Die overmethylated Gene in Helicobacter pylori-infizierten Magenschleimhaut in Magen cancers

Die overmethylated Gene in Helicobacter pylori
infizierten Magenschleimhaut demethyliert in Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Die Übergangs-CpG demethyliert zwischen schwach methylierten Gene und dicht methylierte Retroelemente sind in der Magenschleimhaut mit Helicobacter pylori infiziert
(H. pylori
) overmethylated und sie sind in den Magen-Krebs in Abhängigkeit von der Höhe der Verlust der Heterozygotie (LOH) Ereignisse undermethylated. Diese Studie skizziert die Übergangs-CpG-Methylierungsmuster von CpG-Insel-haltigen und -lacking Gene im Hinblick auf die Retroelemente.
Methoden
Die Übergangs-CpG-Stellen von acht CpG-Insel-Gene enthalten, und sechs CpG-Insel -lacking Gene wurden halbquantitativ durch Ausführen Radioisotop-Markierungsmethylierungsspezifische PCR unter stringenten Bedingungen untersucht. Die Höhe der LOH in den Magenkrebs wurde unter Verwendung der 40 Mikrosatelliten-Marker auf acht Krebs-assoziierten Chromosomen geschätzt. Jedes Gen wurde erzielt als overmethylated oder undermethylated basierend auf einem mittleren Niveau des Übergangs-CpG-Methylierung häufig in der H. pylori
-ausschließend Magenschleimhaut.
Ergebnisse | Die acht CpG-Insel Gene untersucht wurden overmethylated je nach die Nähe zum nächstgelegenen Retroelement in der H. pylori -positiven
Magenschleimhaut. Die sechs CpG-Insel-fehlt-Gene wurden in der H. pylori
-positiver und -negative Magenschleimhaut ähnlich methyliert. In den Magen-Krebs, blieb lange Übergangs-CpG-Segmente der CpG-Insel Gene entfernt von den Retroelementen overmethylated, während die overmethylation von kurzen Übergangs-CpG-Segmente der Nähe der Retroelemente nicht signifikant war. Sowohl die CpG-Insel-haltigen und -lacking Gene eher abnehmend methylierte zu sein in einer LOH-Ebene abhängig
Schlussfolgerungen
Die overmethylated Gene unter dem Einfluss von Retroelement-Methylierung in der H. pylori
. - infizierten Magen sind in den Magen-Krebs beeinflusst von LOH demethyliert.
Hintergrund
ein Mausmodell mit Helicobacter pylori infiziert
(H. pylori
) hat gezeigt, dass Knochenmarksstammzellen auf die Magenschleimhaut wandern und dann unterscheiden sie Magenepithelzellen in [1]. Gemäß einer Selbstorganisationsmodell können stark exprimierten Genen Master eine Transkriptions Nabe bilden die Expression vieler anderer Gene [2] zu koordinieren. Eine Dosis-Kompensationsmechanismus schlägt vor, dass es eine inverse Korrelation zwischen den Housekeeping-Gene enthaltenden CpG-Inseln und die gewebespezifische Gene fehlen CpG-Inseln, die beide teilen eine begrenzte Menge an Kernproteine ​​im Kernraum [3, 4]. Sowohl die Selbstorganisation und Dosiskompensation Modelle hervorzuheben, dass die epigenetische Co-Regulierung von hochaktiven Magen-spezifische Gene und schwach aktive Housekeeping-Genen erleichtert die trans-Differenzierung von Mark gewonnenen Zellen im Magen.
Personen mit H. infiziert pylori
erleiden häufig eine Reihe von Magen-Schleimhautveränderungen einschließlich präkanzerösen und kanzerösen Läsionen [5]. Obwohl CpG-Insel overmethylation, die in der H. pylori bei der Inaktivierung von Krebs-assoziierten Gene führen kann
infiziertem Magenschleimhaut, eine Assoziation zwischen der overmethylation und Ausdruck der individuellen CpG-Insel Gene ist nicht eindeutig [6] üblich ist. Gastric präkanzerösen und kanzerösen Läsionen CpG-Insel overmethylation gezeigt sowie genomweite undermethylation, aber die zwei unterschiedlichen Methylierungsänderungen zeigten keine Zusammenarbeit für die sequentielle Entwicklung von Präkanzerosen und Krebs [7]. Zusätzlich sind die stark exprimierten Magen spezifische Gene eine Master-Rolle in der Co-Regulation zahlreicher Gene zeigten einige Methylierungsänderungen in den Magenkarzinome [4, 8] spielen. Hinsichtlich der Genexpression zu koordinieren, ist es notwendig, zu beschreiben, wenn die Magen-spezifische Gene und die Housekeeping-Gene gleichzeitig unterzogen werden Über- und Untermethylierungsänderungen., Die Retroelemente sind selbst-replizierende parasitären DNAs, die die Hälfte des menschlichen Genoms [besetzen ,,,0],9]. Das Wirtsgenom unterdrückt die gefährliche Mutation Wirkung der parasitären Retroelemente über eine DNA-Methylierungs-abhängigen Mechanismus [10]. Der Übergangsbereich zwischen den schwach methylierten Genen und den dicht methylierte Retroelemente, wie beispielsweise die CpG-Insel Rand und der Transkriptionsstartstelle fehlt, CpG-Inseln, ist in verschiedenen Graden methyliert in einer gewebetypabhängig [4, 11, 12 ]. Die Methylierung von Übergangs--CpG-Stellen ändert sich dynamisch in Reaktion auf die Transdifferenzierung von Stromazellen des Knochenmarks und den Verlust der Heterozygotie (LOH) Ereignisse in Magenkrebs [12-15]. Eine weitere frühere Studie wurde beschrieben, dass die "CpG-Insel Ufer" mit der Regulation der Zelldifferenzierung und Karzinogenese verwandt ist [16]. Interessanterweise sind viele Übergangs-CpG-Stellen und Gen benachbarte Retroelemente gleichzeitig Über- oder in einem bestimmten Gewebe undermethylated [11, 17], was darauf hinweist, dass die gleichzeitige Methylierungsänderungen in zahlreichen Genen unter dem Einfluss von Retroelement-Methylierung sind. Inzwischen sind die meisten CpG-rich islands schwach methylierten oder unmethylierten in den meisten Gewebetypen und die CpG-rich-Sites sind für die Analyse von dynamischen Methylierungs benachbarten Gen-Kontrollregionen nicht geeignet [12, 13, 15, 18]. Daher sind die Übergangs-CpG-Stellen, anstatt CpG-reichen Inseln, wahrscheinlich als Pivot-Methylierungspositionen zu dienen, die die gleichzeitige Methylierungsmuster im Zusammenhang mit H. pylori
Infektion und die Entwicklung von Krebs zu reflektieren.
Diese Studie die Übergangs-CpG-Methylierungsmuster der CpG-Insel Gene untersucht und die Magen-spezifische Gene fehlen CpG-Inseln in der H. pylori
Magenschleimhaut und Magenkrebs-infizierten. Die variable Methylierung von Übergangs-CpG-Stellen wurde halbquantitativ abgeschätzt unter stringenten methylierungsspezifische PCR (MSP) Bedingungen, die klare DNA-Banden erzeugt [4, 8]. Eine Zunahme oder Abnahme in der Übergangs-CpG Methylierungs jedes Gens wurde in der H. pylori -negativen
Magenschleimhaut.
Verfahren, die auf einer Zwischenmethylierungs bestimmt
Kollektion von Gewebeproben
nicht kanzerösen Gewebeproben wurden aus den aufeinander folgenden ambulanten Patienten gesammelt, die Magen-Endoskopie von April 2008 bis Oktober 2009 im St. Paul Krankenhaus, der katholischen Universität von Korea unterzog. Während der endoskopischen Untersuchung wurden zwei Proben benachbarte Gewebe wurden aus dem Magen Antrum und Körperabschnitt erhalten wurden. Eine Biopsie wurde mit Formalin für die histologische Untersuchung fixiert und die anderen Biopsieprobe wurde zur DNA-Extraktion verwendet. Der Pathologe bestätigte eine Magen Epithelzelle Gehalt von mehr als 80% Reinheit in der Biopsiegewebe. H. pylori
wurde Infektion untersucht die Warthin Starry Silberimprägnierungsverfahren verwendet wird. Diese Studie umfasste 50 Antrum und Körperpaare in H. pylori
-ausschließend Fälle mit einem mittleren Alter von 53,2 und 50 Antrum und Körperpaare in H. pylori
-positiver Fälle mit einem mittleren Alter von 55,6. Es waren 25 Männer und 25 Frauen in der H. pylori
-ausschließend Fälle und 26 Männchen und 24 Weibchen in der H. pylori
-positiver Fälle. Die Magenkrebsgewebe von den pathologischen Proben von 48 männlichen und 22 weiblichen Patienten erhalten (Durchschnittsalter: 63,7), die chirurgische Resektion zwischen März 2005 und Dezember 2008 in St. Paul Krankenhaus, der Katholischen Universität von Korea unterzog. Die klinisch-pathologische Tumorstadium wurde nach den Tumor-Node-Metastase (TNM) Kriterien bestimmt [19]. Alle Themen, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung und diese Studie wurde von der Ethikkommission genehmigt.
Gewebepräparation und Bisulfit-Modifikation von DNA
Die frische Biopsien wurden für machbar semi-quantitative MSP-Analyse verwendet, weil Formalin-fixierten Gewebe DNAs neigen schlecht nach dem Bisulfit-Modifikation amplifiziert werden [8]. Für die Mikrosatelliten-Analyse wurde die DNA aus den in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Tumorgeweben extrahiert, wie zuvor beschrieben [20, 21]. Die Tumorproben wurden microdissected eine chirurgische Skalpell unter einem Stereomikroskop verwendet wird. einen Krebszellanteil von mehr als 80% alle der microdissected Krebsgewebe enthalten sind. Verwendung von DNA-Extraktionspuffer (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml Proteinase K) wurden die Biopsien und microdissected Gewebe für 24 h bei 37 ° C verdaut. Etwa 1.000 Zellen wurden mit 20 ul der DNA-Extraktionspuffer inkubiert, wonach ein DNA Isolation Kit (A1120, Promega, Madison, WI, USA) wurde verwendet, um die genomische DNA zu extrahieren gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Tissue DNA wurde modifiziert, Verwendung von Natriumbisulfit als an anderer Stelle beschrieben [8, 11-13]. Kurz gesagt, wurde 1 ug genomische DNA mit 10 ul 3 M NaOH bei 37 ° C für 15 min behandelt. Dann wurde die denaturierte DNA mit 1,04 ml 2,3 M Natriumbisulfit und 60 ul 10 mM Hydrochinon gemischt und diese wurde bei 50 ° C für 12 Stunden erwärmt. Die Bisulfit-behandelter DNA, die gereinigt wurde Wizard DNA Aufreinigung Harz (Promega, Madison, WI, USA), wurde desulfoniert mit 3 M NaOH und mit Ethanol gefällt und dann in 35 ul 5 mM Tris-Puffer (pH 8,0) .
Radioisotopen-Markierung von semi-quantitative Analyse Methylierung
Vergleichende Analyse des Mikroarrays und SAGE (Serial Analyse der Genexpression) Daten hat herausgefunden, dass die Anzahl der Transkripte in den SAGE-Daten gezählt genau einen großen Unterschied in der Gen-Aktivität darstellt, zwischen die Magen-spezifische Gene und Housekeeping-Gene [4]. Die Übergangs-CpG-Stellen der Magen-spezifische Gene (PGA5
und PGC
) [22], die Schleimhaut Heilungs Gene (TFF1
und TFF2
) [23], die durch Krebs verursachten Gene (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A
und RUNX3
) [15, 24-27], und die nicht-Magen-Gene (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN
und KRT6A
) [28-32] wurden ausgewählt (Tabelle 1). Die MSP-Sites, Sequenzen und Bedingungen sind in den weiteren Datei 1. Ein niedriger GC-Gehalt und eine sich wiederholende Sequenz in der Methylierungs-variable Übergangs-CpG-gezeigt zeigten oft schwach oder Verschmieren MSP Bänder aufgrund der reduzierten Komplexität der Nukleotidsequenzen folgenden Bisulfit Behandlung [4, 8, 33]. Um die Spezifität des Übergangs-CpG-Amplifikation jeder MSP Primersatz zu erhöhen entworfen 3-5 CpG-Stellen enthalten und eine kleine Amplicongröße zu umfassen, und die MSP-Reaktion wurde bei der Verwendung von dTTP-Radioisotop unter strengen Bedingungen durchgeführt, wie zuvor beschrieben [4, 8, 11, 12]. 10 &mgr; l einer PCR-Mischung kurz, die mit 1 &mgr; l Bisulfit modifizierte DNA enthielt, 1 &mgr; Ci α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 &mgr; M dATP, dCTP und dGTP, 25 uM dTTP, 1 pmol von Primern, 0,1% Tween 20 und 0,3 Einheiten von Taq-Polymerase
durch 32 PCR-Zyklen amplifiziert unter PCR-Bedingungen Hot-Start. Die repräsentativen Methylierung Ergebnisse sind in Abbildung 1 1A.Table Der nächste Retroelement und die Transkription der 14 ausgewählten Genen, die mit und ohne CpG-Inseln
Gene
gezeigt
CpG-Inseln
Nächste Retroelement
No. von exprimierten Transkripte im Magen


Name der Familie

Entfernung zur Transkriptionsstartstelle

CDH1
Ja
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Ja
Alu
1,7 kb
7
PPARG
Ja
Alu
2,3 kb
3
CDKN2A
Ja
LTR
2,4 kb
1 TRAPPC2L

Ja
Alu
3,8 kb
14
DUSP6
Ja
Alu
6,6 kb
8 MLH1

Ja
Alu
6,6 kb
0
RUNX3
Ja
LTR 8,3 kb
0
PGA5
Nein
Alu
1,2 kb
734
PGC
No
Alu
1,6 kb
33
TFF1
No
Alu
0,5 kb
11
TFF2
No
2,7 kb
L1
632
MSLN
No
Alu
1,4 kb
50
KRT6A
Kein
Alu
4,2 kb
1 die Angaben zu den CpG-Inseln, Retroelemente und die Anzahl der zum Ausdruck Transkripte in der Magen wurde von den zuvor veröffentlichten Daten erhalten [4].
1 die semi-quantitative Methylierungsanalyse (A) und die Klonierung und Sequenzierung (B) in den Übergangs-CpG-Abbildung. Die Methylierung von CpG-Übergangsstellen wurde durch die Durchführung einer semi-quantitative Methylierungsanalyse (A), und es wurde mit Klonierung und Sequenzierung des gemeinsamen Primers (B) verifiziert ausgewertet. (A) insgesamt 14 Übergangs-CpG-Stellen wurden in die H. pylori -negativen
sucht und H. pylori -positiven
normale Magenschleimhaut und Krebs Läsion von Magenkrebs-Patienten. Die Methylierung Dichte wurde nach dem Verhältnis des Methylierungs (M) Bandenintensität gegen die Gesamt unmethylation (U) und Methylierung Bandenintensität berechnet. Die Methylierung Dichte jeder CpG-Stelle wurde mit 20% Zuwachs in Methylierung 5 Stufen eingeteilt. Der Methylierungsstatus jedes Gens als undermethylation (Unter-) oder overmethylation (Über-), basierend auf einem Zwischenmethylierungsgrad (inter-) des H. pylori
-ausschließend normale Magenschleimhaut kategorisiert wurde. (B) Repräsentative Ergebnisse der Klonierung und Sequenzierung des gemeinsamen PCR. Die Übergangs-CpG-Stellen des CDH1
, CDKN2A
und RUNX3
Gene wurden durch Klonen analysiert und Sequenzierung des gemeinsamen PCR-Produkt. Die genomischen DNAs in 1A dargestellt wurden verwendet, um die MSP Ergebnisse mit den Sequenzierungsergebnisse zu vergleichen. Die offenen und geschlossenen Kreise zeigen unmethylierter und methylierter Cytosin-Reste, respectively. Die rechteckigen Kästchen zeigen die MSP Primerstellen.
Semi-quantitative Auswertung von Übergangs-CpG-Methylierung Variation
Die PCR-Zustand eines jeden Satzes MSP Primer validiert wurde durch die Standardkurve Plotten nach verschiedenen Mischungen der Bandenintensität von den MSP-Produkte mit universal-methylierter und nicht methylierter Kontroll-DNA [11, 18]. Die genomische DNA mit DNA-Methylase behandelt (CpGenome Universal-methylierter DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) und durch einen Universalprimer amplifiziert (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') wurden für die universelle methylierte verwendet und unmethylierte Kontroll-DNA sind. Auf der Basis der Standardkurve, die Methylierung Dichte des Aufstellungsortes Gangs-CpG berechnet wurde mit der folgenden Formel: Methylierungs Anteil (%) = (Methylierungsintensität /(Methylierungs + unmethylation Intensität)) × 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Um die Reproduzierbarkeit der variablen Methylierungsdichte eine semi-quantitative Analyse, die 5-stufigen Klassifizierung mit 20% Methylierung Schritt und die 10-Level-Klassifikation mit 10% Methylierung Schritt validiert wurden in den paarigen Gewebeproben verglichen. Die vergleichende Analyse der gepaarte Stichproben wurde unter Verwendung der duplizierten DNAs der 40 Gewebe durchgeführt und 48 Paare von 1-cm-benachbarte Gewebe zusätzlich zu 100 Paare von Antrum und Körpergewebe, die aus dem 50 H. pylori
erhalten wurden - negativen Magengewebe und die 50 H. pylori
-positive Magen Gewebe (Abbildung 2). Figur 2 Analyse von variabler Methylierung in den Übergangs-CpG-Stellen. (A und B) ist die Reproduzierbarkeit der 5-stufigen Klassifizierung mit 20% Methylierung Schritt (A) und 10-Level-Einstufungen mit 10% Methylierung Schritt (B) wurde in durch den Anteil der paarigen Gewebeproben zeigen keine Unterschiede überprüft das Ausmaß an Methylierung. Die duplizierten DNAs des gleichen Gewebes (geschlossene Balken), ein Paar von 1-cm-benachbarte Gewebe (graue Balken) und ein Paar von Antrum und Körpergewebe (offene Balken) verglichen. (C und D) Analyse eines Zwischenmethylierungsgrad. Die Häufigkeit der undermethylated und overmethylated Fällen beruhte auf einem mittleren Niveau Spanning zwei Ebenen (20% Methylierung) (C) und einer Ebene (10% Methylierung) (D) 10-Ebene Klassifikation gemeinsam in H. pylori
geschätzt - Magenschleimhaut negativ.
die overmethylation Rate jedes Übergangs--CpG-in der H. pylori
-positiver und -negative Magenschleimhaut wurde durch den relativen Anteil von overmethylated Fällen auf die Gesamtsumme der Über berechnet und unter -methylated Fälle. Die -assoziierten overmethylation rate
H. pylori wurde mit der H. pylori berechnet
-positiver-to-negatives Verhältnis jeder Übergangs-CpG-overmethylation Rate. Dies wurde verwendet, um die Beziehung zwischen der Methylierung von Übergangs-CpG-Stellen und der Abstand zwischen der Transkriptionsstartstelle und der nächsten Retroelement (3) zu bewerten. Figur 3 H. pylori
-induzierte Methylierung der CpG-Insel enthaltenden und -lacking Gene entsprechend dem Abstand zu den nächsten Retroelementen und der Transkriptionsaktivität. Insgesamt 14 Übergangs-CpG-Stellen wurden gruppiert in acht CpG-Insel-Gene (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
und RUNX3
) und sechs Gene CpG-Inseln (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
und KRT6A
fehlt). Das Gen-Retroelement Abstand zwischen den Transkriptionsstartstellen und den nächsten Alu, L1 oder LTR Retroelemente geschätzt. Die H. pylori
-induzierte Methylierungsrate wurde durch die H. pylori vertreten
-positiver-to-negativen Verhältnis der overmethylation Rate. Die overmethylation Rate wurde nach dem relativen Anteil von overmethylated Fällen auf die Gesamtsumme der Über- und Unter methyliert Fälle berechnet. Die Transkriptionsaktivität jedes Gen wurde mit der Anzahl der exprimierten Transkripten gezeigt [4].
Klonierung und Sequenzierung von methylierungs variable Standort, Die MSP Ergebnisse der Übergangs-CpG-Stellen wurden mit Klonierung und Sequenzierung des PCR bestätigt gemeinsame Primersätze umfasst sowohl die unmethylierte und methylierte CpG-Stellen (1B) [4, 11, 12]. Die PCR-Produkte der gemeinsamen Primer-Sets wurden in den T &geklont; Klonierungsvektor (Real Biotech, Taipei, Taiwan). mit dem BigDye Termination Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) und einem ABI automatisierten DNA-Sequenzierer (PE Biosystmes, Warrington, UK) Die DNA-Sequenzierung wurde für 10 Klone der gemeinsamen PCR-Vektoren durchgeführt. Da die gemeinsamen Sets Primer Abdeckung der CpG-armen Regionen verschiedene Methylierungsgrade hergestellt nach dem PCR-Zustand, passten wir die PCR-Bedingungen des gemeinsamen Primers ist die Methylierung Dichte zu erhalten, die in ähnlich war sowohl für die semi-quantitative MSP-Assay und die Sequenzierungsergebnisse der 10-Common-PCR-Klone.
Analyse von Mikrosatelliten-Allele
für die PCR-basierte LOH-Analyse insgesamt 40 Mikrosatelliten-Marker auf acht Krebs-assoziierte Chromosomen (3p, 4p, 5q, 8P, 9P , 13q, 17p und 18q) und die Richtlinien für den Status von LOH und MSI wurden Scoring wie an anderer Stelle beschrieben verwendet [20, 21]. Die allelischen Profil der 40 Mikro Sequenzen jeweils untersucht wurde zunächst in MSI kategorisiert basierend auf der Anwesenheit neuer Allele im homozygoten Marker und dem einseitigen allelische Verlust in der heterozygoten Markers. Nach der Anzahl der LOH-positive Chromosomen wurde das Niveau von LOH erzielte als Low-Level (zwei oder drei chromosomale Verluste, LOH-L) und High-Level (vier oder mehr chromosomale Verluste, LOH-H) LOH. Eine oder keine chromosomale Verluste eingestuft wurden in die Basisebene (LOH-B) für die diffuse-Typ Krebs und auf den niedrigen Pegel für Darm- und Mischtyp, jeweils in Abhängigkeit von ihrer entsprechenden histologischen Subtyp.
Statistische Analyse
genaue Fisher-Test wurde zum Vergleich der Über- und Untermethylierungsänderungen zwischen der H. pylori
-ausschließend oder -positiven Magenschleimhaut und Magenkrebs verwendet, mit Bedeutung auf Werte unterhalb von P zugeordnet
weniger als 0,01-Werte . Die t
Tests von Student wurde für den Vergleich der Methylierungsunterschiede zwischen den Magen-noncancerous und Krebsgewebe, mit Bedeutung auf Werte unterhalb von P zugewiesen verwendet
weniger als 0,05 Werte. Die statistische Auswertung mit Hilfe der Statistik-Software-Paket ausgeführt wurde SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Ergebnisse | Methylierungs-Variation in noncancerous Gewebe
Insgesamt 14 Gangs-CpG-Stellen ausgewählt wurden von acht CpG-Insel-Gene (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
und RUNX3
) und sechs CpG -Insel-Gene fehlen (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
und KRT6A
) (Tabelle 1). Die Reproduzierbarkeit der Übergangs-CpG-Bereichs von jedem MSP-Primersatz amplifiziert wurde mit den duplizierten DNAs des gleichen Gewebes ausgewertet, ist ein Paar von 1-cm-benachbarte Gewebe und ein Paar von Antrum und Körpergewebe (2A und 2B). 92% der 40 dupliziert DNAs, 73% der 48 1-cm-angrenzendes Gewebe Paare und 58% der 100 Antrum und Körperpaare wurden als die gleichen Methylierungsniveaus in der Klassifizierung 5-Ebene erzielt. Die gleich erzielte Fälle der duplizierten Experimente waren ca. 25% häufiger in der 5-stufigen Einstufung als in der 10-Ebene-Klassifikation.
Ein mittleres Niveau der variablen Übergangs-CpG-Methylierung wurde mit 1.400 MSP Amplikons der 14 analysierten Übergangs-CpG-Stellen von 100 H. pylori erhalten
-ausschließend Magen-Proben (2C und 2D). In der 10-Ebene Klassifikation, die Fraktion einer einzigen gemeinsamen Methylierungsgrad (38%) war so niedrig, dass eine Zwischenstufe auf zwei gemeinsamen Ebenen bestimmt. 937 (67%) der 1.400 MSP Amplikons wurden in einer Zwischenebene in den 100 Gewebe kategorisiert. Zwischenmethylierungsstufen acht CpG-Insel Margen tendenziell niedriger sein als die von sechs CpG-Insel-fehlt-Sites (Tabelle 2). Insgesamt große Anteile einzelner Magengewebe (67%) und 1-cm-Gewebe benachbarten Paaren (73%) zeigten, dass die Übergangs-CpG-Stellen in einer Reihe von ähnlichen Dichten zwischen etwa 20% variiert methyliert wurden. Aus diesem Grund wurde ein mittleres Niveau Spanning zwei Ebenen (20% Methylierung) von 10-Level-Klassifikation verwendet, um die Über- oder Unter methylierten Status der Übergangs-CpG-Stellen in der Magen-mucosa.Table 2 Die Häufigkeit der Unter- und Über zu bestimmen methylierte Fälle als auf Basis von Zwischen Methylierung Ebenen gemeinsam in der H. pylori
-ausschließend Magenschleimhaut (n = 100)
Genname
bestimmt
Intermediate-Methylierungs-Dichte
No. von Unter- methylierte Fälle
Nr Zwischenmethylierungs Fällen
Nr Über- methylierte Fälle
CpG-Insel Gene
CDH1
0 enthält - 20%
0
79
21
ARRDC4

0 - 20%
0
80
20
PPARG
0
- 20%
0
60
40
CDKN2A

0-20%
0
54
46
TRAPPC2L
40 - 60%
13
81
6 DUSP6
20 bis 40%
26
62
12
MLH1
20 bis 40%
20
61
19
RUNX3
30
- 50%
5
53
42
CpG-Insel-Gene fehlen
PGA5
40 - 60%
10
78
12
PGC
40 - 60%
29
67
4 TFF1
20
- 40%

52
37
TFF2
30 - 50%
36
60
4 MSLN
60-80%
0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
Beziehung zwischen H. pylori
- assoziierten overmethylation entweder die Retroelemente oder Transkriptionsaktivität, die Frequenzen der Über- und Unter methyliert Fälle wurden getrennt gezählt Änderungen in der variablen Methylierung der Übergangs--CpG-Stellen zu schätzen (Tabelle 3). Auf der Analyse der overmethylated Fällen alle CpG-Insel Pannen wurden in der H. pylori
infizierten Magenschleimhaut und keiner der CpG-Insel-fehlt Seiten zeigte einen signifikanten Unterschied für die Frequenz der overmethylated Fällen signifikant overmethylated . Auf der Analyse der undermethylated Fällen war die Frequenz des undermethylated TFF1
Gens in der H. pylori -positiven
Magenschleimhaut (P
= 0,003) signifikant gering. Die Methylierungsdaten von Knochenmark wurde aus einer früheren Studie mit dem gleichen Radioisotop-Markierung von MSP-Protokoll [4] zitiert. Im Knochenmark waren die PGC
, TFF1
, MSLN
und RUNX3
Gene vollständig methyliert, während die meisten der CpG-Insel Gene vollständig unmethylated.Table 3: Vergleich der Häufigkeit von Über waren und undermethylated Gene in den Magen nicht-Krebs und Krebsgewebe nachgewiesen
Gene
noncancerous Gewebe

Mikrosatelliten-Genotyp von Magenkrebs (%)
Knochenmark

H. pylori
negativ
(n = 100)
H. pylori
positive
(n = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29)

LOH-H
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18)
(%)

Overmethylation Frequenz
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24)
3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 *
3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
1 ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9 (69)
16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L

6 21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 *
3 (23)
3 (10)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
MLH1
19
37 *
4 (31)
17 (59) *
11 ( 46)
3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
PGA5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4 10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38)
3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4
3
4 (31)
4 (14)
1 (4)
0 (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) * 16
(55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17)
3 (75)
3 (17)
Undermethylation Frequenz
CDH1
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25) 16 (89)
DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50) 18
(100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
1 (25)
17 (94)
RUNX3
5 seite 1 0 (0 )
1 (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
PGA5
10
14
0 (0 )
3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) *
3 (75)
0 (0)
TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33)
3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
1 (3)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23)
3 (10)
3 (13)
1 (25)
5 (28)
Die Magenkrebs in Baseline-Ebene LOH kategorisiert wurden (LOH-B) , Low-Level-LOH (LOH-L), High-Level-LOH (LOH-H) und Mikrosatelliteninstabilität (MSI). Die Einzelheiten sind in dem Material und Methoden beschrieben.
* H. pylori
-positiver Magenschleimhaut und Magenkrebs wurden im Vergleich mit H. pylori
-ausschließend Magenschleimhaut. Signifikante Unterschiede wurden exakten Fisher-Test ermittelt (P
< 0,01).
Die Beziehung zwischen der Übergangs-CpG-Methylierung und der Abstand zum nächsten Retroelement wurde mit der H. pylori ausgewertet
-assoziierten overmethylation Rate (Figur 3). In den CpG-Insel Gene, war die H. pylori
-assoziierten overmethylation Rate höher als der Abstand der nächsten Retroelement kürzer geworden ist. Die CpG-Insel-fehlenden Gene, die keinen signifikanten Methylierungs Unterschied zwischen der H. pylori
-positiver und -negative Schleimhaut zeigten, wurden unabhängig von der Entfernung des nächsten Retroelement methyliert.
Die Methylierung von Übergangs--CpG-Stellen wurde im Vergleich zwischen dem Magen und dem Knochenmark in Bezug auf die Transkriptionsaktivität (Tabelle 1 und Abbildung 4). Die CpG-Insel-Gen-Gruppe, die schwach aktiv im Magen war, war mehr methyliert in der H. pylori
-negative und -positive Gewebe als die im Knochenmark. Von der CpG-Insel-fehlt TFF2
und PGA5
Gene, wurden am stärksten in den Magen ausgedrückt, betrug die mittlere Methylierungsgrad des TFF2
Gen niedriger als im Knochenmark (1,9) als in der H. pylori
-ausschließend (2.6, P
= 0,015) und -positive Schleimhaut (2,7, P
= 0,015). Die mittlere Methylierungsgrad des PGA5
Gens war ähnlich im Knochenmark (3.1) und H. pylori
-ausschließend (3,0) und -positive Schleimhaut (3,0). Die PGC
und TFF1
Magen-spezifische Gene, die in der Magenschleimhaut schwach aktiv waren, wenn sie mit den beiden Master-Magen-spezifische Gene verglichen, waren dicht methylierte im Knochenmark (mittlere Methylierungsgrad, 4.3 und 4.8). 4 Die Methylierung im Knochenmark und die Magen noncancerous und Krebsgewebe.

• Gelegentlich Schleimhaut Metastasen in den Magen
• CD44, aber nicht CD24 Expression wird im Zusammenhang mit einer schlechten Prognose bei nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens