V overmethylated gény Helicobacter pylori infikovaných žalúdočnej sliznice sú demetylovaný v žalúdku cancers

sa overmethylated gény Helicobacter pylori
-infected žalúdočnú sliznicu sú demetylovaný v žalúdočných rakovín
abstraktné
pozadia
prechodného-CPG miest medzi slabo metylovaných génov a husto methylata retroelements sú overmethylated v žalúdočnej sliznici infikovaný Helicobacter pylori
(H. pylori
) a sú undermethylated v žalúdočných nádorov v závislosti na úrovni straty heterozygotnosti (LOH) udalosti. Táto štúdia definovať prechodné-CPG metylácie vzory CPG ostrov s obsahom a -lacking gény s ohľadom na retroelements.
Metódy
prechodných-CPG miest ôsmich CPG ostrova obsahujúcich génov a šesť CPG ostrova -lacking gény boli semikvantitatívne skúmané prevedením rádioizotopové značenie metylácie-špecifické PCR za prísnych podmienok. Hladina LOH v karcinómov žalúdka bola odhadnutá s použitím 40 mikrosatelitních markerov na osem s rakovinou spojené chromozómov. Každý gén bol hodnotený ako overmethylated alebo undermethylated založený na strednej úrovni prechodného-CPG metylácie obyčajný v H. pylori
-negativní žalúdočnej sliznice.
Výsledky
ôsmich CPG ostrova génov skúmaných boli overmethylated v závislosti na blízkosť k najbližšiemu retroelement v H. pylori
-pozitívne žalúdočnú sliznicu. Šesť CPG-ostrov-nemajú gény boli podobne methyluje v H. pylori
-pozitívne a -vylučující žalúdočnú sliznicu. V karcinómov žalúdka, dlhé prechodné-CPG segmenty CPG ostrova génu vzdialených od retroelements zostal overmethylated, zatiaľ čo overmethylation krátkych prechodných-CPG segmentov blízko retroelements nebol významný. Ako CPG ostrova, obsahujúce a -lacking gény tendenciu byť stále menej methylata v závislosti na veľkosti LOH úrovni závislé
Závery
overmethylated génov pod vplyvom retroelement metylácie v H. pylori
. - infikované žalúdka sú demetylované v karcinómov žalúdku ovplyvnené LOH.
pozadí
myšiam modeli infikovaného Helicobacter pylori (H. pylori
) ukázala, že kmeňových buniek kostnej drene migrovať na žalúdočnú sliznicu a potom sa diferencujú na žalúdočných epiteliálnych buniek [1]. Podľa modelu sebaorganizácie, môže vysoko exprimované gény master tvorí prepis náboj bude koordinovať expresiu mnohých ďalších génov [2]. Kompenzačný mechanizmus dávkovanie navrhuje, že existuje inverzný korelácia medzi domácnosti gény, ktoré obsahujú CPG ostrovy a gény tkanivovo špecifických chýba CPG ostrovov, ktoré obaja zdieľajú obmedzené množstvo jadrových proteínov v jadrovom priestore [3, 4]. Oba modely sebaorganizácie a kompenzačné Dávkovanie zdôrazniť, že epigenetické spoločná regulácia vysoko aktívnych žalúdka špecifické gény a slabo aktívnych génov domácnosti uľahčuje trans-diferenciáciu buniek drene-odvodil v žalúdku.
Osoby nakazené H. pylori
často podstúpiť rad zmien žalúdočnej sliznice, vrátane prekanceróznych a rakovinových lézií [5]. Aj keď CPG ostrov overmethylation, ktoré môže mať za následok inaktiváciu génov s rakovinou asociovaných je bežné v H. pylori
-infected žalúdočnej sliznice, súvislosť medzi overmethylation a vyjadrenie jednotlivých CPG ostrova génu je nejednoznačný [6]. Žalúdočné prekanceróznych a rakovinových lézií preukázali CPG ostrov overmethylation, ako aj celého genómu undermethylation, ale dva rôzne zmeny metylácie nepreukázala spoluprácu pre sekvenčné vývoj predrakovinové a rakoviny [7]. Okrem toho vysoko exprimované žalúdočné špecifické gény hrajú hlavnú úlohu pri spoločnej regulácie početných génov, bolo preukázané niekoľko zmien metylácie v karcinómov žalúdka [4, 8]. Vzhľadom ku koordinácii expresie génu, je nutné vymedziť v prípade, že žalúdok špecifické gény a housekeeping génov prechádzajú súbežných príliš alebo nedostatočne metylácii zmeny.
Retroelements sú samostatne sa replikujúce parazitné DNA, ktoré zaberajú polovicu ľudského genómu [ ,,,0],9]. Genómu hostiteľa potláča nebezpečné mutácie účinok parazitných retroelements prostredníctvom metylácie DNA-závislý mechanizmus [10]. Prechodné oblasti medzi slabo metylovaných génov a husto metylovaných retroelements, ako je CPG-ostrov okraje a počiatku transkripcie chýba CPG ostrovy, sa methyluje v rôznej miere spôsobom, tkanivá typu závislé [4, 11, 12 ]. Metylácia prechodných-CPG miest dynamicky mení v reakcii na trans-diferenciáciu buniek strómy kostnej drene a (LOH) udalosti so stratou heterozygozity v karcinómov žalúdka [12-15]. Ďalšie predchádzajúce štúdie tiež popísané, že "CPG ostrov shore" súvisí s reguláciou bunkovej diferenciácie a karcinogenéze [16]. Je zaujímavé, že veľa prechodné-CPG miest a génových susediace retroelements sú súčasne nadmerne alebo undermethylated v danej tkanive [11, 17], čo naznačuje, že súbežné zmeny metylácie v mnohých génoch sú pod vplyvom retroelement metylácie. Medzitým väčšina CPG ostrovy sú bohaté na methylata alebo nemethylované slabo vo väčšine typov tkanív, a CPG-bohaté miesta nie sú vhodné pre analýzu dynamického metylácie susediace s génmi a kontrolné regióny [12, 13, 15, 18]. Preto prechodné-CPG miest, skôr než CPG bohaté na ostrovy, je pravdepodobné, že bude slúžiť ako pivot-metylácie pozície, ktoré odrážajú súbežných metylačnej vzory spojené s infekciou H. pylori stroje a vývoj rakoviny.
Táto štúdia vyšetrovala prechodná-CPG metylácie vzory na CPG ostrova génu a žalúdka špecifické gény postrádajú CPG ostrovov v H. pylori
-infected žalúdočnej sliznice a žalúdočných rakovín. Premenná metylácie prechodné-CPG miest bola semi-kvantitatívne odhadnúť za prísnych metylácie špecifická PCR (MSP) podmienok, ktoré vytvárajú jasné prúžky DNA [4, 8]. Zvýšenie alebo zníženie v prechodnom-CPG metylácie každého génu bola stanovená na základe sprostredkujúce metylácie v H. pylori
-negativní žalúdočnej sliznice.
Metódy
Odber vzoriek tkaniva
Non-rakovinové vzorky tkaniva boli odobraté z po sebe idúcich ambulantných pacientov, ktorí podstúpili žalúdočné endoskopie od apríla 2008 do októbra 2009 u sv nemocnice katolíckej univerzite v Kórei. Pri endoskopickom vyšetrení, dve susedné vzorky tkaniva boli získané od žalúdka dutine a časť telesa, resp. Jedna vzorka biopsia bola stanovená s formaldehydom na histologické vyšetrenie a ďalších bioptických vzoriek bola použitá na extrakciu DNA. Patológ potvrdil žalúdočný obsah epitelové bunky väčšie ako 80% čistote vo biopsie tkanív. H. pylori
infekcia bola skúmaná pomocou Warthin-Starry metódu strieborná impregnácia. Táto štúdia zahŕňala 50 antra a tela párov v H. pylori
negatívnych prípadov s priemerným vekom 53,2 a 50 antra a tela pary v H. pylori
-pozitívne prípadov s priemerným vekom 55,6. Tam bolo 25 mužov a 25 žien v skupine H. pylori
negatívnych prípadoch a 26 samcov a 24 samíc v H. pylori
-pozitívne prípadov. Žalúdočné rakovinové tkanivá boli získané z patologických jedincov 48 mužských a 22 ženských pacientov (priemerný vek: 63,7), ktorí podstúpili chirurgickú resekciu od marca 2005 do decembra 2008 na sv nemocnice Katolíckej univerzite v Kórei. Patologickým štádiom nádoru bola stanovená v súlade s Tumor-Node-metastázy (TNM) kritérií [19]. Všetky predmety predpokladu, že ich písomný informovaný súhlas a táto štúdia bola schválená inštitucionálnej recenzií nastúpiť.
Prípravy tkanív a hydrogensiričitan modifikácie DNA
čerstvých vzorkách biopsie boli použité pre uskutočniteľný semi-kvantitatívnej analýzy MSP, pretože formalínu fixné tkaniva DNA majú tendenciu byť zle amplifikovanej po bisulfitová modifikácie [8]. Na analýzu mikrosatelitov DNA bola extrahovaná z nádorového tkaniva fixované formalínom a zaliate parafínom, ako bolo opísané skôr [20, 21]. Nádorové vzorky boli microdissected pomocou chirurgického skalpela stereomikroskopom. Všetky microdissected rakovinových tkanív obsahovala obsah rakovinových buniek o viac ako 80%. Za použitia pufra DNA extrakcie (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinázy K), vzorky biopsie a microdissected tkanivá boli štiepené pri teplote 37 ° C počas 24 hodín. Približne 1000 buniek bolo inkubovať s 20 ul extrakčného pufru DNA, po ktorej na izoláciu DNA kit (A1120, Promega, Madison, WI, USA) bol použitý na extrakciu genómovej DNA v súlade s pokynmi výrobcu.
Tissue DNA bola upravená za použitia síranu sodného, ​​ako je popísané na inom mieste [8, 11-13]. Stručne povedané, 1 ug genómovej DNA sa zmieša s 10 ul 3 M roztoku hydroxidu sodného počas 15 minút pri teplote 37 ° C. Potom sa denaturované DNA sa zmieša s 1,04 ml 2,3 M síranu sodného a 60 ul 10 mM hydrochinónu a táto zmes sa zahreje na teplotu 50 ° C počas 12 hodín. Bisulfitová spracuje DNA, ktorá sa čistí pomocou Wizard DNA purifikačný živice (Promega, Madison, WI, USA), bola desulfonuje s 3 M roztokom hydroxidu sodného a vyzráža sa etanolom a potom sa rozpustí v 35 ul 5 mM Tris pufra (pH 8,0) .
rádioizotopové-označenie semikvantitatívnu analýzu metylácie
porovnávacie analýzy mikročipu a SAGE (Serial analýza génovej expresie) dát sa zistilo, že počet prepisov spočítaných v dátach SAGE presne predstavuje veľký rozdiel v aktivite génov medzi žalúdočné špecifické gény a upratovacie gény [4]. Prechodné-CPG miest génov žalúdka špecifické (PGA5 stroje a PGC
) [22], gény sliznice hojí (TFF1 stroje a TFF2
) [23], rakovina súvisiace gény (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A stroje a RUNX3
) [15, 24-27] a non-žalúdočné génov (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN stroje a KRT6A
) [28 až 32] boli vybrané (tabuľka 1). MSP miesta, sekvencie, a podmienky sú uvedené v ďalšej súbor 1. Nízky obsah GC a opakujúce sa sekvencie v prechodnom-CPG metylácie mieste premenné často vykazovali slabé alebo rozmazávanie MSP pásma vzhľadom k zníženej zložitosti nukleotidových sekvencií nasledujúcom bisulfitového liečba [4, 8, 33]. Za účelom zvýšenia špecifickosti prechodného-CPG amplifikácie, každý primer set MSP bol navrhnutý tak, aby obsahoval 3-5 CPG miest, a tak, že zahŕňa malú veľkosť amplikónu, a MSP reakcia bola vykonávaná za prísnych podmienok s použitím dTTP-rádioizotopu, ako bolo opísané skôr [4, 8, 11, 12]. V stručnosti, 10 ul zmesi PCR, ktorá obsahovala 1 ul dvojsiričitanu modifikovanú DNA, 1 UCI a- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 uM dATP, dCTP a dGTP, 25 uM dTTP, 1 pmol primérov, 0,1% Tween 20 a 0,3 jednotky Taq polymerázy
bola amplifikovaná 32 cyklov PCR za hot-štart PCR podmienok. Reprezentatívne výsledky metylácie sú uvedené na obrázku 1 1A.Table Najbližšie retroelement a transkripcie z 14 vybraných génov s a bez CPG ostrovov
Gene

CPG ostrovy
Najbližšie retroelement
No. z vyjadril prepisy v žalúdku

Fotogaléria Meno rodiny
Vzdialenosť k startovnímu miestu transkripcie

CDH1
Áno
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Áno
Alu
1,7kilobajt
7
PPARG
Áno
Alu
2,3kilobajt Sims 3
CDKN2A
Áno
LTR
2,4 kb
1
TRAPPC2L

Áno
Alu
3,8 kB
14
DUSP6
Áno
Alu
6,6 kb
8
MLH1

Áno
Alu
6,6 kb
0
RUNX3
Áno
LTR
8,3 kb
0
PGA5
Žiadne
Alu
1,2 kb
734
PGC
Nie
Alu
1,6 kB
33
TFF1
Nie
Alu
0,5 kb
11
TFF2
Nie
L1
2,7 kb
632
MSLN
No
Alu
1,4 kb
50
KRT6A
Nie
Alu
4,2 kB
1
informácie týkajúce CPG ostrovov, retroelements a počet vyjadrených v prepisov žalúdok bol získaný z predtým publikovaných údajov [4].
Obrázok 1 semi-kvantitatívnu analýzu metylácie (a) a klonovanie a sekvencovania (B) v miestach prechodného-CPG. Metylácia prechodné-CPG miest bol hodnotený prevedením semikvantitatívnu analýzu metylácie (A) a bolo overené pomocou klonovania a sekvenovania spoločného primeru (B). (A) Celkovo bolo vyšetrených 14 prechodné-CPG miest v H. pylori
-vylučující a H. pylori
-pozitívne normálne žalúdočnej sliznice a rakoviny lézie pacientov s rakovinou žalúdka. Hustota metylácie bola vypočítaná na základe pomeru intenzity metylácie (M) pásma vo vzťahu k celkovému unmethylation (U) a intenzite metylácie pásu. Hustota metylácie CPG každom mieste bol klasifikovaný do 5 úrovní s 20% -methylation prírastku. Metylačného statusu každého génu bol zaradený do kategórie undermethylation (pod-) alebo overmethylation (nadmerne) na strednej úrovni metylácie (inter-) v H. pylori
-vylučující normálne žalúdočnú sliznicu. (B) Reprezentatívne výsledky klonovania a sekvenovania spoločného PCR. Prechodné-CPG miesta na CDH1
CDKN2A stroje a RUNX3
génov boli analyzované pomocou klonovania a sekvenovania spoločný produkt PCR. Genómovej DNA je znázornené na obrázku 1A boli použité pre porovnanie výsledkov MSP s výsledkami sekvencovania. Otvorené aj uzavreté kruhy znamenajú nemetylované a denaturovaný zvyšky cytozín resp. Obdĺžnikové boxy označujú primeru lokalít MSP.
Semikvantitatívny vyhodnotení prechodného-CPG metylácie variácie
PCR stav každého súboru primérov MSP boli potvrdené vynesením štandardnej krivky podľa rôznych zmesí intenzity pásme od MSP produkty s univerzálny methylata a nemethylované kontrolné DNA [11, 18]. Genómovej DNA liečení DNA metyláza (CpGenome Universal methylata DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) a zosilnený pomocou univerzálneho priméru (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') boli použité pre univerzálne methylata a nemethylovaný kontrolné DNA, resp. Na štandardnej krivky založené hustota metylácie prechodného-CPG mieste sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca: metylácie podiel (%) = (intenzita metylácie /(metylácie + intenzitu unmethylation)) x 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Na overenie reprodukovateľnosti premenné hustoty metylácie za použitia semikvantitatívnu analýzu, klasifikáciu 5 na úrovni 20% -methylation prírastok a klasifikácie 10 v úrovni 10% -methylation prírastok boli porovnané v párových vzorkách tkaniva. Porovnávacia analýza párovaných vzoriek bolo vykonané s použitím duplicitné DNA z tkaniva 40 a 48 párov 1-cm-okolité tkanivá vedľa 100 párov antra a telesných tkanív, ktoré boli získané z 50 H. pylori
- negatívne žalúdočné tkaniva a 50 H. pylori
-pozitívnych žalúdočné tkaniva (obrázok 2). Obrázok 2 Analýza variabilný metylácie v miestach prechodného-CPG. (A a B) reprodukovateľnosti klasifikácii 5-úrovni s 20% -methylation prírastok (a) a 10-level klasifikácie s 10% -methylation prírastok (B) bola overená podielu párových vzoriek tkaniva, ktoré nevykazovali žiadne rozdiely v úroveň metylácie. Boli porovnané duplikované DNA z rovnakej tkaniva (plné stĺpce), dvojicu 1 cm okolitého tkaniva (šedé pruhy) a pár dutine a telesných tkanivách (otvorené bary). (C a D) Analýza medziľahlé úrovne metylácie. Frekvencia undermethylated a overmethylated prípadoch bola odhadnutá na základe strednej úrovni trvajúci dve úrovne (20% metylácie) (C) a jeden stupeň (10% metylácie) (d) klasifikácia 10 na úrovni bežnej v H. pylori
- negatívny žalúdočnej sliznice.
overmethylation mieru každej prechodné-CPG lokalitu v H. pylori
-pozitívne a -vylučující žalúdočnej sliznice bola vypočítaná relatívny podiel overmethylated prípadov k celkovému súčtu prepätiu a pod -methylated prípady. H. pylori
-associated rýchlosť overmethylation bola vypočítaná za použitia H. pylori
-pozitívne-k-negatívnej pomer každej rýchlosti prechodné-CPG-overmethylation. Ten bol použitý pre vyhodnotenie vzťahu medzi metylácie prechodných-CPG miest a vzdialenosť medzi počiatku transkripcie a najbližší retroelement (obrázok 3). Obrázok 3 H. pylori
indukované metylácie CPG ostrov obsahujúcich a -lacking génov v závislosti od vzdialenosti najbližšej retroelements a transkripčný aktivitu. Celkom 14 Prechodné-CPG miest boli zoskupené do ôsmich CPG ostrova génu (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
a RUNX3
) a šesť gény postrádajú CPG ostrovy (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN stroje a KRT6A
). Gen-retroelement vzdialenosť bola odhadnutá medzi transkripčný štartovných miest a najbližšom okolí retroelements Alu, L1 alebo LTR. H. pylori
indukovaná rýchlosť metylácie bola zastúpená H. pylori
-pozitívne-to-negatívny pomer rýchlosti overmethylation. Miera overmethylation bola vypočítaná podľa relatívneho podielu overmethylated prípadov k celkovému súčtu príliš alebo nedostatočne metylovaných prípadoch. Transkripční aktivitu každého génu bol zobrazený s počtom exprimovaných transkriptov [4].
Klonovanie a sekvenovanie metylácie premenné mieste
MSP Výsledky prechodných-CPG miest boli opätovne potvrdila s klonovania a sekvenovania spoločné PCR primérov zahŕňajúca ako nemethylované a methylata CPG miest (Obrázok 1B) [4, 11, 12]. PCR produkty spoločné sady primérov boli klonované do T & klonovacieho vektora (Real Biotech, Taipei, Taiwan). Sekvenovania DNA bolo vykonané počas 10 klonov spoločných PCR vektorov s použitím BigDye Ukončovacie súprava (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) a ABI automatizovaného DNA sekvenátoru (PE Biosystmes, Warrington, Veľká Británia). Vzhľadom na to, že spoločné sady primérov, ktoré zachytávajú CPG-chudobným regiónom vyrába rôzne stupne metylácie podľa stavu PCR sme upravili stav PCR spoločného priméru nastavená pre získanie hustoty metylácie, ktorý bol podobný ako v semi-kvantitatívne MSP skúškou au výsledky sekvenovania 10 common-PCR klonov.
Analýza mikrosatelitov alel
Pre analýzu PCR-založené LOH, celkom 40 mikrosatelitních markerov k ôsmim rakovinou spojené chromozómov (3p, 4p, 5q, 8p, 9P , 13q, 17p a 18q) a pokyny na vyhodnocovanie stavu LOH a MSI boli použité ako je opísané inde [20, 21]. Alelické profil 40 mikrosatelitních sekvencií skúmala v každom prípade sa najprv rozdelené do MSI na základe prítomnosti nových alel v homozygotnou markéra a jednostranné straty alel v heterozygotná markeru. V závislosti na počte Loh-pozitívnych chromozómov, úroveň LOH bola hodnotená ako nízke úrovne (dva alebo tri chromozomálne strát, LOH-L) a na vysokej úrovni (štyri alebo viac chromozomálne straty, LOH-H) LOH. Jeden alebo žiadne chromozomálne straty boli klasifikované do základnej úrovne (LOH-B) pre rakovinu difúzny typu a do nízkej úrovni pre črevnú a zmiešaného typu, v danom poradí, v závislosti na ich zodpovedajúce histologického podtypu.
Štatistická analýza
Fisherov presný test bol použitý pre porovnanie príliš alebo nedostatočne metylácie zmeny medzi H. pylori
-vylučující alebo -pozitívne žalúdočnej sliznice a žalúdočných rakovín, s významom priradené k hodnotám pod P
váži menej ako 0,01 , t
testu študenta bola použitá pre porovnanie metylácie rozdiely medzi žalúdočných noncancerous a rakovinové tkanivá, s významom priradené k hodnotám pod P
hodnoty menšie ako 0,05. Štatistické hodnotenie bolo vykonané pomocou štatistického softvérového balíka SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Výsledky
metylácie-variability v noncancerous tkanivách
bolo vybraných celkom 14 Prechodné-CPG miest z ôsmich CPG ostrova génu (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1 stroje a RUNX3
) a šesť CPG -Island-nemajú gény (PGA5
PGC
TFF1
TFF2
MSLN stroje a KRT6A
) (tabuľka 1). Reprodukovateľnosť prechodného-CPG mieste zosilneného každú sadou primerov MSP bola vyhodnotená duplikovaných DNA z rovnakej tkaniva, pár 1-cm-okolité tkanivá a dvojicu antra a telesných tkanív (Obrázok 2A a 2B). 92% z 40 duplicitné DNA, 73% z 48 párov 1 cm priľahlých tkanív, a 58% z 100 antra a tela pary boli hodnotené ako rovnakých úrovniach metylácie v klasifikácii 5 úrovne. Rovnaké-zaznamenal prípady duplikovaných experimentov boli približne o 25% častejšie v klasifikácii 5-úrovni ako v klasifikácii do 10 úrovne.
Stredného stupňa variabilný prechodného-CPG metylácie bola analyzovaná pomocou 1400 MSP amplikóny z celkového počtu 14 prechodné-CPG lokality získané od 100 H. pylori
negatívnych vzoriek žalúdka (Obrázok 2C a 2D). V klasifikácii na 10. úrovni, podiel jediného spoločného úroveň metylácie (38%) bola tak nízka, že medzistupňom bola stanovená na základe dvoch spoločných úrovniach. 937 (67%) z 1400 MSP amplikóny boli rozdelené do medziľahlej úrovni v 100 tkanív. Strednej úrovne metylácie ôsmich CPG ostrova marža tendenciu byť nižší ako šesť CPG-ostrovných-chýba miest (tabuľka 2). Celkovo veľká frakcia jednotlivých žalúdočné tkaniva (67%) a dvojica 1-cm-susedných tkanív (73%) sa ukázalo, že prechodné-CPG methylata miesta boli v rozmedzí podobných hustôt sa pohybuje v rozmedzí asi 20%. Z tohto dôvodu, medzistupňom klenout dve úrovne (20% metylácie) klasifikácie 10 úrovni boli použitá k nadmernej alebo nedostatočnej-methylata stave prechodných-CPG miest v žalúdku mucosa.Table 2 Početnosť nedostatočne a nadmerné denaturovaný prípady sú stanovené na základe strednej úrovne metylácie bežné v H. pylori
-vylučující žalúdočnej sliznice (n = 100)
názov Gene

Intermediate metylácie hustota
No. z podnikov metylovaných prípadov
No. medziľahlých prípadov metylácie
No. nadmerného metylovaných prípadov
CPG ostrov, ktorý obsahuje gény
CDH1
0-20%
0
79
21
ARRDC4

0-20%
0
80
20
PPARG
0-20%
0
60
40
CDKN2A

0-20%
0
54
46
TRAPPC2L
40-60%
13
81
6
DUSP6
20-40%
26
62
12
MLH1
20-40%
20
61
19
RUNX3
30 - 50%
5
53
42
CPG ostrov chýba gény
PGA5
40 - 60%
10
78
12
PGC
40-60%
29
67
4
TFF1
20-40%
11
52
37
TFF2
30-50%
36
60
4
MSLN
60-80% NETHRY.cz 0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
Vzťah medzi H. pylori
- spojené overmethylation buď retroelements alebo transkripčný aktivita
kmitočty príliš alebo nedostatočne metylovaných prípadoch boli oddelene počítané pre odhad zmeny v premennej metylácii miest prechodného-CPG (tabuľka 3). Na základe analýzy overmethylated prípadoch možno všetky CPG ostrov marža sa významne overmethylated v H. pylori
-infected žalúdočnú sliznicu a žiadny z CPG ostrova, chýba miest vykázalo významný rozdiel na frekvencii overmethylated prípadov , Na základe analýzy undermethylated prípadoch, frekvencia undermethylated TFF1
génu bola významne nízky v H. pylori
-pozitívne žalúdočnej sliznice (P
= 0,003). Údaje metylácie kostnej drene bol citovaný z predchádzajúcej štúdie s použitím rovnakého rádioaktívnych izotopov-označenie MSP protokolu [4]. V kostnej dreni, PGC
, TFF1
, MSLN stroje a RUNX3
gény boli úplne metylovaný, zatiaľ čo väčšina z CPG ostrova génu boli úplne unmethylated.Table 3 Porovnanie frekvencie nadmerné a undermethylated gény detekované v žalúdočných non-rakovinové a rakovinové tkanivá
Gene
nerakovinové tkanivá
mikrosatelitov genotypu karcinómov žalúdka (%)
kostnej dreni

H. pylori
negatívne
(n = 100)
H. pylori
pozitívny
(n = 100)
LOH-B
(n = 13)
LOH-L
(n = 29)

LOH-H
(n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18)
(%)

Overmethylation frekvencie
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24) Sims 3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 * Sims 3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
1 ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9 (69)
16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
1 (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 * Sims 3 (23) Sims 3 (10)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
MLH1
19
37 *
4 (31)
17 (59) *
11 ( 46) Sims 3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
PGA5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4
10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38) Sims 3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4 Sims 3
4 (31)
4 (14)
1 (4) NETHRY.cz 0 (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) *
16 (55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17) Sims 3 (75) Sims 3 (17)
Undermethylation frekvencia
CDH1
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25)
16 (89)
DUSP6
26
25 Sims 3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50)
18 (100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
1 (25)
17 (94)
RUNX3
5
1
0 (0 )
1 (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
PGA5
10
14
0 (0 ) Sims 3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29.
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) * Sims 3 (75) NETHRY.cz 0 (0)
TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33) Sims 3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
1 (3)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23) Sims 3 (10) Sims 3 (13)
1 (25)
5 (28)
karcinómov žalúdka boli rozdelené do základnej úrovne LOH (LOH-B) , na nízkej úrovni LOH (LOH-L), na vysokej úrovni LOH (LOH-H) a mikrosatelitních nestabilita (MSI). Podrobnosti sú uvedené v časti Materiál a metódy.
* H. Pylori
-pozitívnych žalúdočnej sliznice a karcinómov žalúdka boli porovnané s H. pylori
-vylučující žalúdočnej sliznice. Významné rozdiely boli stanovené pomocou Fisherovho exaktného testu (P Hotel < 0,01).
Vzťah medzi metyláciou prechodné-CPG a vzdialenosť k najbližšiemu retroelement bola hodnotená pomocou H. pylori
-associated rýchlosť overmethylation (Obrázok 3). V CPG ostrova génu, H. pylori
-associated overmethylation sadzba bola vyššia, než je vzdialenosť od najbližšieho retroelement stala kratšie. CPG-island-nemajú gény, ktoré nevykazovali žiadnu významnú metylácie rozdiel medzi H. pylori
-pozitívne a -vylučující sliznice boli methyluje bez ohľadu na vzdialenosť od najbližšieho retroelement.
Metylácia prechodné-CPG miest bola porovnávaná medzi žalúdkom a kostnej drene, pokiaľ ide o transkripčný aktivity (tabuľka 1 a obrázok 4). Gen skupiny CPG ostrov, ktorý je slabo aktívny v žalúdku bol viac methylata v H. pylori
negatívnych a -pozitívny tkanivách, než je v kostnej dreni. CPG-ostrov-nemajú TFF2 stroje a PGA5
génov, ktoré boli najviac vyjadrené v žalúdku, bola priemerná úroveň metylácie TFF2
génu bola nižšia ako v kostnej dreni (1,9), než vo H. pylori
-negativní (2,6, P
= 0,015) a -pozitívne sliznice (2,7, P
= 0,015). Priemerná úroveň metylácie PGA5
génu bola podobná v kostnej dreni (3.1) a H. pylori
-vylučující (3,0) a -pozitívne sliznice (3.0). PGC stroje a TFF1
žalúdka špecifické gény, ktoré boli slabo aktívne v žalúdočnej sliznici v porovnaní s dvoma master žalúdka špecifických génov, boli husto methylata v kostnej dreni (priemerný stupeň metylácie, 4.3 a 4.8). Obrázok 4 Metylácia v kostnej dreni a žalúdočné nenádorové a rakovinové tkanivá.

• Menej časté slizníc metastázy do žalúdka
• CD44, ale nie CD24 expresie súvisí s zlou prognózou v non-kardio adenokarcinóme žalúdka