V overmethylated geni v Helicobacter pylori okužbo želodčne sluznice so demetilirani želodčnega cancers

se overmethylated geni v Helicobacter pylori
okuženimi želodčne sluznice so demetilirani v želodcu raka
Abstract
Ozadje
prehodnem-CpG mestih med šibko so denaturirani geni in gosto metilni retroelements overmethylated v želodčni sluznici okuženi s Helicobacter pylori
(H. pylori
) in so undermethylated v želodcu raka glede na stopnjo izgube heterozigotnosti (LOH) dogodke. Ta študija je zasnovan prehodne-CpG metilacije vzorce CpG-otok, ki vsebujejo in -lacking genov glede na retroelements.
Metode
prehodnih-CpG mestih osmih CpG vsebuje otoških-genov in šest CpG-otok -lacking geni so semi-kvantitativno pregledati z izvajanjem radioaktivnih izotopov označevanje metilacija specifičen PCR pod strogimi pogoji. Raven LOH v želodcu raka, je bila ocenjena s pomočjo 40 mikrosatelitnih markerjev na osem, povezanimi z rakom kromosomov. Vsak gen je dosegel kot overmethylated ali undermethylated temelji na vmesni stopnji prehodnega-CpG metilacije skupno v H. pylori
-negativno želodčne sluznice.
Rezultati
osmih pregledanih CpG otoških genov so overmethylated odvisno od bližina najbližje retroelement v H. pylori
-positive želodčne sluznice. Šest CpG-island-manjkajo geni so podobno metilira, v H. pylori
-positive in -negativno želodčne sluznice. V želodcu raka, dolgo prehodno-CpG segmenti CpG otoških genov, oddaljenih od retroelements ostala overmethylated, ker overmethylation kratkih prehodnih-CpG segmentov, ki so blizu retroelements ni bila pomembna. Tako CpG-otok, ki vsebujejo in -lacking geni nagibale, da je vse manj methylated na način, ki je LOH ravni odvisna od
Sklepi
overmethylated genov pod vplivom retroelement metilacije v H. pylori
. - okuženih želodec se demetilirani v želodcu raka, ki jih LOH vplivom.
Ozadje
mišjem modelu okuženi s Helicobacter pylori
(H. pylori
), je pokazala, da kostnega mozga matične celice migrirajo na želodčne sluznice in nato se diferencirajo v epitelijskih celic želodca [1]. Glede na model samo-organizacije, se lahko zelo izražena master genov tvorijo prepisu vozlišče za usklajevanje izražanje mnogih drugih genov [2]. Mehanizem nadomestila odmerek predlaga, da obstaja inverzna korelacija med oskrbniška genov, ki vsebujejo CpG-otoki in genov tkivno specifičnih primanjkuje CpG-otoke, ki sta si delijo omejeno količino jedrskih beljakovin v jedrskem prostoru [3, 4]. Oba modela samoorganizacije in kompenzacijski odmerek poudariti, da je epigenetsko koregulacija zelo aktivnih želodčne specifičnih genov in šibko aktivnih oskrbniška genov olajšuje trans-diferenciacijo celic mozga pridobljeni v želodcu.
Posamezniki, ki so okužene s H. pylori
pogosto opravi niz želodčnih sprememb sluznice vključno predrakavih in rakavih poškodb [5]. Čeprav CpG-otok overmethylation, ki lahko povzroči inaktivacijo, povezanimi z rakom genov je pogosta v H. pylori
okuženimi želodčne sluznice, združenje med overmethylation in izražanja posameznih CpG otoških genov je dvoumna [6]. Želodca predrakave in rakave rane so pokazale CpG-otok overmethylation kot tudi genoma vsej undermethylation, ampak dve različni spremembe metilacije ni pokazala sodelovanje za zaporedno razvoj precancer in raka [7]. Poleg tega so zelo izražene v želodcu specifičnih genov, ki igrajo glavno vlogo v koregulacije številnih genov je pokazala nekaj metilacije spremembe v želodcu raka [4, 8]. Kar zadeva usklajevanje izražanje genov, je treba razmejiti, če se želodčne specifičnih genov in gospodinjstva geni opraviti sočasno pre- in metilacije spremembe.
Retroelements so self-posnemajo parazitske DNA, ki zasedajo polovico človeškega genoma [ ,,,0],9]. Gostiteljica genom zavira mutacije učinek nevarne od parazitskih retroelements preko metilacijskega odvisnega mehanizma DNK [10]. Prehodno območje med šibko metilirani geni in gosto metilnim retroelements, kot minimalni CpG-otok in začetnim mestom transkripcije primanjkuje CpG-otokov, metiliramo z različnimi stopnjami v tkivo tipa odvisni način [4, 11, 12 ]. Metiliranje prehodnih-CpG straneh dinamično spreminja kot odziv na trans-diferenciacije kostnega mozga stromalnih celic in (Loh) dogodkov za izgubo heterozigotnosti v želodcu raka [12-15]. Druga predhodna študija je tudi opisal, da je "CpG-otok shore" je povezana z ureditvijo celično diferenciacijo in rakotvornost [16]. Zanimivo je, da veliko lokacij prehodno-CPG gena, ki mejijo retroelements so hkrati preveč ali undermethylated v določenem tkivu [11, 17], kar kaže, da so sočasnih metilacije spremembe v številnih genov pod vplivom retroelement metilacije. Medtem, večina CpG bogati otoki so šibko methylated ali nemetiliran v večini tkiv, in CPG, bogati s strani niso primerne za analizo dinamičnega metilacije, ki mejijo na gen-kontrolne regije [12, 13, 15, 18]. Zato so prehodne-CpG mest, namesto CpG bogati otokov, obstaja verjetnost, da služijo kot pivot-metilacijskih pozicije, ki odražajo sočasne metilacijskih vzorcev, povezanih s H. pylori
okužbe do razvoja raka.
Ta študija raziskovali prehodne-CpG metilacije vzorce CPG otoških genov in želodčne specifične gene primanjkuje CpG-otoke v H. pylori
okuženimi želodčne sluznice in želodca raka. Spremenljivi metilacija za prehodno-CpG mestih je semi-kvantitativno ocenjena pod strogimi metilacije specifične PCR (MSP) pogoji, ki proizvajajo jasne DNK pasove [4, 8]. Povečanje ali zmanjšanje v prehodnem-CpG metilacije vsakega gena je bila določena na podlagi vmesnega metilacije v H. pylori
-negativno želodčne sluznice.
Metode
Zbiranje vzorcev tkiva Poslovni
Non-rakavi vzorce tkiva so bili zbrani iz zaporednih ambulantne bolnike, ki so bile opravljene v želodcu endoskopijo od aprila 2008 do oktobra 2009 v bolnišnici St. Paul, The katoliški univerzi v Koreji. Med endoskopski pregledu smo dve sosednji vzorce tkiva dobimo iz želodca antruma in trup oz. Ena biopsije vzorec je bil določen s formalinom za histološki pregled in je bila uporabljena za ekstrakcijo DNK druge biopsije vzorcu. Patolog potrdila želodčne vsebine epitelijskih celic več kot 80% čistostjo v biopsije tkiva. H. pylori
okužba je bila preučena metodi Warthin-srebrni impregnacije. Ta študija je vključevala 50 antruma in telesa parov H. pylori
-negativno primerih s povprečno starostjo 53,2 in 50 antruma in telesa parov H. pylori
-positive primerih s povprečno starostjo 55,6. Je bilo 25 moških in 25 ženskih in v H. pylori
-negativno primerih in 26 samcev in 24 samic v H. pylori
-positive primerih. Želodčnega raka tkiva so bili pridobljeni iz patoloških osebkov 48 moških in 22 ženskih bolnikov (povprečna starost: 63,7), ki so bili v kirurško resekcijo med marcem 2005 in decembrom 2008 v bolnišnici St. Paul, The Katoliški univerzi v Koreji. Clinicopathologic stopnja tumorja je bila določena v skladu z merili Tumor-Node-Metastasis (TNM) [19]. Vsi predmeti, če njihova pisno privolitev in ta študija je bila odobrena s institucionalni pregled krovu.
Priprave tkiv in bisulfit sprememba DNK
svežih biopsijo so bili uporabljeni za izvedljivo semi-kvantitativno analizo PPN, ker formalinom fiksno tkiva DNA ponavadi slabo dopolnjena po bisulfita spremembi [8]. Za analizo mikrosatelitno je DNA ekstrahiramo iz-formalin fiksni parafinski vgrajeni tumorskih tkiv, kot je prej [20, 21] opisano. Osebki tumor so microdissected pomočjo kirurškega skalpela pod stereomikroskopom. Vsi microdissected tkiv rakom vsebovali vsebnost rakavih celic več kot 80%. Z uporabo DNK ekstrakcije pufra (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinaza K) so vzorci biopsije in microdissected tkiva smo razgradili pri 37 ° C 24 ur. Približno 1000 Celice smo inkubirali z 20 ul pufra ekstrakcije DNA po katerem kit izolacijo DNA (A1120, Promega, Madison, WI, ZDA), ki je bila uporabljena za pridobivanje genomske DNA v skladu z navodili proizvajalca.
Tkivo DNK je bil spremenjen z uporabo natrijevega bisulfita, kakor je opisano drugje [8, 11-13]. Na kratko smo 1 ug genomsko DNA obdelali z 10 ml 3 M NaOH 15 minut pri 37 ° C. Nato je denaturiran DNA zmešamo z 1,04 ml 2,3 M natrijevega bisulfita in 60 p.L 10 mM hidrokinona in to smo segreli na 50 ° C 12 ur. Bisulfit obdelano DNA, ki jo očistimo s pomočjo čarovnika DNA čiščenja smole (Promega, Madison, WI, ZDA) smo desulfonirane s 3 M NaOH in oborimo z etanolom in nato raztopimo v 35 p.L 5 mM Tris pufra (pH 8,0) .
radioaktivnega izotopa joda-označevanje semikvantitivnimi analizo metilacijo
primerjalno analizo mikromrež in SAGE (Serial analiza izražanja genov) podatkov, je ugotovila, da se je število prepisov preštetih v podatkih SAGE natančno pomeni veliko razliko v genu dejavnosti med želodec specifični geni in gospodinjstva geni [4]. Prehodne-CpG strani želodca specifičnih genov (PGA5
in PGC
) [22], so-sluznice zdravilne geni (TFF1
in TFF2
) [23], ki ne zadevajo rak geni (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A
in RUNX3
) [15, 24-27], in ne v želodcu geni (ARRDC4
, DUSP6
TRAPPC2L
, MSLN
in KRT6A
) [28-32] so bili izbrani (tabela 1). PDČ mesta, sekvence in pogoji so prikazani v dodatni Slika 1. nizke vsebnosti GC in dobesedno sekvence v metilacije spremenljivke prehodno-CpG samem pogosto pokazali šibke ali madeže PPN pasov zaradi zmanjšanja zapletenosti nukleotidnih zaporedij naslednjo bisulfit zdravljenje [4, 8, 33]. Da bi povečali specifičnost prehodnega-CpG pomnoževanje smo vsako PPN primerski niz zasnovan tako, da vsebuje 3-5 CpG mest in obsegajo majhno velikost amplikonske in reakcijsko PPN smo izvedli pod strogimi pogoji z uporabo DTTP-radioaktivni izotop, kot je predhodno opisano [4, 8, 11, 12]. Na kratko, 10 ml zmesi PCR, ki je vsebovala 1 ul bisulfita modificirane DNA, 1 μCi izmed a- 32P DTTP (PerkinElmer, Boston, MA, ZDA), 62,5 iM dATP, dCTP in dGTP, 25 uM DTTP, 1 pmol primerjev je bila 0,1% Tween 20 in 0,3 enot Taq polimeraza
pomnožimo s 32 PCR ciklov v skladu z vročim začeti pogoje PCR. Reprezentativni rezultati metilacije so prikazani na sliki 1A.Table 1 Najbližja retroelement in prepisovanje od 14 izbranih genov z in brez CpG otokov
Gene

CpG otoki
Najbližje retroelement
No. za izraženo prepise v želodcu


Ime družine
Oddaljenost od transkripcije začetnem mestu

CDH1
Da
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Da
Alu
1,7 kb
7
PPARG

Da
Alu
2.3 kb
3
CDKN2A
Da
LTR
2.4 kb
1
TRAPPC2L

Da
Alu
3.8 Kako KB
14
DUSP6
Da
Alu
6.6 kb
8
MLH1

Da
Alu
6.6 kb
0
RUNX3
Da
LTR
8,3 kb
0
PGA5
Ne
Alu
1,2 kb
734
PGC
Ne
Alu
1.6 KB
33
TFF1
Ne
Alu
0,5 kb
11
TFF2
Ne
L1
2,7 kb
632
MSLN
Ne
Alu
1.4 KB
50
KRT6A
Ne
Alu PODJETJA
4,2 kb
1
informacije o CpG otokov, retroelements in število izraženih prepisov v želodec je bil pridobljen od predhodno objavljenih podatkov [4].
Slika 1 analiza semi-kvantitativno metilacijo (A) in kloniranje in zaporedje (B) v mestih prehodno-CpG. Metiliranje prehodno-CpG strani, je bila ocenjena z izvajanjem semi-kvantitativno analizo metilacijo (A) in je bilo preverjeno s kloniranjem in zaporedja skupne primerjem (B). (A) skupno 14 Prehodno-CpG straneh so bile pregledane v H. pylori
-negativno in H. pylori
-positive normalno želodčne sluznice in raka lezijo bolnikov z rakom želodca. Gostota metilacija je bila izračunana v skladu z deležem intenzivnost metilacija (M) pasu proti skupni unmethylation (U) in intenzivnosti metilacija pasu. Gostota metilacija na vsakem mestu CpG je bil razvrščen v 5 stopenj z 20% metiliranje prirastka. Metilacijskega statusa vsakega gena je opredeljena kot undermethylation (podjetje) ali overmethylation (preveč), ki temelji na vmesnem nivoju metiliranje (vmesni) iz H. pylori
-negativno normalno želodčne sluznice. (B) Reprezentativni rezultati kloniranja in sekvenciranja skupnega PCR. Prehodne-CpG mest v CDH1
, CDKN2A
in RUNX3
geni so bili analizirani s kloniranjem in zaporedja skupno PCR produkt. Genomsko DNA predstavljene na sliki 1A smo uporabili za primerjavo rezultatov PPN z rezultati zaporedja. V odprti in zaprti krogi nemetilirane in metiliranih ostankov citozina oz. V pravokotne škatle kažejo s primarnim mesta PPN ubral standardno krivuljo glede na različne mešanice intenzivnosti pasu od PPN izdelkov z.
Semikvanititativnimi ocenjevanje prehodnega-CpG variacije metilacije
PCR stanju vsakega PPN temeljni premaz nizu je bila potrjena univerzalna methylated in nemetiliran nadzor DNA [11, 18]. Genomsko DNA, zdravljenih z DNK methylase (CpGenome Universal metilira DNA, Chemicon, Temecula, CA, ZDA) in dopolniti s splošnimi primerjem (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') so bili uporabljeni za univerzalno methylated in nemetiliran kontrolno DNK oz. Ki temelji na standardni krivulji, je bila gostota metiliranje prehodnega-CpG samem izračuna po naslednji formuli: metilacija delež (%) = (intenzivnost metilacijskega /(metilacije + intenzivnosti unmethylation)) x 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Potrditi ponovljivost variabilne gostote metilacije pomočjo semikvantitivnimi analizo smo klasifikacija 5 ravni z 20% metiliranje prirastkom in klasifikacija 10 ravni z 10% metiliranje prirastek v primerjavi v parnih vzorcev tkiva. Primerjalna analiza parnih vzorcih je bila izvedena z uporabo dvojnih imenovanim nacionalnim organom 40 tkivih in 48 parov 1 cm-sosednjih tkiv poleg 100 parov antruma in telesnih tkivih, ki so bili pridobljeni od 50 H. pylori
- negativna želodcu tkiva in 50-H. pylori
-positive želodčne tkiva (slika 2). Slika 2 Analiza spremenljivo metilacije v mestih prehodno-CpG. (A in B) je ponovljivost klasifikacije 5-ravni z 20% metiliranje prirastka (a) in 10 ravni klasifikacije, z 10% metiliranje prirastka (B) je bil preverjen z deležem parnih vzorcih tkiv, ki kažejo nobenih razlik v raven metilacije. So podvojene DNA istega tkiva (zaprte palice), par 1 cm-sosednjih tkiv (siva barov) in par antruma in telesnih tkiv (odprtimi stolpiči) smo primerjali. (C in D) Analiza vmesne stopnje metilacije. Pogostost undermethylated in overmethylated primerih pa je bila ocenjena na podlagi vmesne ravni segajo dve ravni (20% metilacije) (c) in eno stopnjo (10% metilacija) (d) razvrstitev 10-ravni skupne v H. pylori
- negativna želodčne sluznice.
stopnjo overmethylation vsakega prehodnega-CpG mestu v H. pylori
-positive in -negativno želodčne sluznice je bila izračunana z relativnim deležem overmethylated primerov v skupni vsoti prenizko ali previsoko -metilira primerih. V H. pylori
-associated stopnja overmethylation bila izračunana na osnovi H. pylori
razmerje -positive-to-negativne za posamezno stopnjo prehodno-CpG-overmethylation. To je bil uporabljen za ovrednotenje razmerja med metiliranjem prehodnih-CpG mest in razdalja med začetnim mestu transkripcije in najbližjo retroelement (slika 3). Slika 3 H. pylori
inducirano metilacija CPG-otok-vsebujejo in -lacking genov glede na oddaljenost od najbližje retroelements in dejavnosti prepisu. Skupaj 14 Prehodno-CpG območij so združeni v osem CpG otoških genov (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
in RUNX3
) in šest geni nimajo CpG-otoki (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
in KRT6A
). Razdalja Gen-retroelement je bila ocenjena med transkripcijskih start mestih in najbližji Alu, L1 ali LTR retroelements. V H. pylori
inducirano hitrost metilacije je zastopal H. pylori
razmerje -positive-do-negativne stopnje overmethylation. Stopnja overmethylation je bila izračunana glede na relativno deleža overmethylated primerov v skupni vsoti pre- in metilirani primerih. Transkripcijski aktivnost vsakega gena je bila prikazana s številom izraženih transkriptov [4].
Kloniranje in sekvenciranje metilacije spremenljivke mestu
rezultate MSP prehodnih-CpG območij so ponovno potrdili s kloniranjem in zaporedja skupne PCR primerji kompleti ki zajemajo tako nemetilirane in metiliranih mest CpG (Slika 1B) [4, 11, 12]. PCR produkt iz skupnih ali osnovne sklope so klonirali v T & A vektor za kloniranje (Real Biotech, Taipei, Tajvan). Zaporedje DNA smo izvedli za 10 klonov skupnih vektorjev PCR z uporabo BigDye prenehanju veljavnosti Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, ZDA) in ABI avtomatizirano sekvencer z DNK (PE Biosystmes, Warrington, Velika Britanija). Ker skupna primerji sklopov, ki zajemajo CpG-revne regije proizvaja različne stopnje metilacije v skladu s pogojem, PCR, smo prilagodili stanje PCR skupnega temeljni premaz določil, da dobimo gostoto metilacijski, ki je bil podoben tako v semi-kvantitativno PPN testom in Rezultati sekvenciranje 10 common-PCR klonov.
Analiza mikrosatelitskih alelov
za analizo osnovi PCR LOH, skupno 40 mikrosatelitskih markerjev na osem, povezanimi z rakom kromosomov (3p, 4p, 5q, 8p, 9P so 13q, 17p in 18q) in smernice za točkovanje status LOH in MSI, kot je navedena drugje [20, 21]. Profil alelna od 40 mikrosatelitskih sekvenc proučene v vsakem primeru je bila prvotno razvrščena v MSI temelji na prisotnosti novih alelov v homozigotnim označevalec in enostransko izgube alelne v heterozigotno marker. Po številu LOH pozitivni kromosomov, je bila stopnja LOH ocenili kot nizko raven (dvema ali tremi izgube kromosomskih, LOH-L) in visoke ravni (štiri ali več kromosomske izgube, LOH-H) LOH. Ena ali ni izgub kromosomskih so razvrščeni v ravni izhodiščnega (LOH-B) za raka na razpršeno tipa in v nizki ravni črevesne in mešanega tipa, oziroma, glede na njihovo ustrezno histološko podtipa.
Statistična analiza
Fisherjev natančni test ni bil uporabljen za primerjavo pre- in metilacije spremembe med H. pylori
-negativno ali -positive želodčne sluznice in želodca raka, s pomenom dodeljena na vrednosti pod P
cenijo manj kot 0,01 . Test t
študent je bil uporabljen za primerjavo razlik metilacije med želodca noncancerous in rakavih tkiv, s pomenom dodeljena na vrednosti pod P
cenijo manj kot 0,05. Statistično vrednotenje je bilo izvedeno s pomočjo programskega paketa statističnega SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA).
Rezultati
metilacije-variacije noncancerous tkivih
smo izbrali skupno 14 Prehodno-CpG mestih od osmih CpG otoških genov (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
in RUNX3
) in šest CpG -island-brez genov (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
in KRT6A
) (tabela 1). Ponovljivost prehodnega-CpG mestu vsake PPN osnovnim naborom pomnožene je bil ocenjen z podvojene DNA istega tkiva, par 1 cm-sosednjih tkiv in par antruma in telesnimi tkivi (slika 2A in 2B). 92% od 40 podvojenih DNA, 73% od 48 1 cm-sosednja tkiva parov in 58% od 100 antruma in telo pari so ocenili kot enaki ravni metilacije v klasifikaciji 5 ravni. Isti-dosegel primeri iz podvojenih poskusov je bilo približno 25% pogostejše v razvrstitvi 5 ravni kot v razvrstitvi 10-ravni.
Vmesna raven variabilnih prehodnega-CpG metilacije je bil analiziran z uporabo 1.400 PPN amplikonov od 14 prehodno-CpG mest, pridobljeni iz 100 H. pylori
-negativno vzorcev z želodcem (slika 2C in 2D). V klasifikacije 10 ravni, je del enotne skupne stopnje metilacije (38%), tako nizka, da je vmesna stopnja določena na osnovi dveh skupnih nivojih. 937 (67%) od 1.400 PPN pomnožkov so bile razvrščene v vmesni ravni v 100 tkivih. Vmesne stopnje metilacije osmih CpG otoških robu večinoma nižje od tistih šestih CpG otoških-primanjkuje mest (tabela 2). Na splošno velike frakcije posameznih želodčnih tkiv (67%) in tkiva parov 1 cm-sosednjima (73%) je pokazala, da so prehodne-CpG mest metiliramo v območju podobnih gostoti variira med okoli 20%. Zato je bila uporabljena vmesna raven, ki zajema dve ravni (20% metilacije) razvrstitve 10 ravneh, da bi ugotovil preveč ali premalo metilirani status prehodnih-CpG mest v želodcu mucosa.Table 2. Pogostost premalo in preveč denaturirani primeri so določena na podlagi vmesne ravni metilacijskih pogoste v H. pylori
-negativno želodčne sluznice (n = 100)
ime Gene

Vmesna metilacija gostota
No. od podjetij metiliranih primerih
No. vmesnih primerov metilacijskih
No. od previsokega metiliranih primerih
CpG-otok, ki vsebuje gene
CDH1
0 - 20%
0
79
21
ARRDC4

0 - 20%
0
80
20
PPARG
0 - 20%
0
60
40
CDKN2A

0 - 20%
0
54
46
TRAPPC2L
40-60%
13
81
6
DUSP6
20 - 40%
26
62
12
MLH1
20 - 40%
20
61
19
RUNX3
30 - 50%
5
53
42
CpG-otok brez genov
PGA5
40 - 60%
10
78
12
PGC
40-60%
29
67
4
TFF1
20 - 40%
11
52
37
TFF2
30-50%
36
60
4
MSLN
60 - 80%
0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
Povezava med H. pylori
- povezana overmethylation bodisi retroelements ali prepis dejavnost
frekvence na pre- in metilirani primerov je bilo posebej šteje za oceno spremembe v spremenljivki metilacije območij prehodno-CpG (tabela 3). Na podlagi analize overmethylated primerih, so bili vsi CpG-otok marže so bistveno overmethylated v H. pylori
okuženimi želodčne sluznice in nobena od-CpG otoških primanjkuje mestih je pokazala bistveno razliko za pogostnosti overmethylated primerov . Na podlagi analize undermethylated primerov, je bila pogostnost undermethylated TFF1
gena v H. pylori
-positive želodčne sluznice (P
= 0,003) precej nizka. Podatki metitiranjem kostnega mozga je bila praksa iz prejšnje študije z uporabo istega-radioizotopov označevanje PPN protokola [4]. V kostnem mozgu je PGC
, TFF1
, MSLN
in RUNX3
genov bili povsem metilalkohol, medtem ko je bila večina CpG otoških genov popolnoma unmethylated.Table 3 Primerjava pogostosti preveč in undermethylated geni odkrita v želodcu ne-rakavih in rakavih tkiv
Gene

noncancerous tkivo

mikrosatelitskih genotipa želodčnega raka (%)
kostnega mozga

H. pylori
negativna
(n = 100)
H. pylori
pozitiven
(n = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29)

LOH-H
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18)
(%)

Overmethylation frekvenca
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24)
3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 *
3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
1 ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9 (69)
16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 *
3 (23)
3 (10)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
MLH1
19
37 *
4 (31)
17 (59) *
11 ( 46)
3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
PGA5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4
10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38)
3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4
3
4 (31)
4 (14)
1 (4)
0 (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) *
16 (55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17)
3 (75)
3 (17)
Undermethylation frekvenca
CDH1
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25)
16 (89)
DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50)
18 (100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
1 (25)
17 (94)
RUNX3
5
1
0 (0 )
1 (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
PGA5
10.
14
0 (0 )
3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29.
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) *
3 (75)
0 (0)
TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33)
3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
1 (3)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23)
3 (10)
3 (13)
1 (25)
5 (28)
želodčnega raka, so bile razvrščene v ravni izhodišče LOH (LOH-B) z nizko stopnjo LOH (LOH-L), visoko stopnjo LOH (LOH-H) in mikrosatelitno nestabilnost (MSI). Podrobnosti so opisane v poglavju materiala in metod.
* H. pylori
-positive želodčne sluznice in želodčni rak, so primerjali s H. pylori
-negativno želodčne sluznice. Pomembne razlike so bile določene s pomočjo Fisherjev natančni test (P
< 0,01).
Odnos med metilacije prehodno-CpG in razdaljo do najbližjega retroelement je ocenilo z H. pylori
-associated stopnja overmethylation (slika 3). V CpG otoških genov, je bil na H. pylori
-associated stopnja overmethylation večja kot razdalja od najbližje retroelement postal krajši. CPG-Otok-brez genov, ki ni pokazala bistvenih metilacijo razlika med H. pylori
-positive in -negativno sluznice so metilira, ne glede na oddaljenost od najbližje retroelement.
Metiliranje prehodno-CpG mestih so primerjali med želodca in kostnega mozga v smislu aktivnosti transkripcijskega (tabela 1 in slika 4). CpG-otok gen skupina, ki je šibka v želodcu je bolj methylated v H. pylori
-negativno in -positive tkiva, kot da se v kostnem mozgu. CPG-otok-manjkajo TFF2
in PGA5
genov, ki so najbolj izražene v želodcu, je bila povprečna stopnja metilacija v TFF2
gena nižja kot v kostnem mozgu (1,9) kot v H. pylori
-negativno (2,6, P
= 0,015) in -positive sluznica (2,7, P
= 0,015). Srednja raven metilacija v PGA5
gena je bila podobna v kostnem mozgu (3.1) in H. pylori
-negativno (3.0) in -positive sluznice (3.0). PGC
in TFF1
želodec specifičnih genov, ki so bili šibka v želodčni sluznici v primerjavi z dvema master želodčnih specifičnih genov, so gosto metilnega v kostnem mozgu (pomeni raven metilacijo, 4.3 in 4.8). Slika 4 metilacije v kostnem mozgu in želodca noncancerous in rakavih tkiv.

• Občasni metastaze na želodcu sluznice
• CD44, vendar ne CD24 izraz je povezano s slabo prognozo v ne-Cardia adenokarcinomom želodca