ir skrandžio noncancerous ir vėžiniai audiniai. Vidutinis lygis metilinimo kaulų čiulpuose (●), H. pylori
neigiamojo skrandžio gleivinė (■), H. pylori
-positive skrandžio gleivinė (♦) ir pradinis lygio Loh atvejai (

• Nedažnas gleivinės metastazių į stomach
• CD44, bet ne CD24 ekspresija yra susiję su blogos prognozės ne CARDIA adenokarcinoma stomach