Overmethylated geenit Helicobacter pylori-tartunnan mahalaukun limakalvon ovat demetyloida mahasyövistä

Overmethylated geenit Helicobacter pylori
infektoiduista mahalaukun limakalvon ovat demetyloida mahasyövistä
tiivistelmä
tausta
siirtymävaiheen-CpG sivustojen välillä heikosti metyloituneiden geenien ja tiheästi metyloituja retroelements ovat overmethylated mahalaukun limakalvon tartunnan Helicobacter pylori
(H. pylori
) ja ne undermethylated mahalaukun syövistä riippuen tasosta heterotsygotian menetys (LOH) tapahtumia. Tämä tutkimus rajaamalla siirtymäkauden-CpG metylaation CpG-saaren sisältävien ja -lacking geenien otetaan retroelements. Tool Menetelmät
siirtymävaiheen-CpG sivustoja kahdeksan CpG-saari sisältäviä geenejä ja kuusi CpG-saari -lacking geenejä semi-kvantitatiivisesti tutkittiin suorittamalla radioisotooppi-merkintöjä metylaatiospesifistä PCR ankarissa olosuhteissa. Taso LOH mahalaukun syövistä arvioitiin käyttäen 40 mikrosatelliittimarkkerin kahdeksan syöpään liittyvien kromosomeja. Kukin geeni pisteytettiin overmethylated tai undermethylated perustuu keskitason siirtymäkauden-CpG metylaatio yleinen helikobakteeri
-negatiivinen mahan limakalvon.
Tulokset
Kahdeksan CpG-saari geenit Tutkittujen overmethylated riippuen läheisyys lähimpään retroelement että H. pylori
-positiivinen mahalaukun limakalvon. Kuusi CpG-saarekkeen puuttuvat geenit samalla metyloitavaa helikobakteeri
positiivisten ja -negatiivinen mahalaukun limakalvon. Vuonna syöpien, pitkän siirtymäajan-CpG segmenttien CpG-saaren geenit etäällä retroelements pysyi overmethylated, kun taas overmethylation lyhyen siirtymävaiheen-CpG segmenttien lähellä retroelements ei ollut merkittävä. Sekä CpG-saari sisältävien ja -lacking geenit näyttivät olevan pienentävästi metyloitu on LOH-tason riippuvalla tavalla.
Johtopäätökset
overmethylated geenit vaikutuksen alaisena retroelement metylaatio helikobakteerin
- tartunnan mahan demetyloida mahasyövistä vaikutteita Loh.
Taustaa
hiirimalli tartunnan Helicobacter pylori
(H. pylori
) on esitetty, että luuytimen kantasolut vaeltavat mahalaukun limakalvon ja sitten ne erilaistuvat mahan epiteelisoluihin [1]. Erään itseorganisaation malli, erittäin ilmaistu herrageenejä voivat muodostaa transkription napa koordinoida ilmaisun monien muiden geenien [2]. Annostus korvausmekanismi ehdottaa, että on olemassa käänteinen korrelaatio taloudenhoito geenien sisältävän CpG-saaret ja kudosspesifisiä geenejä puuttuu CpG-saarilla, jotka molemmat jakavat rajallinen määrä tumaproteiinien ydinvoiman tilaan [3, 4]. Sekä itseorganisaation ja annostus palkkausmallien korostavat, että epigeneettiset myötäsääntelyä erittäin aktiivista mahan-geenejä ja heikosti aktiivisia taloudenhoito geenien helpottaa trans-eriyttäminen luuytimestä peräisin olevien solujen vatsassa.
Yksilöt tartunnan H. pylori
usein tehdään useita mahalaukun limakalvon muutoksia, kuten syöpää edeltävät ja pahanlaatuisten vaurioiden [5]. Vaikka CpG-saari overmethylation jotka voivat johtaa inaktivoimiseksi syöpään liittyvien geenien on yleinen helikobakteeri
infektoiduista mahalaukun limakalvon, välisestä assosiaatiosta overmethylation ja ilmentyminen yksittäisten CpG-saari geenien on epäselvä [6]. Mahalaukun syöpää edeltävät ja pahanlaatuisten vaurioiden ovat osoittaneet CpG-saari overmethylation sekä genomin laajuinen undermethylation, mutta kaksi erillistä metylaatiomuutokset ei osoittanut yhteistyön seuraavaa kehitystä precancer ja syövän [7]. Lisäksi voimakkaasti ilmaistu vatsa-geenit pelaa isäntä asema myötäsääntelyä lukuisten geenien ovat osoittaneet muutamia metylaatiomuutokset mahalaukun syövistä [4, 8]. Mitä tulee koordinoida geeniekspressiota, on tarpeen rajata jos vatsa-geenien ja taloudenhoito geenit tehdään samanaikaisia ​​yli- ja metylaatiomuutokset.
Retroelements ovat itsemonistuvista loisten DNA: t, jotka vievät puolet ihmisen genomi [ ,,,0],9]. Isännän genomiin estää vaarallisen mutaation vaikutus loistaudit retroelements kautta DNA: n metylaatio-riippuvaisen mekanismin [10]. Siirtymäkauden alue välillä heikosti metyloitu geenien ja tiheästi metyloitu retroelements, kuten CpG-saari marginaali ja transkription aloituskohdasta puuttuu CpG-saarilla, on metyloitu eriasteisina on kudostyypin riippuvaisella tavalla [4, 11, 12 ]. Metylaatio siirtymävaiheen-CpG sivustoja muuttuu dynaamisesti vastauksena laajuisen erilaistuminen luuydinperuskudos- soluihin ja menettämisestä Heterotsygoottisuuden (LOH) tapahtumia mahasyövistä [12-15]. Toinen edellinen tutkimus on myös kuvattu, että "CpG-saari shore" liittyy asetuksen kanssa solujen erilaistumisen ja syövän syntymistä [16]. Kiinnostavaa kyllä, monet siirtymäajan-CpG sivustoja ja geeni-vierekkäiset retroelements samanaikaisesti yli- tai undermethylated tietyssä kudoksessa [11, 17], mikä osoittaa, että samanaikaisten metylaatiomuutokset lukuisissa geenit ovat vaikutuksen alaisena retroelement metylaation. Samaan aikaan useimmat CpG-rikas saaret ovat heikosti metyloituja tai metyloimattomien useimmissa kudosten tyyppejä, ja CpG-rikas sivustot eivät sovi analysointiin dynaamisen metylaation vieressä geeni-ohjaus alueilla [12, 13, 15, 18]. Siksi siirtymäkauden-CpG sivustoja, pikemminkin kuin CpG-rikkaan saarilla, todennäköisesti toimimaan pivot-metylointi kantoja, jotka heijastavat samanaikainen metylaation liittyy helikobakteeri
infektion ja kehitystä syöpä.
Tämä tutkimus tutki siirtymäkauden-CpG metylaation CpG-saari geenien ja mahan-geenit puuttuvat CpG-saaria helikobakteeri
infektoituihin mahalaukun limakalvon ja mahalaukun syövistä. Muuttuva metylaatio siirtymävaiheen-CpG-kohdille oli puolittain määrällisesti arvioidaan tiukoissa metylaatiospesifistä PCR (MSP) olosuhteet, jotka tuottivat selkeitä DNA bändejä [4, 8]. Lisäys tai vähennys siirtymäkauden-CpG metylaatio kunkin geenin määritettiin perustuen väli- metylaatio helikobakteerin
-negatiivinen mahan limakalvon. Tool Menetelmät
kerääminen kudosnäytteiden
ei-syöpä kudosnäytteitä kerättiin peräkkäisen avohoidossa, joille tehtiin mahalaukun tähystykseen huhtikuusta 2008 lokakuuhun 2009 St. Paulin sairaala, The Catholic University of Korea. Aikana tähystystutki-, kaksi vierekkäistä kudosnäytteet saatiin mahan antrum ja runko-osan, vastaavasti. Yksi Ohutsuolikoepala kiinnitettiin formaliinilla varten histologista tutkimusta ja toinen biopsianäytteen käytettiin DNA: n eristämiseksi. Patologi vahvisti mahalaukun epiteelisolujen pitoisuus on yli 80% puhtaus biopsia kudoksissa. Helikobakteeri
infektio tutkittiin käyttäen Warthin-Starry hopea kyllästämismenetelmällä. Tähän tutkimukseen osallistui 50 antrumiin ja kehon pareittain helikobakteeri
-negatiivinen tapausta, joiden keski-ikä oli 53,2 ja 50 antrum ja kehon pareittain helikobakteeri
positiivisten tapausten keski-ikä oli 55,6. Oli 25 urosta ja 25 naarasta helikobakteerin
-negatiivinen tapauksissa ja 26 urosta ja 24 naarasta helikobakteerin
-positiivisille tapauksissa. Mahasyövän kudokset saatiin patologisen yksilöitä 48 mies- ja 22 naispotilaita (keski-ikä: 63,7), joka tehtiin kirurginen resektio maaliskuun 2005 ja joulukuun 2008 St. Paulin sairaala, The Catholic University of Korea. Ennusteeseen viittaavia kasvain vaihe määräytyy Kasvaimen-Node-Metastasis (TNM) perusteet [19]. Kaikki aiheet, jos niiden kirjallinen suostumus ja tämän tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board.
Tissue valmistelu ja bisulfiittimodifikaatio DNA
Tuoretta koepalanäytteistä käytettiin toteutettavissa puolikvantitatiivinen MSP analyysi, koska formaliinilla kiinteä kudoksen DNA: t ovat yleensä huonosti monistaa jälkeen bisulfiittimodifikaatio [8]. Sillä mikrosatelliittimerkki analyysi, DNA uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja kasvaimen kudokset kuten aiemmin on kuvattu [20, 21]. Kasvain näytteet microdissected leikkausspaattelia käyttäen stereomikroskoopin alla. Kaikki mikropaloitelluista syöpäkudosten sisälsi syöpäsolun pitoisuus on yli 80%. Käyttämällä DNA-uuttopuskuria (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA, pH 8,0, 50 mM Tris, pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinaasi K), biopsianäytteet ja mikropaloitelluista kudokset digestoitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Noin 1000-soluja inkuboitiin 20 ui DNA-uuttopuskuria, jonka jälkeen DNA-eristys pakkausta (A1120, Promega, Madison, WI, USA) käytetään erottamaan genomisen DNA: n mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Tissue DNA on muutettu käyttäen natriumbisulfiittia kuten kuvattu muualla [8, 11-13]. Lyhyesti, 1 ug genomista DNA: ta käsiteltiin 10 ui 3 M NaOH 15 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten denaturoitua DNA: ta sekoitettiin 1,04 ml: lla 2,3 M natriumbisulfiittia ja 60 ui 10 mM hydrokinonia, ja tämä lämmitettiin 50 ° C: ssa 12 tunnin ajan. Vetysulfiitilla käsitellyn DNA: n, joka puhdistettiin käyttämällä Wizard DNA: n puhdistus hartsia (Promega, Madison, WI, USA), oli desulfonoituu 3 M NaOH: lla ja saostettiin etanolilla, ja sen jälkeen liuotettiin 35 ul: aan 5 mM Tris-puskuria (pH 8,0) .
Radioisotooppinen Nimen semikvantitatiivinen metylointianalyysi
Vertaileva analyysi microarray ja SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) data on havaittu, että määrä transkriptien lasketa SAGE data tarkasti merkitsee suurta eroa geenin aktiivisuuteen mahassa-geenien ja siivous geenit [4]. Siirtymäkauden-CpG sivustoja mahan-geenit (PGA5
ja PGC
) [22], limakalvo-parantava geenit (TFF1
ja TFF2
) [23], syöpää liittyvä geenit (CDH1
, MLH1
, PPARg
, CDKN2A
ja RUNX3
) [15, 24-27], ja ei-mahalaukun geenejä (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN
ja KRT6A
) [28-32] on valittu (taulukko 1). MSP sivustoja, sekvenssit, ja olosuhteet esitetään Additional File 1. alhainen GC sisällön ja toistuva sekvenssi Metylointilaitteistoon muuttujan siirtymävaiheen-CpG sivuston usein osoitti heikkoa tai smearingia MSP bändejä vuoksi alennettu monimutkaisuuden nukleotidisekvenssien seuraavat bisulfiitti hoito [4, 8, 33]. Lisätäkseen spesifisyyden siirtymävaiheen-CpG vahvistus, jokainen MSP alukesarja suunniteltiin sisältämään 3-5 CpG sivustoja ja käsittämään pieni amplikonin koko ja MSP reaktio suoritettiin ankarissa olosuhteissa käyttäen dTTP-radioisotooppi kuten aiemmin on kuvattu [4, 8, 11, 12]. Lyhyesti, 10 ui PCR-seosta, joka sisälsi 1 ui bisulfiitti muunnettua DNA: ta, 1 uCi α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 uM dATP, dCTP ja dGTP, 25 uM dTTP: tä, 1 pmol alukkeiden, 0,1% Tween 20 ja 0,3 yksikköä Taq-
polymeraasin monistettiin 32 PCR sykliä kuumissa käynnistä PCR-olosuhteissa. Edustaja metylaatio Tulokset esitetään kuvassa 1A.Table 1 Lähin retroelement ja transkription 14 valitun geenin kanssa ja ilman CpG-saarekkeiden
Gene

CpG-saarekkeiden
Lähin retroelement
No. of ilmaistu selostukset vatsassa


nimi perheen
Etäisyys transkription aloituskohdasta

CDH1
Kyllä
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Kyllä
Alu
1,7 ke
7
PPARg

Kyllä
Alu
2,3 ke
3
CDKN2A
Kyllä
LTR
2,4 kb
1
TRAPPC2L

Kyllä
Alu
3,8 kb
14
DUSP6
Kyllä
Alu
6,6 kb
8
MLH1

Kyllä
Alu
6,6 kb
0
RUNX3
Kyllä
LTR
8,3 kb
0
PGA5
Ei
Alu
1,2 kb
734
PGC
Ei
Alu
1,6 kb
33
TFF1
Ei
Alu
0,5 kb
11
TFF2
Ei
L1
2,7 kb
632
MSLN
Ei
Alu
1,4 kb
50
KRT6A
o
Alu
4,2 kb
1
koskevat tiedot CpG-saarekkeiden, retroelements ja määrä ilmaistaan ​​transkriptien mahan saatiin aikaisemmin julkaistuihin tietoihin [4].
Kuva 1 puolikvantitatiivinen metylointianalyysi (A) ja kloonaus ja sekvensointi (B) siirtymävaiheen-CpG sivustoja. Metylaatio siirtymävaiheen-CpG sivustoja arvioitiin suorittamalla puolikvantitatiivinen metylointianalyysi (A) ja se on todennettu kloonaus ja sekvensointi yhteisen alukkeen (B). (A) yhteensä 14 siirtymäajan-CpG sivustoja tutkittiin helikobakteeri
-negatiivinen ja helikobakteeri
positiivisten normaali mahan limakalvoa ja syöpä vaurion mahalaukun syöpäpotilailla. Metylointi tiheys laskettiin osuus metylaation (M) bändi intensiteetti vastaan ​​koko unmethylation (U) ja metylointi bändi intensiteetti. Metylointi tiheys kunkin CpG sivusto oli luokiteltu 5 tasoa 20% -methylation lisäys. Metylaatiostatuksen kunkin geenin luokiteltiin undermethylation (ali-) tai overmethylation (yli-), joka perustuu keskitason metylaation tason (kansainväliset) ja H. pylori
-negatiivinen normaalin mahan limakalvon. (B) edustaja tulokset kloonaus ja sekvensointi yhteisten PCR. Siirtymäkauden-CpG sivustoja CDH1
, CDKN2A
ja RUNX3
geenit analysoitiin kloonaamalla ja sekvensoimalla yhteisen PCR-tuotetta. Genomisen DNA: t esitetty kuviossa 1A käytettiin vertaamaan MSP tuloksia sekvensointi tuloksia. Avoin ja suljettu ympyrät osoittavat metyloitumattoman ja metyloidut sytosiinitähteiden, vastaavasti. Suorakulmainen ruudut ilmaisevat MSP alukekohtien.
Semikvantitatiivinen arviointi siirtymävaiheen-CpG metylaatio vaihtelu
PCR kuntoa jokaisen MSP alukesarja validoitiin piirtämällä standardikäyrän mukaan eri seoksia kaistan intensiteettiä MSP tuotteita universaali metyloitu ja metyloitumaton kontrolli-DNA [11, 18]. Perimän DNA käsiteltiin DNA-metylaasia (CpGenome Universal Metyloidut DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) ja monistetaan universaali (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') käytettiin Universal metyloitu ja metyloimattoman kontrolli-DNA: lla. Perustuu Standardikäyrää, metylointi tiheys siirtymävaiheen-CpG laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: metylaatio osuus (%) = (metylaatio intensiteetti /(metylaatio + unmethylation intensiteetti)) x 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Validoida toistettavuus muuttujan metylaation tiheys käyttämällä puoli- kvantitatiivista analyysiä, 5-tason luokitus 20% -methylation lisäys ja 10-tason luokitus 10% -methylation lisäys verrattiin pariksi kudosnäytteistä. Vertaileva analyysi pariksi näytteistä suoritettiin käyttäen päällekkäisiä DNA: t 40 kudosten ja 48 paria 1-cm viereisten kudosten lisäksi 100 paria antrum ja kudoksiin, jotka saatiin 50 Helikobakteeri
- negatiivinen vatsa kudoksia ja 50 helikobakteeri
positiivisten mahan kudoksissa (kuva 2). Kuvio 2 analyysi muuttujan metylaation siirtymävaiheen-CpG sivustoja. (A ja B) toistettavuus 5-tason luokitus 20% -methylation lisäys (A) ja 10-tason luokitukset 10% -methylation lisäys (B) varmennettiin osuus pariksi kudosnäytteiden osoittavat ole eroja taso metylaation. Kahdennettu DNA: t kuin saman kudoksen (umpinaiset pylväät), parin 1-cm viereisiin kudoksiin (harmaat pylväät) ja pari antrum ja kehon kudosten (avoimet pylväät) verrattiin. (C ja D) analyysi keskitason metylaation tasolle. Taajuus undermethylated ja overmethylated tapauksissa arvioitiin perustuen keskitason ulottuu kaksi tasoa (20% metylaatio) (C) ja yksi taso (10% metylaatio) (D) 10-tason luokitus yleinen helikobakteeri
- negatiivinen mahan limakalvon.
overmethylation määrä kunkin siirtymäajan-CpG sivusto helikobakteeri
positiivisten ja -negatiivinen mahalaukun limakalvo on laskettu suhteellinen osuus overmethylated tapaukset kokonaismäärä sekä yli- ja metyloitu tapauksissa. Helikobakteeri
-associated overmethylation laskettiin käyttäen H. pylori
positiivisten-to-negatiivinen suhde kunkin siirtymäajan-CpG-overmethylation korko. Tätä käytettiin arvioimaan suhde metylaation siirtymäkauden-CpG sivustoja ja etäisyys transkription aloituskohdasta ja lähin retroelement (kuvio 3). Kuvio 3 H. pylori
indusoima metylaation CpG-saaren sisältävien ja -lacking geenit mukaan etäisyys lähimpään retroelements ja transkription aktiivisuus. Yhteensä 14 siirtymäajan-CpG sivustoja ryhmiteltiin kahdeksaan CpG-saari geenit (CDH1
, ARRDC4
, PPARg
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
ja RUNX3
) ja kuusi geeniä puuttuu CpG-saaret (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
ja KRT6A
). Geeni-retroelement etäisyyden arvioitiin välinen transkription aloituspaikat ja lähin Alu, L1 tai LTR retroelements. Helikobakteeri
indusoimaan metylaatio korko edusti H. pylori
positiivisten-to-negatiivinen suhde overmethylation korko. Overmethylation laskettiin mukaan suhteellista osuutta overmethylated tapaukset kokonaismäärä sekä yli- ja metyloitu tapauksissa. Transkriptionaalista aktiivisuutta kunkin geenin kohdalla osoitettiin määrä ilmaistaan ​​selostukset [4].
Kloonaus ja sekvensointi metylaation muuttujan päällä
MSP tulokset siirtymävaiheen-CpG sivustot olivat vahvisti kloonaus ja sekvensointi yhteisen PCR alukesarjat kattaa sekä metyloitumattomalla ja metyloitu CpG sivustoja (kuvio 1 B) [4, 11, 12]. PCR-tuotteet yhteisen alukkeen sarjaa kloonattiin T & Kloonausvektori (Real Biotech, Taipei, Taiwan). DNA-sekvensointi suoritettiin 10 kloonien yhteisen PCR vektoreita käyttämällä BigDye Termination Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) ja ABI automaattisella DNA-sekvensointilaitteella (PE Biosystmes, Warrington, UK). Koska yhteinen alukesarjoista kattaa CpG-köyhien alueiden tuotettu eriasteista metylaation mukaan PCR kunnossa, sopeutimme PCR kunnon yhteisen alukesetin saada metylaatio tiheys, joka oli samankaltainen sekä semikvantitatiivinen MSP määritys ja sekvensointi tulokset 10 yhteisen-PCR-klooneja.
analyysi Mikrosatelliittimarkkerien alleelien
varten PCR-pohjainen LOH-analyysi, yhteensä 40 mikrosatelliittimarkkerin kahdeksan syöpään liittyvän kromosomien (3p, 4p, 5q, 8p, 9p , 13q, 17p ja 18q) ja suuntaviivat teki tilan LOH ja MSI käytettiin kuvattu muualla [20, 21]. Alleelinen profiili 40 mikrosatelliittimerkkien sekvenssit tutkittiin kussakin tapauksessa oli aluksi luokiteltu MSI läsnäoloon perustuvaa uusien alleelien homotsygoottinen merkki ja yksipuoliset alleeliset menetys heterotsygoottinen merkki. Mukaan määrä LOH-positiivisten kromosomit, taso LOH pisteytettiin matalan tason (kaksi tai kolme kromosomaalisesta tappiota, LOH-L) ja korkean tason (neljä tai enemmän kromosomaalisesta tappioita, LOH-H) LOH. Yksi tai ei kromosomaalisesta tappioita luokiteltiin lähtötilanteen tason (LOH-B) diffuusi-tyyppinen syöpä ja osaksi matala taso suoliston ja sekamuotoinen, vastaavasti, riippuen niiden vastaavien histologinen alatyyppi.
Tilastollinen analyysi
Fisherin testiä käytettiin vertailtaessa yli- ja metylaatiomuutokset välillä helikobakteerin
-negatiivinen tai positiivisten mahalaukun limakalvon ja mahalaukun syövistä, jossa merkitys osoitetaan arvojen alle P
arvot alle 0,01 . Studentin t-
testiä käytettiin verrattaessa metylaation eroja mahan noncancerous ja syöpä- kudoksiin, jossa merkitsevyys on määritetty arvot alle P
-arvot olivat alle 0,05. Tilastollinen arviointi suoritettiin käyttäen tilastollista ohjelmistoa SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Tulokset
Metylaatiospesifinen vaihtelu noncancerous kudoksissa
yhteensä 14 siirtymäajan-CpG sivustot valittiin kahdeksasta CpG-saari geenit (CDH1
, ARRDC4
, PPARg
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
ja RUNX3
) ja kuusi CpG -island-puuttuvat geenit (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
ja KRT6A
) (taulukko 1). Toistettavuus siirtymävaiheen-CpG monistetaan kukin MSP alukesarja arvioitiin kanssa monistaa DNA: t saman kudoksen, pari 1-cm viereisiin kudoksiin ja pari antrum ja kudoksiin (kuvio 2A ja 2B). 92%: n 40 kahdennettu DNA: t, 73% 48 1-cm vieruskudos paria, ja 58%: n 100 antrumiin ja kehon paria pisteytettiin samalla metylaatiotasoilla 5-tason luokitus. Sama-maalin tapauksia kahdennettu kokeet olivat noin 25% yleisempää 5-tason luokitus kuin 10-tason luokitus.
Keskitason muuttuvien siirtymävaiheen-CpG metylaatio analysoitiin 1400 MSP amplikoneja 14 siirtymäkauden-CpG sivustoja saatu 100 helikobakteeri
-negatiivinen mahaan näytteistä (kuvio 2C ja 2D). Vuonna 10-tason luokitus, osa yhden yhteisen metylaatio taso (38%) oli niin alhainen, että keskitason määritettiin perustuen kaksi yhteistä tasoa. 937 (67%) 1400 MSP amplikonit oli luokiteltu keskitason vuonna 100 kudoksissa. Intermediate metylaatiotasoilla kahdeksan CpG-saari marginaalit olivat yleensä alhaisempia kuin kuusi CpG-saarekkeen puuttuu sivustoja (taulukko 2). Kaiken kaikkiaan suuri jakeet yksittäisten mahan kudoksissa (67%) ja 1 cm: n viereiseen kudokseen parien (73%) osoitti, että siirtymävaiheen-CpG sivustoja metyloitiin alueella samanlaisten tiheydet vaihtelevat välillä noin 20%. Siksi keskitason ulottuu kaksi tasoa (20% metylaatio) 10-tason luokitus käytettiin määrittämään ali- tai metyloitu asema siirtymävaiheen-CpG sivustoja mahalaukun mucosa.Table 2 taajuus ali- ja yli- metyloitua tapauksissa määritetty perustuen väli metylaatiotasoilla yleinen helikobakteeri
-negatiivinen mahalaukun limakalvo (n = 100) B Gene nimi

Intermediate metylaatio tiheys
No. ali- metyloitu tapauksista
No. välituotteiden metylaation tapauksista
No. yli- metyloitu tapauksista
CpG-saari, joka sisältää geenejä
CDH1
0-20%
0
79
21
ARRDC4

0-20%
0
80
20
PPARg
0-20%
0
60
40
CDKN2A

0-20%
0
54
46
TRAPPC2L
40-60%
13
81
6
DUSP6
20 - 40%,
26
62
12
MLH1
20 - 40%,
20
61
19
RUNX3
30-50%
5
53
42
CpG-saari puuttuvat geenit
PGA5
40-60%
10
78
12
PGC
40-60%
29
67
4
TFF1
20-40%
11
52
37
TFF2
30-50%
36
60
4
MSLN
60-80%
0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
väliset H. pylori
- liittyvä overmethylation joko retroelements tai transkription aktiivisuutta
taajuudet yli- ja metyloituja tapausta erikseen laskettiin arvioida muutoksia muuttujan metylaation siirtymäkauden-CpG sivustoja (taulukko 3). On analyysi overmethylated tapauksissa kaikki CpG-saaren marginaalit merkittävästi overmethylated että H. pylori
infektoiduissa mahalaukun limakalvon ja yksikään CpG-saarekkeen, josta puuttuu sivustoja osoitti merkittävää eroa varten taajuuden overmethylated tapauksissa . On analyysi undermethylated tapauksissa taajuus undermethylated TFF1
geeni oli merkittävästi alhainen H. pylori
positiivisten mahalaukun limakalvon (P
= 0,003). Metylointi data luuytimen mainittiin aiemman tutkimuksen käyttäen samaa radioisotooppi Nimen MSP protokolla [4]. Luuytimessä, PGC
, TFF1
, MSLN
ja RUNX3
geenit olivat täysin metyloitu, kun taas suurin osa CpG-saari geenit olivat täysin unmethylated.Table 3 vertailu taajuuden yli- ja undermethylated geenien havaittiin mahan ei-syöpä ja syöpäkudokset
Gene

noncancerous kudos

mikrosatelliittimerkkien genotyyppi mahasyövistä (%)
luuytimen

H. pylori
negatiivinen
(n = 100)
H. pylori
positiivinen
(n = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29) B
LOH-H
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18) B (%) B
Overmethylation taajuus
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24) B-3 (13) B 0 (0)
0 (0) B ARRDC4
20
62 *
3 (23) B-8 (28) B-1 (4) *
1 (25 )
0 (0) B PPARg
40
82 *
5 (38) B-7 (24) B-6 (25) B-1 ( 25) B 0 (0) B CDKN2A
46
90 *
9 (69) B 16 (55) B-9 (38) B-2 (50) B-4 (22) B TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25) B 0 (0) B DUSP6
12
36 *
3 (23) B-3 (10) B-1 (4)
2 (50) B 0 (0) B MLH1
19
37 *
4 (31) B 17 (59) *
11 ( 46) B-3 (75) B 0 (0) B RUNX3
42
85 *
10 (77) B 26 (90) *
19 (79) *
4 (100) B 18 (100) B PGA5
12
13
5 (38) B-8 (28)
1 (4) B 0 (0) B 0 (0) B PGC
4
10
4 (31) B-4 (14)
5 (21) B-1 (25) B 18 (100) B TFF1
37
52
5 (38) B-3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100) B TFF2
4
3
4 (31) B-4 (14)
1 (4) B 0 (0) B 2 (11) B MSLN
12
11
8 (62) *
16 (55 ) *
6 (25) B-1 (25) B 18 (100) B KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17) B-3 (75) B-3 (17) B Undermethylation taajuus
CDH1
0
0
0 (0 ) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B ARRDC4
0
0
0 (0 ) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B PPARg
0
0
0 (0 ) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B CDKN2A
0
0
0 (0 ) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B 0 (0) B TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7) B-7 (29) B-1 (25) B 16 (89) B DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45) B 12 (50) B-2 (50) B 18 (100) B MLH1
20
18
7 (54 ) B 6 (21) B-9 (38) B-1 (25) B-17 (94) B RUNX3
5
1
0 (0 ) B 1 (3) B-2 (8) B 0 (0) B 0 (0) B PGA5
10
14
0 (0 ) B 3 (10) B-5 (21) B 0 (0) B 0 (0) B PGC
29
18
4 (31 ) B 8 (28) B-5 (21) B-2 (50) B 0 (0) B TFF1
11
1 *
7 ( 54) B-19 (66) *
17 (71) *
3 (75) B 0 (0) B TFF2
36
26
4 (31) B 11 (38) B-8 (33) B-3 (75) B 13 (72) B MSLN
0
0
0 (0) B 1 (3) B-1 (4) B-2 (50) B 0 (0) B KRT6A
17
16
3 (23) B-3 (10) B-3 (13) B-1 (25) B-5 (28)
mahasyövistä oli luokiteltu perustason tason LOH (LOH-B) , matalan tason LOH (LOH-L), korkean tason LOH (LOH-H) ja mikrosatelliittien epävakaus (MSI). Yksityiskohdat on kuvattu materiaalit ja menetelmät jaksossa.
* H. pylori
positiivisia mahalaukun limakalvon ja mahalaukun syövistä verrattiin helikobakteeri
-negatiivinen mahalaukun limakalvon. Merkittäviä eroja määritettiin käyttämällä Fisherin testiä (P
< 0,01).
Suhde siirtymävaiheen-CpG metylaation ja etäisyys lähimpään retroelement arvioitiin käyttämällä helikobakteerin
-associated overmethylation rate (kuvio 3). CpG-saari geenejä, H. pylori
-associated overmethylation oli suurempi kuin etäisyys lähimpään retroelement lyheni. CpG-saarekkeen, josta puuttuu geenit, jotka eivät osoittaneet mitään merkittävää metylaatio eroa H. pylori
positiivisten ja -negatiivinen limakalvon metyloitiin riippumatta etäisyydestä lähimmän retroelement.
Metylaation siirtymäkauden-CpG sivustoja verrattiin välillä mahassa ja luuytimen suhteen transkription aktiivisuus (taulukko 1 ja kuva 4). CpG-saari geeni ryhmä, joka oli heikosti aktiivinen vatsassa oli metyloituneita helikobakteeri
-negatiivinen ja positiivisten kudosten kuin luuytimessä. CpG-saarekkeen puuttuu TFF2
ja PGA5
geenit, jotka oli korkeimmin ilmaistaan ​​mahassa, keskimääräinen metylaation tason TFF2
geeni oli pienempi kuin luuytimen (1,9) kuin helikobakteeri
-negatiivinen (2,6, P
= 0,015) ja positiivisia limakalvo (2,7, P
= 0,015). Keskimääräinen metylaatio taso PGA5
geeni oli samanlainen luuytimessä (3,1) ja helikobakteeri
-negatiivinen (3,0) ja positiivisia limakalvo (3,0). PGC
ja TFF1
vatsa-erityisiä geenejä, jotka olivat heikosti aktiivisia mahalaukun limakalvon verrattuna kaksi Master vatsa-geenit olivat tiheään metyloituja luuytimessä (keskiarvo metylaatio tasoa, 4.3 ja 4.8). Kuva 4 Metylointi luuytimessä ja mahalaukun noncancerous ja syöpäkudokset. Keskimääräinen taso metylaation luuytimessä (●), H. pylori
-negatiivinen mahan limakalvon (■), H. pylori
positiivisten mahan limakalvon (♦) ja perustason tason LOH tapauksissa (

• Harvinaista limakalvon metastaasit stomach
• CD44 mutta ei CD24 ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen ei-cardia adenokarsinooma stomach