I geni overmethylated in Helicobacter pylori
-infected mucosa gastrica sono demetilati in tumori gastrici
Abstract
sfondo
I siti di transizione-CpG tra geni debolmente metilato e retroelementi densamente denaturato sono overmethylated nella mucosa gastrica infettati con Helicobacter pylori
(H. pylori
) e sono undermethylated nei tumori gastrici a seconda del livello di perdita di eterozigosi (LOH eventi). Questo studio ha delineato i-CpG transitorie metilazione di CpG-isola-contenimento e -lacking geni in vista delle retroelementi.
Metodi Aziende Il transitorie-CpG siti di otto CpG-isola contenenti geni e sei CpG-isola geni -lacking sono stati semi-quantitativamente esaminati eseguendo radioisotopi-etichettatura metilazione-specifica PCR in condizioni severe. Il livello di LOH nei tumori gastrici è stato stimato utilizzando i marcatori microsatelliti 40 su otto cromosomi cancro-associata. Ogni gene è stato segnato come overmethylated o undermethylated sulla base di un livello intermedio di transizione-CpG metilazione comune nel H. pylori
-negativa mucosa gastrica.
Risultati
Gli otto geni CpG-isola sono stati esaminati overmethylated seconda la vicinanza al retroelemento più vicino nel H. pylori
-positivo mucosa gastrica. I sei CpG-isola-carente geni sono stati allo stesso modo metilato nei H. pylori
mucosa gastrica -positivo e -negativa. Nei tumori gastrici, lungo i segmenti di transizione-CpG dei geni CpG le isole distanti dalle retroelementi rimasti overmethylated, mentre il overmethylation di brevi segmenti di transizione-CpG vicino alle retroelementi non era significativa. Sia il CpG isola contenenti geni e -lacking la tendenza ad essere sempre meno metilato in maniera LOH-dipendente dal livello
Conclusioni
I geni overmethylated sotto l'influenza di metilazione retroelemento nel H. pylori
. - infetto stomaco sono demetilata nei tumori gastrici influenzati da LOH.
Sfondo
un modello di topo infettati da Helicobacter pylori
(H. pylori
) ha illustrato che le cellule staminali del midollo osseo migrano verso la mucosa gastrica e poi si differenziano in cellule epiteliali gastriche [1]. Secondo un modello di auto-organizzazione, master geni altamente espressi possono formare un hub trascrizione per coordinare l'espressione di molti altri geni [2]. Un meccanismo di compensazione del dosaggio propone che vi è una correlazione inversa tra i geni housekeeping contenenti CpG-isole e geni tessuto-specifici privo CpG-isole, che sia condividono un numero limitato di proteine nucleari nello spazio nucleari [3, 4]. Entrambi i modelli di auto-organizzazione e di compensazione del dosaggio evidenziano che l'epigenetica co-regolazione dei geni specifici stomaco altamente attivi e geni housekeeping debolmente attivi facilita la trans-differenziazione delle cellule derivate dal midollo nello stomaco.
Individui infetti con H. pylori
spesso subiscono una serie di cambiamenti della mucosa gastrica tra cui le lesioni precancerose e cancerose [5]. Anche se CpG isola overmethylation che può provocare l'inattivazione di geni del cancro-associata è comune nel H. pylori
mucosa gastrica -infected, un'associazione tra la overmethylation e l'espressione di singoli geni CpG Island è ambiguo [6]. lesioni precancerose e cancerose gastrico hanno dimostrato overmethylation CpG isola così come undermethylation genoma a livello, ma i due cambiamenti di metilazione distinti ha mostrato alcuna collaborazione per l'evoluzione sequenziale di precancro e cancro [7]. Inoltre, i geni specifici stomaco altamente espressi giocano un ruolo principale nella co-regolazione di numerosi geni hanno dimostrato alcuni cambiamenti metilazione nei tumori gastrici [4, 8]. Per quanto riguarda il coordinamento espressione genica, è necessario delineare se i geni specifici di stomaco e le geni housekeeping subiscono concomitanti cambiamenti sovra e sotto-metilazione.
I retroelementi sono DNA parassitarie auto-replicanti che occupano la metà del genoma umano [ ,,,0],9]. Il genoma ospite sopprime l'effetto di mutazione pericolosa delle retroelementi parassite attraverso un meccanismo di metilazione del DNA-dipendente [10]. La zona di transizione tra i geni debolmente metilati e le retroelementi densamente denaturato, come il margine CpG isola e il sito di inizio della trascrizione privo CpG-isole, viene metilato a vari gradi in modo tessuto-type-dipendente [4, 11, 12 ]. La metilazione dei siti transitorie-CpG cambia dinamicamente in risposta alla trans-differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e le (LOH) eventi con perdita di eterozigosi in tumori gastrici [12-15]. Un altro studio precedente ha descritto anche che la "riva CpG-isola" è in relazione con la regolazione della differenziazione cellulare e cancerogenesi [16]. È interessante notare che molti siti transitorio-CpG e retroelementi geni adiacenti sono simultaneamente sovra o undermethylated in un dato tessuto [11, 17], indicando che i cambiamenti di metilazione simultanee in numerosi geni sono sotto l'influenza di metilazione retroelemento. Nel frattempo, la maggior parte delle isole CpG-ricchi sono debolmente metilato o non metilato nella maggior parte dei tipi di tessuto, ei siti CpG-ricchi non sono adatti per l'analisi della metilazione dinamica adiacenti alle regioni gene di controllo [12, 13, 15, 18]. Pertanto, i siti di transizione-CpG, piuttosto che ricchi di CpG isole, sono suscettibili di servire da posizioni di perno-metilazione che riflettono i modelli di metilazione concorrenti associati a H. pylori
infezione e l'evoluzione del cancro.
Questo studio indagato i-CpG transitorie schemi di metilazione dei geni CpG-isola e dei geni specifici di stomaco privi CpG-isole in H. pylori
-infected mucosa gastrica e tumori gastrici. La metilazione variabile di siti di transizione-CpG era semi-quantitativo stimato in condizioni stringenti specifiche di metilazione PCR (MSP) che hanno prodotto chiari bande di DNA [4, 8]. Un aumento o una diminuzione del-CpG transizione metilazione di ogni gene è stato determinato sulla base di una metilazione intermedio nella H. pylori
-negativa mucosa gastrica.
Metodi
Collezione di campioni di tessuto
non-cancerosa campioni di tessuto sono stati prelevati dai pazienti ambulatoriali consecutivi sottoposti endoscopia gastrica da aprile 2008 ad ottobre 2009 presso l'ospedale di St. Paul, l'Università cattolica di Corea. Durante esame endoscopico, due campioni di tessuto adiacenti sono stati ottenuti dalla porzione dell'antro dello stomaco e del corpo, rispettivamente. Un campione bioptico è stato fissato in formalina per l'esame istologico e gli altri campioni di biopsia è stato utilizzato per l'estrazione del DNA. Il patologo confermato un contenuto cellula epiteliale gastrica di oltre l'80% di purezza nei tessuti bioptici. H. pylori
infezione è stata esaminata con il metodo d'argento di impregnazione Warthin-stellata. Questo studio ha incluso 50 antro e corpo coppie a H. pylori
casi -negative con un'età media di 53,2, e 50 antro e corpo coppie in H. pylori
casi -positive con un'età media di 55,6. Ci sono stati 25 maschi e 25 femmine nella H. pylori
casi -negative e 26 maschi e 24 femmine nei pylori
casi -positive H.. I tessuti di cancro gastrico sono stati ottenuti dai campioni patologici di 48 22 pazienti maschi e femmine (età media: 63.7), che sono stati sottoposti a resezione chirurgica tra marzo 2005 e dicembre 2008 all'ospedale di St. Paul, l'Università Cattolica di Corea. Lo stadio del tumore clinicopathologic è stato determinato in base ai criteri [19] Tumor-Node-Metastasi (TNM). Tutti i soggetti, purché il loro consenso informato scritto e questo studio è stato approvato dal comitato etico.
Preparazione dei tessuti e modifica bisolfito di DNA
I campioni freschi bioptici sono stati utilizzati per l'analisi fattibile semi-quantitativa MSP, perché fissate in formalina DNA dei tessuti tendono ad essere poco amplificato dopo la modifica bisolfito [8]. Per l'analisi dei microsatelliti, il DNA è stato estratto dai tessuti tumorali inclusi in paraffina fissati in formalina come precedentemente descritto [20, 21]. I campioni tumorali sono stati microdissezionate utilizzando un bisturi chirurgico allo stereomicroscopio. Tutti i tessuti tumorali microdissezione conteneva un contenuto cellula tumorale superiore al 80%. Utilizzando tampone di estrazione del DNA (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinasi K), i campioni di biopsia e tessuti microdissezione sono stati digeriti a 37 ° C per 24 ore. Circa 1.000 le cellule sono state incubate con 20 ml di tampone di estrazione del DNA dopo che un kit di isolamento del DNA (A1120, Promega, Madison, WI, USA) è stato utilizzato per estrarre il DNA genomico in base alle istruzioni del produttore.
DNA del tessuto è stato modificato con bisolfito di sodio, come descritto altrove [8, 11-13]. Brevemente, 1 ug di DNA genomico è stato trattato con 10 ml di 3 M NaOH per 15 minuti a 37 ° C. Poi il DNA denaturato è stato miscelato con 1,04 ml di 2,3 M sodio bisolfito e 60 ml di 10 mM idrochinone e questo è stato riscaldato a 50 ° C per 12 ore. Il bisolfito trattati DNA, che è stato purificato mediante guidata DNA resina purificazione (Promega, Madison, WI, USA), è stato desulfonated con 3 M NaOH e precipitato con etanolo, e poi è stato sciolto in 35 ml di 5 mM tampone Tris (pH 8,0) .
radioisotopi-etichettatura semiquantitativa analisi della metilazione
analisi comparata del microarray e SAGE (analisi seriale dell'espressione genica) i dati ha scoperto che il numero di trascrizioni conteggiati nei dati SAGE rappresenta esattamente una grande differenza nella attività dei geni tra i geni specifici di stomaco e geni housekeeping [4]. I siti di transizione-CpG dei geni specifici dello stomaco (PGA5 Comprare e vendere PGC) [22], i geni mucosa-guarigione (TFF1
e TFF2
) [23], il cancro-correlata geni (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A
e RUNX3
) [15, 24-27], ed i geni non-gastrico (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN
e KRT6A
) [28-32] sono stati selezionati (Tabella 1). I siti MSP, le sequenze e le condizioni sono mostrati in File complementare 1. A basso contenuto di GC e una sequenza ripetitiva nel sito-CpG transitorio di metilazione-variabile spesso mostrato bande deboli MSP o sbavature a causa della riduzione della complessità delle sequenze nucleotidiche seguente bisolfito trattamento [4, 8, 33]. Per aumentare la specificità dell'amplificazione transitorio-CpG, ogni set di primer MSP è stato progettato per contenere 3-5 siti CpG e per comprendere una piccola dimensione amplicone, e la reazione MSP è stato condotto in condizioni stringenti con l'utilizzo dTTP radioisotopo come descritto in precedenza [4, 8, 11, 12]. In breve, 10 ml di una miscela di PCR che conteneva 1 ml bisolfito DNA modificato, 1 pCi di α-
32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 micron dATP, dCTP e dGTP, 25 mM dTTP, 1 pmol di primer, 0,1% di Tween 20 e 0.3 unità di Taq polimerasi
è stato amplificato da 32 cicli di PCR sotto hot-start condizioni di PCR. I risultati rappresentativi di metilazione sono mostrati in figura 1 1A.Table Il retroelemento più vicina e la trascrizione dei 14 geni selezionati con e senza isole CpG
Gene
CpG isole
vicina retroelemento
No. di espresso trascrizioni nello stomaco
| Nome della famiglia di Distanza sito di inizio della trascrizione | CDH1 Sì Alu 0,3 kb 19 ARRDC4 Sì Alu 1.7 kb 7 PPARG Si Alu 2.3 kb 3 CDKN2A Sì LTR 2.4 kb 1 TRAPPC2L Sì Alu 3,8 kb 14 DUSP6 Sì Alu 6.6 kb 8 MLH1 Sì Alu 6.6 kb 0 RUNX3 Sì LTR 8.3 kb 0 PGA5 No Alu 1.2 Kb 734 PGC No Alu 1,6 kb 33 TFF1 No Alu 0,5 kb 11 TFF2 No L1 2.7 kb 632 MSLN No Alu 1.4 kb 50 KRT6A No Alu 4.2 kb 1 le informazioni relative isole CpG, retroelementi e il numero di trascritti espressi in lo stomaco è stato ottenuto da dati pubblicati in precedenza [4]. Figura 1 l'analisi semiquantitativa metilazione (a) e la clonazione e sequenziamento (B) nei siti di transizione-CpG. La metilazione dei siti CpG-transitorio è stata valutata mediante un'analisi metilazione semi-quantitativa (A) e si è verificata con la clonazione e il sequenziamento del primer comune (B). (A) Un totale di 14 siti di transizione-CpG sono stati esaminati nel H. pylori -negativa e H. pylori -positivo normale mucosa gastrica e cancro lesione di pazienti affetti da cancro gastrico. La densità di metilazione è stata calcolata secondo la proporzione dell'intensità metilazione (M) banda contro il totale unmethylation (U) e intensità della banda metilazione. La densità di metilazione di ciascun sito CpG è stato classificato in 5 livelli con il 20% di incremento -methylation. Lo stato di metilazione di ciascun gene è stato classificato come undermethylation (comprensione) o overmethylation (sovra) sulla base di un livello di metilazione intermedio (inter) del H. pylori -negativa normale mucosa gastrica. (B) I risultati rappresentativi della clonazione e il sequenziamento dei comuni PCR. I siti di transizione-CpG del CDH1 , CDKN2A RUNX3 geni e sono stati analizzati mediante la clonazione e il sequenziamento del prodotto comune della PCR. Il DNA genomico rappresentati nella figura 1A sono stati usati per confrontare i risultati MSP con i risultati di sequenziamento. I cerchi aperti e chiusi indicano residui di citosina non metilato e denaturato, rispettivamente. Le scatole rettangolari indicano i siti di primer MSP . Valutazione semiquantitativa di transizione-CpG metilazione variazione La condizione PCR di ogni set di primer MSP è stato convalidato da tracciare la curva standard secondo le varie miscele di intensità della banda dai prodotti MSP con DNA universale metilato e non metilato di controllo [11, 18]. Il DNA genomico trattato con DNA methylase (CpGenome universale metilato del DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) e amplificato da un primer universale (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') sono stati utilizzati per la metilato universale e DNA di controllo non metilato, rispettivamente. Sulla base della curva standard, la densità metilazione del sito transitorio-CpG è stato calcolato utilizzando la seguente formula: metilazione percentuale (%) = (intensità metilazione /(metilazione + intensità unmethylation)) x 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Per convalidare la riproducibilità della densità metilazione variabile utilizzando un'analisi semiquantitativa, la classificazione 5 livelli con 20% di incremento -methylation e la classificazione 10 livelli con 10% di incremento -methylation stati confrontati nei campioni di tessuto accoppiati. L'analisi comparativa dei campioni appaiati è stato condotto utilizzando il DNA duplicati dei 40 tessuti e 48 paia di tessuti 1-cm-adiacenti oltre a 100 paia di tessuti antro e corpo che sono stati ottenuti dal 50 H. pylori - i tessuti dello stomaco negativi e il 50 H. pylori tessuti dello stomaco -positive (figura 2). Figura 2 Analisi di metilazione variabile nei siti di transizione-CpG. (A e B) la riproducibilità della classificazione a 5 livelli con il 20% -methylation incremento (A) e 10 a livello di classificazione con incremento -methylation 10% (B) sono stati verificati dalla parte dei campioni di tessuto appaiati mostrano differenze di il livello di metilazione. I DNA duplicati dello stesso tessuto (bar chiuso), un paio di tessuti 1-cm-adiacenti (barre grigie) e un paio di antro e tessuti del corpo (bar aperti) sono stati confrontati. (C e D) Analisi di livello intermedio metilazione. La frequenza di casi undermethylated e overmethylated è stato stimato sulla base di un livello intermedio si estende su due livelli (20% di metilazione) (C) e di un livello (10% metilazione) (D) della classificazione 10-livello comune in H. pylori - mucosa gastrica negativo. il tasso overmethylation di ogni sito di transizione-CpG nel H. pylori mucosa gastrica -positivo e -negativa è stato calcolato la proporzione relativa dei casi overmethylated alla somma totale del sovra e sotto casi -methylated. Il H. pylori tasso overmethylation -associated è stato calcolato utilizzando il pylori rapporto di -positivo-to-negativo H. di ciascuna aliquota transitoria-CpG-overmethylation. Questo è stato utilizzato per valutare la relazione tra la metilazione di siti transitorie-CpG e la distanza tra il sito di inizio della trascrizione e la retroelemento vicina (Figura 3). Figura 3 H. pylori metilazione indotta delle CpG-isola-contenenti e -lacking geni a seconda della distanza ai retroelementi più vicini e l'attività di trascrizione. Un totale di 14 siti di transizione-CpG sono stati raggruppati in otto geni CpG-island (CDH1 , ARRDC4 , PPARG , CDKN2A , TRAPPC2L , DUSP6 , MLH1 e RUNX3 ) e sei geni mancanti CpG-isole (PGA5 , PGC, TFF1 , TFF2 , MSLN e KRT6A ). La distanza gene-retroelemento è stato stimato tra i siti di inizio della trascrizione e la più vicina retroelementi Alu, L1 o LTR. Il H. pylori tasso di metilazione indotta è stata rappresentata dal H. pylori -positivo-to-negativo rapporto tra il tasso di overmethylation. Il tasso di overmethylation è stato calcolato in base alla proporzione relativa dei casi overmethylated alla somma totale dei casi sovra e sotto-denaturato. L'attività trascrizionale di ogni gene è stato mostrato con il numero di trascritti espressi [4]. Clonazione e il sequenziamento del sito di metilazione-variabile I MSP risultati dei siti di transizione-CpG sono stati riconfermati con la clonazione e il sequenziamento dei comuni PCR set di primer che comprende entrambi i siti non metilato e metilati CpG (Figura 1B) [4, 11, 12]. I prodotti di PCR dei set di primer comuni sono stati clonati nel T & Un vettore di clonazione (Real Biotech, Taipei, Taiwan). Il sequenziamento del DNA è stata eseguita per 10 cloni dei vettori comuni PCR utilizzando il kit di terminazione BigDye (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) e un sequenziatore di DNA ABI automatizzato (PE Biosystmes, Warrington, UK). Poiché i set di primer comuni che coprono le regioni CpG-povere hanno prodotto vari gradi di metilazione in base alle condizioni di PCR, abbiamo regolato la condizione PCR del primer comune definito per ottenere la densità di metilazione che era simile in entrambi i test MSP semi-quantitativa e la i risultati di sequenziamento dei 10 cloni comuni-PCR. analisi di alleli microsatellite Per l'analisi LOH PCR-based, per un totale di 40 marcatori microsatelliti su otto cromosomi cancro-associata (3p, 4p, 5q, 8p, 9P , 13q, 17p e 18q) e le linee guida per segnando lo status di LOH e MSI sono stati utilizzati come descritto altrove [20, 21]. Il profilo allelico delle 40 sequenze microsatellite esaminati in ciascun caso è stato inizialmente classificato in MSI basato sulla presenza di nuovi alleli nel marcatore omozigote e la perdita allelica unilaterale del marcatore eterozigoti. Secondo il numero di cromosomi LOH-positivo, il livello di LOH stato ottenuto come basso livello (due o tre perdite cromosomiche, LOH-L) e ad alto livello (quattro o più perdite cromosomiche, LOH-H) LOH. Uno o nessuna perdita cromosomiche sono stati classificati nel livello basale (LOH-B) per il tumore diffuso del tipo e nel livello basso per tipo intestinale e misto rispettivamente, a seconda della loro corrispondente sottotipo istologico. Analisi statistica test esatto di Fisher è stato utilizzato per confrontare le modifiche sovra e sotto-metilazione tra H. pylori mucosa gastrica -negativa o -positivo e tumori gastrici, con il significato attribuito a valori inferiori P valori inferiori a 0,01 . test t di Student è stato utilizzato per confrontare le differenze di metilazione tra i tessuti non tumorali e tumorali gastriche, con il significato attribuito a valori inferiori P valori inferiori a 0.05. valutazione statistica è stata effettuata utilizzando il pacchetto software statistico SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Risultati metilazione-variazione di tessuti non tumorali Un totale di 14 siti di transizione-CpG sono stati scelti da otto geni CpG-island (CDH1 , ARRDC4 , PPARG , CDKN2A , TRAPPC2L , DUSP6 , MLH1 e RUNX3 ) e sei CpG geni (PGA5 , PGC, TFF1 , TFF2 , MSLN e KRT6A ) (Tabella 1) -island-carente. La riproducibilità di transizione-CpG site amplificato da ciascun primer MSP è stata valutata con il DNA duplicati dello stesso tessuto, una coppia di tessuti 1-cm-adiacenti ed una coppia di tessuti antro e corpo (Figura 2A e 2B). Il 92% dei 40 DNA duplicati, il 73% delle 48 coppie di tessuto 1-cm-adiacenti, e il 58% dei 100 antro e corpo coppie sono stati segnati come gli stessi livelli di metilazione nella classificazione a 5 livelli. Gli stessi-segnato casi di esperimenti duplicati erano circa il 25% in più di frequente nella classificazione a 5 livelli che nella classificazione di 10 livelli. Un livello intermedio di metilazione di transizione-CpG variabile è stato analizzato utilizzando 1.400 MSP ampliconi del 14 siti di transizione-CpG ottenuti da 100 H. pylori campioni di stomaco -negative (Figura 2C e 2D). Nella classificazione 10-livello, la frazione di un solo livello di metilazione comune (38%) era così bassa che un livello intermedio è stato determinato sulla base di due livelli comuni. 937 (67%) dei 1.400 ampliconi MSP sono stati classificati in un livello intermedio nei 100 tessuti. livelli di metilazione intermedi di otto margini CpG isola tendevano ad essere inferiori a quelli di sei CpG-isola-privo siti (tabella 2). Nel complesso, grandi frazioni di singoli tessuti dello stomaco (67%) e coppie di tessuto 1-cm-adiacenti (73%) hanno mostrato che i siti transitorie-CpG sono stati metilati in una gamma di densità simili variabile tra circa il 20%. Pertanto, un livello intermedio si estende su due livelli (20%) metilazione di classificazione 10-livello è stato utilizzato per determinare la sovra o sotto-metilato stato dei siti di transizione-CpG nel gastrica mucosa.Table 2 La frequenza di comprensione e sovra casi denaturato, come determinato sulla base di livelli intermedi di metilazione comuni nel H. pylori mucosa gastrica -negativa (n = 100) del gene Intermedio metilazione densità No. di imprese casi denaturato No. dei casi di metilazione intermedi No. dei casi denaturato sovra CpG-isola contenente geni CDH1 0 - 20% 0 79 21 ARRDC4 0 - 20% 0 80 20 PPARG 0 - 20% 0 60 40 CDKN2A 0 - 20% 0 54 46 TRAPPC2L 40 - 60% 13 81 6 DUSP6 20 - 40% 26 62 12 MLH1 20 - 40% 20 61 19 RUNX3 30 - 50% 5 53 42 CpG-isola manca geni PGA5 40 - 60% 10 78 12 PGC 40 - 60% 29 67 4 TFF1 20 - 40% 11 52 37 TFF2 30 - 50% 36 60 4 MSLN 60 - 80% 0 88 12 KRT6A 60 - 80% 17 65 18 relazione tra H. pylori - overmethylation associato sia dell'attività retroelementi o trascrizione le frequenze dei casi sovra e sotto-metilati sono stati contati separatamente per stimare alterazioni della metilazione variabili dei siti transitorio-CpG (Tabella 3). Sulla analisi dei casi overmethylated, tutti i margini CpG isola erano significativamente overmethylated in H. pylori -infected mucosa gastrica e nessuno degli CpG-isola-privo siti mostrato una differenza significativa per la frequenza dei casi overmethylated . Sulla analisi dei casi undermethylated, la frequenza del TFF1 gene undermethylated era significativamente basso in H. pylori -positive mucosa gastrica (P = 0,003). I dati di metilazione di midollo osseo è stato citato da un precedente studio utilizzando lo stesso protocollo MSP radioisotopo-etichettatura [4]. Nel midollo osseo, il PGC, TFF1 , MSLN e RUNX3 geni erano completamente denaturato, mentre la maggior parte dei geni CpG isola erano completamente unmethylated.Table 3 Confronto della frequenza di sovra e geni undermethylated rilevati nei tessuti gastrici non-cancerose e cancerose Gene il tessuto noncancerous microsatelliti genotipo dei tumori gastrici (%) del midollo osseo | H. pylori negativo (n = 100) H. pylori positiva (n = 100) LOH-B (n = 13) LOH-L (n = 29) LOH-H (n = 24) MSI (n = 4) (n = 18) (%) frequenza Overmethylation CDH1 21 77 * 0 (0) * Pagina 7 (24) Pagina 3 (13) 0 (0) 0 (0) ARRDC4 20 62 * Pagina 3 (23) Pagina 8 (28) 1 (4) * 1 (25 ) 0 (0) PPARG 40 82 * 5 (38) Pagina 7 (24) 6 (25) 1 ( 25) 0 (0) CDKN2A 46 90 * 9 (69) 16 (55) 9 (38) Pagina 2 (50) Pagina 4 (22) TRAPPC2L 6 21 * 6 (46) * Pagina 8 (28) * 1 (4) 1 (25) 0 (0) DUSP6 12 36 * Pagina 3 (23) Pagina 3 (10) 1 (4) Pagina 2 (50) 0 (0) MLH1 19 37 * Pagina 4 (31) 17 (59) * 11 ( 46) Pagina 3 (75) 0 (0) RUNX3 42 85 * 10 (77) 26 (90) * 19 (79) * Pagina 4 (100) 18 (100) PGA5 12 13 5 (38) Pagina 8 (28) 1 (4) 0 (0) 0 (0) PGC 4 10 4 (31) Pagina 4 (14) 5 (21) 1 (25) 18 (100) TFF1 37 52 5 (38) Pagina 3 (10) * 3 (13) * 0 (0) 18 (100) TFF2 4 3 4 (31) Pagina 4 (14) 1 (4) 0 (0) Pagina 2 (11) MSLN 12 11 Pagina 8 (62) * 16 (55 ) * Pagina 6 (25) 1 (25) 18 (100) KRT6A 18 16 Pagina 4 (31) 16 ( 55) * Pagina 4 (17) Pagina 3 (75) Pagina 3 (17) Undermethylation frequenza CDH1 0 0 0 (0 ) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) ARRDC4 0 0 0 (0 ) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) PPARG 0 0 0 (0 ) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) CDKN2A 0 0 0 (0 ) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) TRAPPC2L 13 11 1 (8 ) Pagina 2 (7) Pagina 7 (29) 1 (25) 16 (89) DUSP6 26 25 Pagina 3 (23 ) 13 (45) 12 (50) Pagina 2 (50) 18 (100) MLH1 20 18 Pagina 7 (54 ) 6 (21) 9 (38) 1 (25) 17 (94) RUNX3 5 1 0 (0 ) 1 (3) Pagina 2 (8) 0 (0) 0 (0) PGA5 10 14 0 (0 ) Pagina 3 (10) 5 (21) 0 (0) 0 (0) PGC 29 18 Pagina 4 (31 ) Pagina 8 (28) 5 (21) Pagina 2 (50) 0 (0) TFF1 11 1 * 7 ( 54) 19 (66) * 17 (71) * Pagina 3 (75) 0 (0) TFF2 36 26 4 (31) 11 (38) Pagina 8 (33) Pagina 3 (75) 13 (72) MSLN 0 0 0 (0) 1 (3) 1 (4) Pagina 2 (50) 0 (0) KRT6A 17 16 3 (23) Pagina 3 (10) Pagina 3 (13) 1 (25) 5 (28) I tumori gastrici sono stati classificati in base a livello di LOH (LOH-B) , a basso livello LOH (LOH-L), di alto livello LOH (LOH-H) e instabilità dei microsatelliti (MSI). I dettagli sono descritti nella sezione materiali e metodi. * H. pylori mucosa gastrica e gastrica tumori -positive sono stati confrontati con H. pylori -negativa mucosa gastrica. Differenze significative sono state determinate utilizzando il test esatto di Fisher (P < 0,01). Il rapporto tra la metilazione di transizione-CPG e la distanza dal più vicino retroelemento è stata valutata utilizzando il H. pylori tasso overmethylation -associated (Figura 3). Nei geni CpG-isola, il H. pylori tasso overmethylation -associated è maggiore, come la distanza del retroelemento più vicino è diventato più breve. CPG-isola-carente geni che non ha mostrato differenze di metilazione significativa tra il H. pylori mucosa -positivo e -negativa stati metilato indipendentemente dalla distanza della retroelemento più vicino. La metilazione dei siti di transizione-CpG è stato confrontato tra lo stomaco e il midollo osseo in termini di attività di trascrizione (Tabella 1 e Figura 4). Il gruppo gene CpG-isola che era debolmente attiva nello stomaco era più metilato nel H. pylori tessuti -negative e -positive rispetto che nel midollo osseo. Del-isola-carente CpG TFF2 PGA5 geni e che sono stati più altamente espresso nello stomaco, il livello di metilazione media del TFF2 gene è stato inferiore nel midollo osseo (1,9) rispetto al H. pylori -negativa (2,6, P = 0.015 ) e la mucosa -positivo (2,7, P = 0,015 ). Il livello di metilazione media del PGA5 gene era simile nel midollo osseo (3.1) e H. pylori -negativa (3.0) e -positivo mucose (3.0). Il PGC e TFF1 geni specifici dello stomaco, che erano debolmente attiva nella mucosa gastrica se confrontato con i geni specifici di stomaco due maestri, erano densamente metilato nel midollo osseo (media livello di metilazione, 4.3 e 4.8). Figura 4 La metilazione nel midollo osseo e dei tessuti non tumorali e tumorali gastriche. Il livello medio di metilazione nel midollo osseo (●), H. pylori -negativa mucosa gastrica (■), H. pylori -positivo mucosa gastrica (♦) ed i casi a livello della linea di base LOH (
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