D'overmethylated Genen vun Helicobacter pylori-Krankheet gastric mucosa sinn demethylated zu gastric Cancers

D'overmethylated Genen vun Helicobacter pylori VerfÜgung -infected gastric mucosa sinn zu gastric Cancers demethylated VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung d'Iwwergangs-CpG Siten tëscht schwaach methylated Genen an déckst methylated retroelements sinn am gastric mucosa overmethylated Personal mat Helicobacter pylori VerfÜgung (H. pylori VerfÜgung) a si sinn an der gastric Cancers je op de Niveau vum Verloscht vun heterozygosity (Loh) Evenementer undermethylated. Dës Etude delineated d'Iwwergangs-CpG methylation Musteren vun CpG-Insel-haltege an -lacking Genen am Hibléck vun der retroelements. VerfÜgung Method VerfÜgung D'provisoresch-CpG Siten vun aacht CpG-Insel-haltege Genen a sechs CpG-Insel -lacking Genen huet semi-quantitativ vun leeschtungsfäeg radioisotope-Etikette methylation-spezifesch Hinnen alleguer ënnert streng Konditiounen iwwerpréift. Den Niveau vun Loh an der gastric Cancers war mat der 40. microsatellite lues op aacht Kriibs-verbonne chromosomes geschat. All Gentherapie war domatter den overmethylated oder undermethylated baséiert op en normalen Niveau vun Iwwergangs-CpG methylation gemeinsam an der H. pylori VerfÜgung -negative gastric mucosa. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Déi aacht CpG-Insel Genen iwwerpréift goufen overmethylated jee op der Proximitéit zu der noosten retroelement am H. pylori VerfÜgung -positive gastric mucosa. Déi sechs CpG-Insel-subtil Genen waren am H. pylori VerfÜgung -positive an -negative gastric mucosa ähnlech methylated. An der gastric Cancers, nach laang Iwwergangsperiod-CpG Segmenter vun der CpG-Insel Genen wäit aus der retroelements overmethylated hierkommen d'overmethylation vu kuerz Iwwergangs-CpG Segmenter no der retroelements net wichteg war. Souwuel de CpG-Insel-haltege an -lacking Genen Lien decreasingly methylated gin zu enger Loh-Niveau-ofhängeg Manéier VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung D'overmethylated Genen ënner dem Afloss vun retroelement methylation am H. pylori VerfÜgung. - Krankheet Mo. sinn an der gastric Cancers beaflosst vun Loh demethylated. VerfÜgung Background VerfÜgung eng Maus Modell mat Helicobacter Krankheet pylori VerfÜgung (H. pylori VerfÜgung) huet illustréiert dass Réckemuerch hiirgestallt Stammzellen zu der gastric mucosa opgeholl a dann differenzéiert se gastric epithelial Zellen an [1]. Laut engem Self-Organisatioun Modell, kann duerchaus ausgedréckt Meeschtesch Genen engem Transkriptiouns Punkt Form vum Ausdrock vu villen anere Genen [2] ze koordinéieren. A Doséierung Kompensatioun Mechanismus proposéiert, datt et eng ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëschend der housekeeping Genen wouvun CpG-Inselen an der Otemschwieregkeeten-spezifesch Genen subtil CpG-Inselen, déi souwuel deelen enger limitéierter Quantitéit vun nuklearem Proteinen an d'nuklear Plaz [3, 4]. Souwuel de Self-Organisatioun an Doséierung Kompensatioun Modeller Héichpunkt datt den epigenetic Co-Regulatioun vun héichgradeg aktiv Mo-spezifesch Genen a schwaach aktiv housekeeping Genen erliichtert d'Ziel-dat vun hiirgestallt-ofgeleet Zellen am Mo. VerfÜgung Jiddferee mat H. Krankheet pylori VerfÜgung hi oft eng Rei vun gastric mucosal Ännerungen dorënner precancerous an kriibserreegend lesions [5]. Obwuel CpG-Insel overmethylation datt an der H. pylori an der inactivation vu Kriibs-verbonne Genen Resultat kann VerfÜgung -infected gastric mucosa, eng Associatioun tëscht der overmethylation an Ausdrock vun eenzelne CpG-Insel Genen ass net eendäideg [6] heefeg ass. Gastric precancerous an kriibserreegend lesions hunn CpG-Insel overmethylation dës souwéi Nepgen-grouss undermethylation, mä de zwou verschidde methylation Ännerunge weisen keen Zesummenaarbecht fir d'mi Evolutioun vun precancer a Kriibs [7]. Ausserdeem, déi héichgradeg ausgedréckt Mo-spezifesch Genen engem Meeschter Roll an der Co-Regulatioun vun villen Genen hunn bewisen e puer methylation Ännerungen am gastric Cancers [4, 8] gespillt. Mat Respekt Gentherapie Ausdrock ze koordinéieren, ass et néideg fir delineate wann de Mo-spezifesch Genen an der housekeeping Genen concurrent hi eropgeluede an ënner-methylation Ännerungen. VerfÜgung D'retroelements sinn Self-replicating parasitic DNAs dass hallef Mënsch Nepgen [gelant ,,,0],9]. De Provider Nepgen Hien der geféierlech stattfannen Effet vun der parasitic retroelements via engem DNA methylation-ofhängeg Mechanismus [10]. Der Iwwergangsperiod Gebitt tëscht der Bande methylated Genen an der déckst methylated retroelements, wéi d'CpG-Insel Spillraum an Transkriptiouns Start Site subtil CpG-Inselen, ass fir verschidde Grad methylated zu engem Otemschwieregkeeten-Typ-ofhängeg Manéier [4, 11, 12 ]. D'methylation vun Iwwergangs-CpG Siten Ännerungen dynamesch Äntwert op d'Ziel-dat vun stromal Zellen Réckemuerch hiirgestallt an de Verloscht-vun-heterozygosity (Loh) Evenementer zu gastric Cancers [12-15]. Aneren virdrun Etude huet och beschriwwen, dass de "CpG-Insel Bord" mat der Regelung vun Zell dat an carcinogenesis Zesummenhang ass [16]. Spannen, si vill Iwwergangs-CpG Siten an der Gentherapie-bascht retroelements gläichzäiteg eropgeluede oder vun enger bestëmmter Otemschwieregkeeten undermethylated [11, 17], wat beweist, datt d'concurrent methylation Ännerungen an villen Genen ënner dem Afloss vun retroelement methylation sinn. Mëttlerweil, sinn déi meescht CpG-räiche Inselen schwaach methylated oder unmethylated am meeschte Otemschwieregkeeten Typen, an der CpG-räiche Emplacementer fir d'Analyse vun dynamesch methylation bascht ze Gentherapie-Kontroll Regiounen net gëeegent [12, 13, 15, 18]. Dofir, sinn d'Iwwergangs-CpG Siten, anstatt CpG-räiche Inselen, wahrscheinlech als pivot-methylation Positiounen ze déngen, datt d'concurrent methylation Musteren verbonne mat H. pylori VerfÜgung Wonn an d'Evolutioun vun Kriibs spigelen. VerfÜgung Dës Etude der Iwwergangsperiod-CpG methylation Musteren vun der CpG-Insel Genen propagéieren an de Mo-spezifesch Genen subtil CpG-Inselen am H. pylori VerfÜgung gastric mucosa an gastric Cancers -infected. Verännerleche methylation vun Iwwergangs-CpG Siten war semi-quantitativ geschate ënner streng methylation-spezifesch Hinnen alleguer (MSP) Konditiounen dass kloer DNA Bands produzéiert [4, 8]. Eng Erhéijung oder erof an d'Iwwergangs-CpG methylation vun all Gentherapie war an der H. pylori VerfÜgung -negative gastric mucosa. VerfÜgung Method baséiert op en Tëscherapport methylation sech VerfÜgung Collection vun Otemschwieregkeeten Echantillon VerfÜgung Non-kriibserreegend Otemschwieregkeeten Echantillon waren aus der Nationaldivisioun outpatients gesammelt déi gastric endoscopy vun Abrëll 2008 bis Oktober 2009 am St. Paul an d'Spidol, d'kathoulesch Universitéit vu Korea mécht. Während Bild Ënnersichung, zwee Echantillon bascht Otemschwieregkeeten sech aus de Mo. antrum a Kierper Deel kritt, respektiv. Eng Fro specimen war mat formalin fir d'histologic Ënnersichung fest an déi aner Fro specimen war fir DNA Extraktioun benotzt. D'pathologist bestätegt engem gastric epithelial Zell Inhalt vun méi wéi 80% Rengheet an der Fro Stoffer. H. pylori VerfÜgung war Wonn iwwerpréift der Warthin-Stären Sëlwer Aflëss Method benotzt. Dës Etude dorënner 50 antrum a Kierper Puer zu H. pylori VerfÜgung -negative Fäll mat engem mëttleren Alter vun 53,2, an 50 antrum a Kierper Puer zu H. pylori VerfÜgung -positive Fäll mat engem mëttleren Alter vun 55,6. Et waren 25 Männercher an 25 Weibercher an déi H. pylori VerfÜgung -negative Fäll an 26 Männercher an 24 Weibercher an déi H. pylori VerfÜgung -positive Fäll. D'gastric Kriibs Stoffer aus der pathologic uplanzen vun 48 männlech a 22 weiblech Patiente kritt huet (mengen Alter: 63.7), deen chirurgesch resection tëscht Mäerz 2005 an Dezember 2008 bei St. Paul an d'Spidol, d'Kathoulesch Universitéit vu Korea mécht. D'clinicopathologic entholl Etapp war no der entholl-Node-Metastasen (TNM) Critèren sech [19]. All d'Sujeten gëtt hir schrëftlech informéiert Zoustëmmung an dëser Etude war vun der institutioneller review Comité ofgeseent. VerfÜgung Ray Virbereedung an bisulfite Modifikatioun vun DNA VerfÜgung Déi frësch Fro uplanzen sech fir machbar semi-grouss MSP Analyse benotzt, well formalin-fixen Otemschwieregkeeten DNAs éischter wéineg no bisulfite Modifikatioun Kick gin [8]. Fir d'microsatellite Analyse, war den DNA aus der formalin-fix paraffin-Ënnerbewosstsinn entholl Stoffer ofgebaut wéi virdru beschriwwen [20, 21]. D'entholl uplanzen sech microdissected e chirurgeschen scalpel ënnert engem stereomicroscope benotzt. engem Kriibs Zell Inhalt vun méi wéi 80% All vun der microdissected Kriibs Stoffer aus. Benotzt DNA Extraktioun Prellbock (0,5% Tween-20, 1 mm héich pH 8.0, 50 mm Tris pH 8.0, 0,5 mg /ML proteinase K), waren d'Fro uplanzen an microdissected Stoffer fir 24 HR bei 37 ° C verdaut. Ongeféier 1.000 Zellen sech mat 20 μL vun der DNA Extraktioun gefiermt incubated no deem eng DNA Isolatioun Kit (A1120, Promega, Madison, allem, USA) benotzt gouf, fir d'Frankräich DNA Extrait laut den Hiersteller d'Instruktioune. VerfÜgung Ray DNA huet geännert mat Natrium bisulfite wéi soss beschriwwen [8, 11-13]. Kuerz, war 1 μg Frankräich DNA mat 10 μL vun 3 M NaOH bei 37 ° C fir 15 min behandelt. Dunn huet de denatured DNA mat 1,04 ml vun 2,3 M Natrium bisulfite an 60 μL vun 10 mm hydroquinone gemëscht an dat war bei 50 ° C fir 12 Stonnen waarm. D'bisulfite behandelt DNA, déi stilvoller war Wizard DNA Offäll resin benotzt (Promega, Madison, allem, USA), war desulfonated mat 3 M NaOH a Preisen, mat Ethanol, an dann an 35 μL vu 5 mm Tris gefiermt opgeléist gouf (pH 8.0) . VerfÜgung Radioisotope-Etikette semiquantitative Analyse methylation VerfÜgung Vergläichend Analyse vun der microarray a Salbei (Serial Analys vum Gene Expression) Daten huet fonnt, dass d'Zuel vun gët am Salbei Donnéeën gezielt wourop eng grouss Differenz zu der Gentherapie Aktivitéit duerstellt tëschent de Mo-spezifesch Genen an housekeeping Genen [4]. Der Iwwergangsperiod-CpG Siten vun de Mo-spezifesch Genen (PGA5 VerfÜgung an PGC VerfÜgung) [22], de mucosa-verkënnegt Genen (TFF1 VerfÜgung an TFF2 VerfÜgung) [23], déi Kriibs-Zesummenhang Genen (CDH1 VerfÜgung, MLH1 VerfÜgung, PPARG VerfÜgung, CDKN2A VerfÜgung an RUNX3 VerfÜgung) [15, 24-27], an d'Net-gastric Genen (ARRDC4 VerfÜgung, DUSP6
, TRAPPC2L VerfÜgung, MSLN VerfÜgung an KRT6A VerfÜgung) [28-32] sech ausgewielt (Table 1). D'MSP Siten, e Message, a Konditiounen sinn an Weider Fichier 1. Eng niddreg GC Inhalt an enger widderhuelen Haaptrei am methylation-Variabel Iwwergangs-CpG Site gewise zougedréckt oft schwaach oder Wellelängteverschmierung MSP Bands wéinst dem reduzéierten Komplexitéit vun der Nukleotid Message folgenden bisulfite Behandlung [4, 8, 33]. Fir sech d'Spezifizitéit vun Iwwergangs-CpG amplification, all MSP primer gesaat Erhéijung entworf 3-5 CpG Siten ze enthalen an engem klenge amplicon Gréisst ze falen, an der MSP Reaktioun gouf mat Hëllef dTTP-radioisotope ënner streng Konditiounen gehaal, wéi virdru beschriwwen [4, 8, 11, 12]. 10 μL vun engem Hinnen alleguer Mëschung kuerz, datt 1 μL bisulfite geännert DNA Texter, 1 μCi vun α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 μM dATP, dCTP an dGTP, 25 μM dTTP, 1 pmol vun primers, 0,1% Tween 20 an 0.3 Eenheet vun Taq VerfÜgung polymerase vun 32 Hinnen alleguer Zykle ënner Implikatioune war Hinnen alleguer Konditiounen waarm-Start. D'Vertrieder methylation Resultater sinn an Dorënner 1A.Table 1 Déi nooste retroelement an der Reunioun vun de 14 ausgewielt Genen matt an ouni CpG Inselen VerfÜgung Gene VerfÜgung dës VerfÜgung CpG Inselen
noosten retroelement
Nr vun ausgedréckt gët am Mo.
zu zu Numm vun der Famill
Distanz zu Transkriptiouns Start Site
zu CDH1
Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 0.3 kB VerfÜgung 19 VerfÜgung ARRDC4
Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 1,7 kB VerfÜgung 7 VerfÜgung PPARG
Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 2,3 kB VerfÜgung 3 VerfÜgung CDKN2A
Jo VerfÜgung LTR VerfÜgung 2,4 kB VerfÜgung 1 VerfÜgung TRAPPC2L VerfÜgung VerfÜgung Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 3,8 kB VerfÜgung 14 VerfÜgung DUSP6
Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 6,6 kB VerfÜgung 8 VerfÜgung MLH1 VerfÜgung
Jo VerfÜgung Alu VerfÜgung 6,6 kB VerfÜgung 0 VerfÜgung RUNX3
Jo VerfÜgung LTR 8.3 kB
0 VerfÜgung PGA5
Nee VerfÜgung Alu VerfÜgung 1.2 kB VerfÜgung 734 VerfÜgung PGC
Nee VerfÜgung Alu VerfÜgung 1,6 kB VerfÜgung 33 VerfÜgung TFF1
Nee
Alu VerfÜgung 0,5 kB VerfÜgung 11 VerfÜgung TFF2
Nee VerfÜgung 2,7 kB VerfÜgung L1 VerfÜgung 632 VerfÜgung MSLN
Nee VerfÜgung Alu VerfÜgung 1,4 kB VerfÜgung 50 VerfÜgung KRT6A
Nee VerfÜgung Alu VerfÜgung 4.2 kB VerfÜgung 1 VerfÜgung d'Informatiounen iwwer CpG Inselen, retroelements an der Zuel vun ausgedréckt gët an de Mo huet aus virdrun publizéiert Donnéeën kritt [4]. VerfÜgung 1 d'semi-grouss methylation Analyse (a) an der Biologie an sequencing (B) an der Iwwergangsperiod-CpG Siten Dorënner. D'methylation vun Iwwergangs-CpG Siten war vun leeschtungsfäeg enger semi-grouss methylation Analyse (A) an et war mat Biologie an sequencing vun der gemeinsamer primer (B) ubelaangt bewäert. (A) A Ganzen 14 Iwwergangs-CpG Sitë waren an der H. pylori VerfÜgung iwwerpréift -negative an H. pylori VerfÜgung -positive normal gastric mucosa a Kriibs lesion vun gastric Kriibs Patienten. D'methylation Dicht war no den Undeel vun der methylation (M) Band Intensitéit géint den Total unmethylation (U) an methylation Band Intensitéit berechent. D'methylation Dicht vun all CpG Site ass mat 20% -methylation increment an 5 Niveauen klassifizéiert. D'methylation Status vun all Gentherapie als undermethylation (han-) oder overmethylation (vill) baséiert op en Tëscherapport methylation Niveau (inter-) vum H. pylori VerfÜgung -negative normal gastric mucosa kategoriséiert war. (B) Vertriederin Resultater vum Klone an sequencing vun gemeinsam Hinnen alleguer. Der Iwwergangsperiod-CpG Siten vun der CDH1 VerfÜgung, CDKN2A VerfÜgung an RUNX3 VerfÜgung Genen sech duerch Klone analyséiert a sequencing der gemeinsamer Hinnen alleguer Produit. Déi Frankräich DNAs zu Dorënner 1A vertruede waren benotzt der MSP Resultater mat der sequencing Resultater ze vergläichen. Oppen an zoue Kreeser weg unmethylated an methylated cytosine Pestiziden, bzw.. De véiereckege Këschte unzeginn MSP primer Siten. VerfÜgung Semiquantitative Evaluatioun vun Iwwergangs-CpG methylation Variant VerfÜgung der Hinnen alleguer Zoustand vun all Saz MSP primer validéiert war vun der Norm rop plotting laut verschiddenen Dampgemësch vun Band Intensitéit vum MSP Produite mat universal methylated an unmethylated Kontroll DNA [11, 18]. Déi Frankräich DNA mat DNA behandelt methylase (CpGenome Universal Methylated DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) a vun enger genereller primer Kick (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ") goufen, fir d'allgemengt methylated benotzt an unmethylated Kontroll DNA, bzw.. Baséiert op der Norm rop, d'methylation Dicht vum Site Iwwergangs-CpG berechent war mat der folgender Formule: methylation Undeel (%) = (methylation Intensitéit /(methylation + unmethylation Intensitéit)) × 100 [8, 11, 13, 15, 18]. Fir d'reproducibility vun der Variabel methylation Dicht engem semiquantitative Analyse benotzt, de 5-Niveau Klassifikatioun mat 20% -methylation increment an der 10-Niveau Klassifikatioun mat 10% -methylation increment validéiert goufen an der vläit Otemschwieregkeeten Echantillon Verglach. De Komparativ Analyse vun der vläit Echantillon gouf mat der verduebelt DNAs vum 40. Stoffer gehaal an 48 Puer 1-cm-bascht Stoffer zousätzlech zu 100 Puer antrum a Kierper Stoffer, déi aus de 50 H. pylori VerfÜgung kritt huet - negativ Mo. Stoffer an der 50. H. pylori VerfÜgung -positive Mo. Stoffer (Dorënner 2). Figur 2 Analys vun Variabel methylation an der Iwwergangsperiod-CpG Siten. (A a B) Déi reproducibility vun de 5-Niveau Klassifikatioun mat 20% -methylation increment (A) an 10-Niveau Klassifikatiounen mat 10% -methylation increment (B) war an vun der Unzuel vun den vläit Otemschwieregkeeten Echantillon weist keng Ennerscheeder ubelaangt den Niveau vun methylation. D'verduebelt DNAs vun der selwechter Otemschwieregkeeten (zougemaach Baren), e Brëll vun 1-cm-bascht Stoffer (gro Baren) an engem Pair vu antrum a Kierper Stoffer (oppen Baren) waren Verglach. (C an D) Analys vun en Tëscherapport methylation Niveau. D'Frequenz vun undermethylated an overmethylated Fäll war baséiert op en normalen Niveau Rennsport zwee Niveauen (20% methylation) (C) an een Niveau (10% methylation) (D) vum 10.-Niveau Klassifikatioun gemeinsam zu H. pylori VerfÜgung geschat - gastric mucosa negativ. VerfÜgung d'overmethylation Taux vun all Iwwergangs-CpG Site vun der H. pylori VerfÜgung -positive an -negative gastric mucosa war vun der famill Undeel vun overmethylated Fäll fir de ganzen Zomm vun der eropgeluede berechent an ënner -methylated Fäll. D'-associated overmethylation Taux VerfÜgung H. pylori war mat der H. pylori berechent VerfÜgung -positive-ze-negativ Verhältnis vun all Iwwergangs-CpG-overmethylation Tarif. Dat war fréier d'Relatioun tëscht der methylation vun Iwwergangs-CpG Siten an d'Distanz tëscht den Transkriptiouns Start Site an der noosten retroelement (Dorënner 3) ze diskutéieren. Figur 3 H. pylori VerfÜgung -induced methylation vun der CpG-Insel-haltege an -lacking Genen no der Distanz zu der noosten retroelements an der Transkriptiouns Aktivitéit. Eng total vun 14 Iwwergangs-CpG Siten sech gruppéiere an aacht CpG-Insel Genen (CDH1 VerfÜgung, ARRDC4 VerfÜgung, PPARG VerfÜgung, CDKN2A VerfÜgung, TRAPPC2L VerfÜgung, DUSP6 VerfÜgung, MLH1
a RUNX3 VerfÜgung) a sechs Genen CpG-Inselen (PGA5 VerfÜgung, PGC VerfÜgung, TFF1 VerfÜgung, TFF2 VerfÜgung, MSLN VerfÜgung an KRT6A VerfÜgung subtil). Der Gentherapie-retroelement Distanz war tëscht dem transcriptional Start Siten an den nooste Alu, L1 oder LTR retroelements geschat. Den H. pylori VerfÜgung -induced methylation Taux gouf vum H. pylori representéiert VerfÜgung -positive-ze-negativ Verhältnis vun der overmethylation Tarif. D'overmethylation Taux war no der famill Undeel vun overmethylated Fäll ze ganzen Zomm vun de Mat- an ënner-methylated Fäll berechent. D'transcriptional Aktivitéit vun all Gentherapie war mat der Zuel vun ausgedréckt gët dës [4]. VerfÜgung Biologie an sequencing vun methylation-Variabel Site VerfÜgung der MSP Resultater vun Iwwergangs-CpG Siten sech mat Biologie an sequencing vun der gemeinsamer Hinnen alleguer reconfirmed primer baut opmierksam souwuel d'unmethylated an methylated CpG Siten (Dorënner 1B) [4, 11, 12]. D'Hinnen alleguer Produite vun der gemeinsamer primer baut sech an d'T &gekloonten; A Klone Vecteure (Real Biotech, Taipei, Taiwan). mat der BigDye Enn Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) an eng Abi automatiséiert DNA sequencer (PE Biosystmes, Warrington, UK) d'DNA sequencing war fir 10 clones vun der gemeinsamer Hinnen alleguer vectors gesuergt. Well d'gemeinsam baut primer Eechenholz der CpG-aarme Géigende verschidde Grad vun methylation produzéiert no der Hinnen alleguer Conditioun, ugepasst mir de Hinnen alleguer Zoustand vun der gemeinsamer primer Formatioun der methylation Dicht ze kréien, dass an ähnleche war esouwuel den semi-grouss MSP assay an der sequencing Resultater vun der 10. gemeinsam-Hinnen alleguer clones. VerfÜgung Analys vun microsatellite alleles VerfÜgung fir d'Hinnen alleguer-baséiert Loh Analyse, insgesamt 40 microsatellite lues op aacht Kriibs-verbonne chromosomes (3p, 4P, 5Q, 8p, 9p , 13q, 17p an 18q) an d'Richtlinne fir de Status vun Loh an MSI sech ukomm wéi soss beschriwwen benotzt [20, 21]. D'allelic Profil vun der 40. microsatellite Message an all Fall iwwerpréift war am Ufank an MSI kategoriséiert baséiert op der Präsenz vum Roman alleles am homozygous Bewaacher geflitzt an der unilateral allelic Verloscht am heterozygous Bissau. Laut der Zuel vun de Loh-positiv chromosomes, war de Niveau vun Loh domatter esou déif-Niveau (zwou oder dräi chromosomal Verloschter, Loh-L) an héich-Niveau (véier oder méi chromosomal Verloschter, Loh-H) Loh. Een oder nee chromosomal Verloschter séiert sech an der baseline-Niveau (Loh-B) fir d'diffusen-Typ Kriibs an der niddereg Niveau fir intestinal an deer Zort, respektiv, je op hire jeeweilegen histological subtype. VerfÜgung statistique Analyse
genau Test d'Fisher war fir een de Mat- an ënner-methylation Ännerungen tëschent dem H. pylori VerfÜgung -negative oder -positive gastric mucosa an der gastric Cancers benotzt, mat Bedeitung fir Wäerter ënnert P unerkannten VerfÜgung manner wéi 0,01 Wäerter . D't VerfÜgung Test d'Student war fir een d'methylation Differenzen tëscht der gastric noncancerous an kriibserreegend Stoffer, mat Bedeitung fir Wäerter ënnert P unerkannten benotzt VerfÜgung manner wéi 0,05 Wäerter. Statistique Evaluatioun andems statistesch Software Package Leeschtung war SPSS 11.0 (SPSS Galaxy Chicago, IL, USA). VerfÜgung Resultater VerfÜgung Methylation-Variant zu noncancerous Stoffer VerfÜgung A Ganzen 14 Iwwergangs-CpG Siten gewielt goufen vun aacht CpG-Insel Genen (CDH1 VerfÜgung, ARRDC4 VerfÜgung, PPARG VerfÜgung, CDKN2A VerfÜgung, TRAPPC2L VerfÜgung, DUSP6 VerfÜgung, MLH1 VerfÜgung an RUNX3 VerfÜgung) a sechs CpG -island-subtil Genen (PGA5 VerfÜgung, PGC VerfÜgung, TFF1 VerfÜgung, TFF2 VerfÜgung, MSLN VerfÜgung an KRT6A VerfÜgung) (Table 1). D'reproducibility vun Iwwergangs-CpG Site vun all MSP primer Formatioun Implikatioune war mat der verduebelt DNAs vun der selwechter Otemschwieregkeeten évaluéiert, Pair vu 1-cm-bascht Stoffer an engem Pair vu antrum a Kierper Stoffer (Dorënner 2A an 2B). 92% vun de 40 verduebelt DNAs, 73% vun de 48 1-cm-bascht Otemschwieregkeeten opzefëllen, an 58% vun de 100 antrum a Kierper Puer goufen als déi selwecht methylation Niveauen an der Klassifikatioun 5-Niveau stoung. D'selwecht-Faarwen Fäll vun der verduebelt Experimenter huet ongeféier 25% méi heefeg am 5-Niveau ze klasséieren ewéi an der 10-Niveau ze klasséieren. VerfÜgung Een Tëscherapport Niveau vun Variabel Iwwergangs-CpG methylation war mat 1400 MSP amplicons vum 14. analyséiert Iwwergangs-CpG Siten aus 100 H. pylori kritt VerfÜgung -negative Mo. Echantillon (Dorënner 2C an 2D). An der 10-Niveau ze klasséieren, d'Ëmwandlung vun enger eenzeger gemeinsam methylation Niveau (38%) war esou niddereg, datt en Tëscherapport Niveau baséiert op zwou gemeinsam Niveauen sech war. 937 (67%) vun der 1.400 MSP amplicons goufen an een anere Niveau vun den 100 Stoffer kategoriséiert. Tëscherapport methylation Niveau vun aacht CpG-Insel Rand Lien ze niddreg wéi déi vun sechs CpG-Insel-subtil Siten (Table 2). Am Allgemengen, grouss ufale vun eenzelne Mo. Stoffer (67%) an 1-cm-bascht Otemschwieregkeeten Puer (73%) gewisen, datt d'Iwwergangs-CpG Siten zu enger Rei vun ähnlechen Inhaltsverzeechnes tëscht iwwer 20% verännerlech methylated goufen. Dofir, war en Tëscherapport Niveau Rennsport zwee Niveauen (20% methylation) vun 10-Niveau Klassifikatioun benotzt déi eropgeluede oder ënner-methylated Status vun Iwwergangs-CpG Siten an der gastric mucosa.Table 2 D'Heefegkeet vun han- a vill ze bestëmmen methylated Fäll wéi baséiert op Tëscherapport methylation Niveauen gemeinsam an der H. pylori VerfÜgung -negative gastric mucosa (n = 100) VerfÜgung Gene Numm VerfÜgung sech VerfÜgung Tëscherapport methylation Dicht
Nr vun han- methylated Fäll
Nr vun Zuelen methylation Fäll
Nr vun eropgeluede methylated Fäll
CpG-Insel Genen VerfÜgung CDH1
0 wouvun - 20% VerfÜgung 0 VerfÜgung 79 zu 21 VerfÜgung ARRDC4 VerfÜgung
0 - 20% VerfÜgung 0 VerfÜgung 80 zu 20 VerfÜgung PPARG VerfÜgung 0 VerfÜgung - 20% VerfÜgung 0 VerfÜgung 60 zu 40 VerfÜgung CDKN2A
zu 0 - 20% VerfÜgung 0 VerfÜgung 54 zu 46 VerfÜgung TRAPPC2L
40 - 60% zu 13 zu 81 VerfÜgung 6 VerfÜgung DUSP6
20 - 40% zu 26 zu 62 zu 12 VerfÜgung MLH1
20 - 40% zu 20 zu 61 zu 19
RUNX3 VerfÜgung 30 VerfÜgung - 50% VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 53 zu 42 VerfÜgung CpG-Insel Genen subtil VerfÜgung PGA5
40 - 60% zu 10 VerfÜgung 78 zu 12 VerfÜgung PGC
40 - 60% zu 29 zu 67 VerfÜgung 4 VerfÜgung TFF1 VerfÜgung 20 VerfÜgung - 40%
zu 52 zu 37 VerfÜgung TFF2
30 - 50% zu 36 zu 60 VerfÜgung 4 VerfÜgung MSLN
60 - 80% VerfÜgung 0 VerfÜgung 88 zu 12 VerfÜgung KRT6A
60 - 80% zu 17 zu 65 zu 18 VerfÜgung Bezéiung tëscht H. pylori VerfÜgung - assoziéiert overmethylation entweder d'retroelements oder Transkriptiouns Aktivitéit VerfÜgung d'Ofstänn vun de Mat- an ënner-methylated Fäll goufen getrennt gezielt hire Restaurant an der Variabel methylation vun der Iwwergangs-CpG Siten ze schätzen (Table 3). Op der Analys vun der overmethylated Fäll, all d'CpG-Insel Rand waren an der H. pylori VerfÜgung -infected gastric mucosa an keent vun der CpG-Insel-subtil Siten duerch e wesentlechen Ënnerscheed fir d'Heefegkeet vun de overmethylated Fäll vill overmethylated . Op der Analys vun der undermethylated Fäll, war d'Frequenz vun der undermethylated TFF1 VerfÜgung Gentherapie am H. pylori VerfÜgung -positive gastric mucosa (P VerfÜgung = 0.003) vill niddreg. D'methylation Donnéeë vu Réckemuerch hiirgestallt gouf vun engem fréiere Etude benotzt déi selwecht radioisotope-Etikette MSP Protokoll [4] zitéiert. An Réckemuerch hiirgestallt, goufen d'PGC VerfÜgung, TFF1 VerfÜgung, MSLN VerfÜgung an RUNX3 VerfÜgung Genen komplett methylated hierkommen, déi vun der CpG-Insel Genen komplett unmethylated.Table 3 Verglach vun der Frequenz vun eropgeluede goufen an undermethylated Genen vun der gastric Net-kriibserreegend a kriibserreegend Stoffer fonnt VerfÜgung Gene VerfÜgung Noncancerous Otemschwieregkeeten VerfÜgung
Microsatellite genotype vun gastric Cancers (%)
Bone hiirgestallt
zu H. pylori VerfÜgung negativ VerfÜgung (n = 100)
H. pylori VerfÜgung positive VerfÜgung (n = 100)
Loh-B VerfÜgung (n = 13)
Loh-L VerfÜgung (n = 29) VerfÜgung VerfÜgung Loh-H VerfÜgung (n = 24)
MSI VerfÜgung (n = 4)
(n = 18) VerfÜgung (%) VerfÜgung
Overmethylation Frequenz VerfÜgung CDH1
21 zu 77 * VerfÜgung 0 (0) * VerfÜgung 7 (24) VerfÜgung 3 (13) VerfÜgung 0 (0)
0 (0) VerfÜgung ARRDC4
20 zu 62 * VerfÜgung 3 (23) VerfÜgung 8 (28) VerfÜgung 1 (4) * VerfÜgung 1 (25. ) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung PPARG
40 zu 82 * VerfÜgung 5 (38) VerfÜgung 7 (24) VerfÜgung 6 (25) VerfÜgung 1 ( 25) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung CDKN2A
46 zu 90 * VerfÜgung 9 (69) VerfÜgung 16 (55) VerfÜgung 9 (38) VerfÜgung 2 (50) VerfÜgung 4 (22) VerfÜgung TRAPPC2L
6 VerfÜgung 21 * VerfÜgung 6 (46) * VerfÜgung 8 (28) * VerfÜgung 1 (4)
1 (25) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung DUSP6
12 zu 36 * VerfÜgung 3 (23) VerfÜgung 3 (10) VerfÜgung 1 (4) VerfÜgung 2 (50) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung MLH1
19 zu 37 * VerfÜgung 4 (31) VerfÜgung 17 (59) * VerfÜgung 11 ( 46) VerfÜgung 3 (75) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung RUNX3
42 zu 85 * VerfÜgung 10 (77) VerfÜgung 26 (90) * VerfÜgung 19 (79) * VerfÜgung 4 (100) bis 18 (100) VerfÜgung PGA5
12 zu 13 VerfÜgung 5 (38) VerfÜgung 8 (28)
1 (4) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung PGC
4 VerfÜgung 10 VerfÜgung 4 (31) VerfÜgung 4 (14)
5 (21) VerfÜgung 1 (25) VerfÜgung 18 (100) VerfÜgung TFF1
37 zu 52 VerfÜgung 5 (38) VerfÜgung 3 (10) *
3 (13) * VerfÜgung 0 (0) zu 18 (100) VerfÜgung TFF2
4 VerfÜgung 3 VerfÜgung 4 (31) VerfÜgung 4 (14) VerfÜgung 1 (4) VerfÜgung 0 (0) zu 2 (11) VerfÜgung MSLN
12 zu 11 VerfÜgung 8 (62) * 16 VerfÜgung (55 ) * VerfÜgung 6 (25) VerfÜgung 1 (25) VerfÜgung 18 (100) VerfÜgung KRT6A
18 zu 16 VerfÜgung 4 (31) VerfÜgung 16 ( 55) * VerfÜgung 4 (17) VerfÜgung 3 (75) VerfÜgung 3 (17) VerfÜgung Undermethylation Frequenz VerfÜgung CDH1
0 VerfÜgung 0 VerfÜgung 0 (0 ) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung ARRDC4
0 VerfÜgung 0 VerfÜgung 0 (0 ) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung PPARG
0 VerfÜgung 0 VerfÜgung 0 (0 ) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung CDKN2A
0 VerfÜgung 0 VerfÜgung 0 (0 ) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung TRAPPC2L
13 zu 11 VerfÜgung 1 (8 ) VerfÜgung 2 (7) VerfÜgung 7 (29) VerfÜgung 1 (25) 16 (89)
DUSP6
26 zu 25 VerfÜgung 3 (23 ) VerfÜgung 13 (45) VerfÜgung 12 (50) VerfÜgung 2 (50) 18 VerfÜgung (100) VerfÜgung MLH1
20 zu 18 VerfÜgung 7 (54 ) VerfÜgung 6 (21) VerfÜgung 9 (38) VerfÜgung 1 (25) VerfÜgung 17 (94) VerfÜgung RUNX3
5 zur VerfÜgung 1 VerfÜgung 0 (0 ) VerfÜgung 1 (3) zu 2 (8) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung PGA5
10 zu 14 zu 0 (0 ) VerfÜgung 3 (10) VerfÜgung 5 (21) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung PGC
29 zu 18 VerfÜgung 4 (31 ) VerfÜgung 8 (28) VerfÜgung 5 (21) VerfÜgung 2 (50) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung TFF1
11 VerfÜgung 1 * VerfÜgung 7 ( 54) VerfÜgung 19 (66) * VerfÜgung 17 (71) * VerfÜgung 3 (75) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung TFF2
36 zu 26 VerfÜgung 4 (31) VerfÜgung 11 (38) VerfÜgung 8 (33) VerfÜgung 3 (75) VerfÜgung 13 (72) VerfÜgung MSLN
0 VerfÜgung 0 VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung 1 (3) VerfÜgung 1 (4) VerfÜgung 2 (50) VerfÜgung 0 (0) VerfÜgung KRT6A
17 zu 16 VerfÜgung 3 (23) VerfÜgung 3 (10) VerfÜgung 3 (13) VerfÜgung 1 (25) VerfÜgung 5 (28) VerfÜgung D'gastric Cancers an baseline-Niveau Loh kategoriséiert waren (Loh-B) , héich-Niveau Loh (Loh-L), héich-Niveau Loh (Loh-H) an microsatellite Instabilitéit (MSI). D'Detailer ginn an d'Material a Methoden Rubrik beschriwwen. VerfÜgung * H. pylori VerfÜgung -positive gastric mucosa an gastric Cancers sech am Verglach mat H. pylori VerfÜgung -negative gastric mucosa. Differenze waren Fisher d'exakt Test alles benotzt (P VerfÜgung &Si besteet; 0.01). VerfÜgung D'Relatioun tëscht der Iwwergangs-CpG methylation an der Distanz zu der noosten retroelement war mat der H. bewäert pylori VerfÜgung -associated overmethylation Taux (Well 3). An der CpG-Insel Genen, war den H. pylori VerfÜgung -associated overmethylation Taux méi héich wéi d'Distanz vun den nooste retroelement kuerz gouf. D'CpG-Insel-subtil Genen datt kee groussen methylation Ënnerscheed tëscht dem H. pylori VerfÜgung -positive an -negative mucosa huet sech onofhängeg vun der Distanz vun den nooste retroelement methylated. VerfÜgung der methylation vun Iwwergangs-CpG Siten war Verglach tëschent de Mo a Réckemuerch hiirgestallt an Conditioune vun der Transkriptiouns Aktivitéit (Table 1 an Dorënner 4). D'CpG-Insel Gentherapie Grupp datt schwaach aktiv am Mo. gouf méi methylated am H. pylori VerfÜgung -negative an -positive Stoffer wéi dat am Réckemuerch hiirgestallt. Vun der CpG-Insel-subtil TFF2 VerfÜgung an PGA5 VerfÜgung Genen, datt sech déi héich an de Mo. ausgedréckt, war d'mengen methylation Niveau vun der TFF2 VerfÜgung Gentherapie manner wéi an de Schanken hiirgestallt (1,9) wéi an der H. pylori VerfÜgung -negative (2,6, P VerfÜgung = 0.015) an -positive mucosa (2,7, P VerfÜgung = 0.015). Déi heeschen methylation Niveau vun der PGA5 VerfÜgung Gentherapie war ähnlech am Réckemuerch hiirgestallt (3,1) an H. pylori VerfÜgung -negative (3.0) an -positive mucosa (3.0). De PGC VerfÜgung an TFF1 VerfÜgung Mo-spezifesch Genen, déi am gastric mucosa schwaach aktiv waren, wann der zwee Meeschtesch Mo-spezifesch Genen Verglach, goufen déckst methylated am Réckemuerch hiirgestallt (mengen methylation Niveau, 4,3 an 4,8). Figur 4 D'methylation am Réckemuerch hiirgestallt an der gastric noncancerous an kriibserreegend Stoffer. Déi heeschen Niveau vun methylation am Réckemuerch hiirgestallt (●), den H. pylori VerfÜgung -negative gastric mucosa (■), den H. pylori VerfÜgung -positive gastric mucosa (♦) an der baseline-Niveau Loh Fäll (

• Verschiddenheet mucosal Investitiounen an d'stomach
• CD44 awer net CD24 Ausdrock ass aarmséileg hätt an Net-Cardia adenocarcinoma vun der stomach