De overmethylated gener i Helicobacter pylori-inficerede maveslimhinden er demethyleret i gastriske cancere

De overmethylated gener i Helicobacter pylori
inficerede maveslimhinden er demethyleret i gastrisk kræft
Abstrakt
Baggrund
Overgangsbestemmelserne-CpG sites mellem svagt denatureret gener og tæt denatureret retroelements er overmethylated i maveslimhinden inficeret med Helicobacter pylori Hotel (H. pylori
), og de er undermethylated i mavens kræft afhængigt af niveauet for tab af heterozygositet begivenheder (LOH). Denne undersøgelse afgrænset overgangsbestemmelserne-CpG methylering mønstre af CpG-ø-holdige og -lacking gener på grund af de retroelements.
Metoder
Overgangsbestemmelserne-CpG steder af otte CpG-ø-holdige gener og seks CpG-ø -lacking gener blev semi-kvantitativt undersøgt ved at udføre radioisotop-mærkning methyleringsspecifik PCR under stringente betingelser. Niveauet af LOH i de gastriske cancere blev estimeret ved anvendelse af de 40 mikrosatellitmarkører på otte cancerassocierede kromosomer. Hvert gen blev scoret som overmethylated eller undermethylated baseret på et mellemliggende niveau af overgangsperioden-CpG methylering almindelig i H. pylori
-negativ maveslimhinden.
Resultater
De otte CpG-ø-gener undersøgte blev overmethylated afhængigt nærhed til den nærmeste retroelement i H. pylori
-positiv maveslimhinden. De seks CpG-ø-mangler gener blev tilsvarende methyleret i H. pylori
-positiv og -negativ maveslimhinden. I mavens kræft, lange overgangsperiode-CpG segmenter af CpG-ø-gener fjernt fra retroelements forblev overmethylated, mens overmethylation af korte overgangsordninger-CpG segmenter tæt på retroelements ikke var signifikant. Både CpG-ø-holdige og -lacking gener tendens til at være mindre og mindre methyleret i et LOH-niveau-afhængig måde
Konklusioner Salg The overmethylated gener under indflydelse af retroelement methylering i H. pylori
. - inficeret mave er demethyleret i mavens kræft påvirket af LOH.
Baggrund
En musemodel inficeret med Helicobacter pylori Hotel (H. pylori
) har illustreret, at knoglemarv stamceller migrere til maveslimhinden og derefter de differentierer til gastriske epitelceller [1]. Ifølge en selvorganisering model, kan stærkt udtrykte master-gener danner en transskription hub at koordinere ekspressionen af ​​mange andre gener [2]. En dosis kompensationsordning foreslår, at der er en omvendt korrelation mellem husholdning gener, der indeholder CpG-øer og vævsspecifikke gener mangler CpG-øer, som begge deler en begrænset mængde af nukleare proteiner i den nukleare rum [3, 4]. Både selvorganisering og dosering kompensation modeller understrege, at den epigenetiske samregulering af højaktive mave-specifikke gener og svagt aktive husholdning gener letter trans-differentiering af marv-afledte celler i maven.
Personer inficeret med H. pylori
ofte gennemgå en række gastrisk slimhindeforandringer herunder forstadier og kræft [5]. Selvom CpG-ø overmethylation der kan resultere i inaktivering af cancer-associerede gener er almindelig i den H. pylori
inficerede maveslimhinden, en forening mellem overmethylation og ekspressionen af ​​individuelle CpG-ø-gener er tvetydig [6]. Gastric præcancerøse og cancerøse læsioner har vist CpG-ø overmethylation samt hele genomet undermethylation, men de to særskilte methylering ændringer viste ingen samarbejde for den sekventielle udvikling i præcancer og cancer [7]. Desuden har de højt udtrykte mave-specifikke gener spiller en mester rolle i co-regulering af talrige gener påvist et par methylering ændringer i mavens cancere [4, 8]. Med hensyn til at koordinere genekspression, er det nødvendigt at afgrænse hvis maven-specifikke gener og husholdning gener undergår samtidige over- og under-methylering ændringer.
Den retroelements er selvreplikerende parasitiske DNA'er, der optager halvdelen af ​​den menneskelige genom [ ,,,0],9]. Værtsgenomet undertrykker farlig mutation virkning af de parasitiske retroelements via en DNA methylering-afhængig mekanisme [10]. Overgangsområdet mellem de svagt methylerede gener og de tæt methylerede retroelements, såsom CpG-ø margin og transkriptionsstartsitet mangler CpG-øer, methyleres i varierende omfang i en vævstype-afhængig måde [4, 11, 12 ]. Den methylering af overgangsordninger-CpG sites ændrer dynamisk som reaktion på det transeuropæiske differentiering af stromale knoglemarvsceller og begivenhederne tab-of-heterozygositet (LOH) i gastrisk kræft [12-15]. En anden tidligere undersøgelse har også beskrevet, at den "CpG-ø shore" er relateret med reguleringen af ​​celledifferentiering og carcinogenese [16]. Interessant mange overgangs--CpG sites og gen-tilstødende retroelements samtidigt over- eller undermethylated i et givet væv [11, 17], hvilket indikerer, at de samtidige methylering ændringer i mange gener er under indflydelse af retroelement methylering. I mellemtiden er de fleste CpG-rige øer er svagt methyleret eller ikke-methyleret i de fleste vævstyper, og CpG-rige lokaliteter er ikke egnede til analyse af dynamiske methylering støder op til gen-kontrolregioner [12, 13, 15, 18]. Derfor overgangsbestemmelserne-CpG sites, snarere end CpG-rige øer, vil sandsynligvis fungere som pivot-methylering positioner, der afspejler de samtidige methyleringsmønstre forbundet med H. pylori
infektion og udviklingen af ​​kræft.
Denne undersøgelse undersøgte overgangsbestemmelserne-CpG methylering mønstre af CpG-ø gener og maven-specifikke gener, der mangler CpG-øer i H. pylori
inficerede maveslimhinden og gastrisk kræft. Den variable methylering af overgangsperioden-CpG sites var semi-kvantitativt estimeret under strenge methylering-specifik PCR (MSP) betingelser, der producerede klare DNA-bånd [4, 8]. En stigning eller et fald i den overgangsperiode-CpG methylering af hvert gen blev bestemt på grundlag af en mellemliggende methylering i H. pylori
-negativ maveslimhinden.
Metoder
Indsamling af vævsprøver
Ikke-kræft vævsprøver blev indsamlet fra de fortløbende ambulante patienter, som gennemgik gastrisk endoskopi fra april 2008 til oktober 2009 St. Pauls Hospital, det katolske universitet i Korea. Under endoskopisk undersøgelse blev to tilstødende vævsprøver opnået fra maven antrum og kropsdelen henholdsvis. En biopsi prøve blev fikseret med formalin til histologisk undersøgelse og de andre biopsi prøve blev anvendt til DNA-ekstraktion. Patologen bekræftede en gastrisk epitel celleindhold på mere end 80% renhed i de biopsi væv. H. pylori
infektion blev undersøgt ved hjælp af Warthin-Starry sølv imprægnering metode. Denne undersøgelse omfattede 50 antrum og krop par i H. pylori
-negative tilfælde med en gennemsnitsalder på 53,2, og 50 antrum og krop par i H. pylori
-positive tilfælde med en gennemsnitsalder på 55,6. Der var 25 mænd og 25 kvinder i H. pylori
-negative tilfælde og 26 hanner og 24 hunner i H. pylori
-positive tilfælde. De mavekræft væv blev indhentet fra de patologiske eksemplarer af 48 mandlige og 22 kvindelige patienter (gennemsnitsalder: 63,7), der gennemgik kirurgisk resektion i perioden fra marts 2005 og december 2008 kl St. Pauls Hospital, det katolske universitet i Korea. Den clinicopathologic tumor fase blev bestemt i henhold til de Tumor-Node-Metastase (TNM) kriterier [19]. Alle de emner, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke, og denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle Review Board.
Tissue forberedelse og bisulfit modifikation af DNA
De friske biopsi prøver blev anvendt til mulige semi-kvantitativ MSP analyse, fordi formalin-fikseret væv DNA'er tendens til at være dårligt amplificeret efter bisulfit modifikation [8]. For mikrosatellit-analyse blev DNA'et ekstraheret fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede tumorvæv som tidligere [20, 21] beskrevet. De tumorprøver blev mikrodissekeres anvendelse af en kirurgisk skalpel under et stereomikroskop. Alle de Mikrodissekterede cancervæv indeholdt en kræftcelle-indhold på over 80%. Anvendelse af DNA ekstraktionsbuffer (0,5% Tween-20, 1 mM EDTA, pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinase K), de biopsiprøver og Mikrodissekterede væv blev fordøjet ved 37 ° C i 24 timer. Ca. 1.000 celler blev inkuberet med 20 pi af DNA ekstraktionsbuffer hvorefter en DNA-isolering kit (A1120, Promega, Madison, WI, USA) blev anvendt til at ekstrahere det genomiske DNA ifølge producentens anvisninger.
Tissue DNA blev modificeret under anvendelse natriumbisulfit som beskrevet andetsteds [8, 11-13]. Kort beskrevet blev 1 ug genomisk DNA behandlet med 10 pi 3 M NaOH i 15 minutter ved 37 ° C. Så det denaturerede DNA blev blandet med 1,04 ml 2,3 M natriumbisulfit og 60 pi 10 mM hydroquinon og dette blev opvarmet ved 50 ° C i 12 timer. Den bisulfit behandlede DNA, som blev oprenset ved anvendelse af Wizard DNA oprensning harpiks (Promega, Madison, WI, USA), blev desulfonerede med 3 M NaOH og fældet med ethanol, og derefter blev opløst i 35 pi 5 mM Tris-buffer (pH 8,0) .
Radioisotopaffald-mærkning semikvantitativ methylering analyse
Komparativ analyse af microarray og SAGE (Serial analyse af Gene Expression) data har konstateret, at antallet af udskrifter tælles i SAGE data præcist repræsenterer en stor forskel i genet aktivitet mellem maven-specifikke gener og husholdningsgener [4]. Overgangsbestemmelserne-CpG steder i mave-specifikke gener (PGA5
og PGC
) [22], slimhinden-healing gener (TFF1
og TFF2
) [23], kræft-relaterede gener (CDH1
, MLH1
, PPARG
, CDKN2A
og RUNX3
) [15, 24-27], og de ikke-gastrisk gener (ARRDC4
, DUSP6
, TRAPPC2L
, MSLN
og KRT6A
) [28-32] blev udvalgt (tabel 1). MSP sites, sekvenser og betingelser er vist i supplerende fil 1. Et lavt indhold GC og en repetitiv sekvens i methylering-variable overgangsperiode-CpG stedet ofte udviste svage eller udtvære MSP bands grund af den reducerede kompleksitet af nukleotidsekvenserne efter bisulfit behandling [4, 8, 33]. For at øge specificiteten af ​​overgangsperioden-CpG-amplifikation blev hver MSP primer sæt designet til at indeholde 3-5 CpG sites og til at omfatte en lille amplikonstørrelse, og MSP reaktionen blev udført under stringente betingelser med anvendelse af dTTP-radioisotop som tidligere beskrevet [4, 8, 11, 12]. Kort beskrevet 10 pi af en PCR-blanding, som indeholdt 1 pi bisulfit modificerede DNA, 1 pCi af α- 32P dTTP (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 62,5 pM dATP, dCTP og dGTP, 25 pM dTTP, 1 pmol af primere, blev 0,1% Tween 20 og 0,3 enhed Taq-polymerase
amplificeret ved 32 PCR-cykler under hot-start PCR-betingelser. De repræsentative methylering Resultaterne er vist i figur 1A.Table 1 Den nærmeste retroelement og transkriptionen af ​​de 14 udvalgte gener med og uden CpG-øer
Gene

CpG øer
Nærmeste retroelement
No. af udtrykte udskrifter i maven


navn familie
Afstand til transkriptionsstartsitet

CDH1
Ja
Alu
0,3 kb
19
ARRDC4
Ja
Alu
1,7 kb
7
PPARG

Ja
Alu
2,3 kb
3
CDKN2A
Ja
LTR
2,4 kb
1
TRAPPC2L

Ja
Alu
3,8 kb
14
DUSP6
Ja
Alu
6,6 kb
8
MLH1

Ja
Alu
6,6 kb
0
RUNX3
Ja
LTR
8,3 kb
0
PGA5
Nej
Alu
1,2 kb
734
PGC
Ingen
Alu
1,6 kb
33
TFF1
Nej
Alu
0,5 kb
11
TFF2
Nej
L1
2,7 kb
632
MSLN
Nej
Alu
1.4 kb
50
KRT6A
Nej
Alu
4,2 kb
en
oplysninger om CpG øer, retroelements og antallet af udtrykte udskrifter i maven blev opnået fra tidligere offentliggjorte oplysninger [4].
Figur 1 den semi-kvantitativ methylering analyse (A) og kloning og sekventering (B) i overgangsperioden-CpG sites. Methylering af overgangs--bindingssteder for CpG blev evalueret ved at udføre en semikvantitativ methyleringsanalyse (A), og det blev verificeret med kloning og sekventering af den fælles primer (B). (A) I alt 14 overgangsperiode-CpG sites blev undersøgt i H. pylori
ekskluderet og H. pylori
-positiv normal maveslimhinden og kræft læsion af gastrisk kræftpatienter. Methyleringen densitet blev beregnet efter den del af methylering (M) båndintensitet mod den samlede unmethylation (U) og methylering båndintensitet. Den methylering tæthed af hvert CpG hjemmeside blev klassificeret i 5 niveauer med 20% methylering tilvækst. status methylering af hvert gen blev kategoriseret som undermethylation (under-) eller overmethylation (over-) baseret på et mellemliggende methylering niveau (inter) af H. pylori
-negativ normal gastrisk mucosa. (B) Repræsentative resultater af kloning og sekventering af fælles PCR. Overgangsbestemmelserne-CpG steder i CDH1
, CDKN2A
og RUNX3
gener blev analyseret ved kloning og sekventering af den fælles PCR-produkt. De genomiske DNA'er repræsenteret i figur 1A blev anvendt til at sammenligne MSP resultater med sekventeringsresultaterne. De åbne og lukkede cirkler angiver methyleret og methyleret cytosinrester hhv. De rektangulære kasser angiver MSP primer sites.
Semikvantitativ evaluering af overgangsperioden-CpG methylering variation
PCR tilstand af hver MSP primer sæt blev valideret ved at plotte standardkurven ifølge forskellige blandinger af band intensitet fra MSP produkter med universel methyleret og umethyleret kontrol-DNA [11, 18]. Det genomiske DNA blev behandlet med DNA-methylase (CpGenome Universal Methyleret DNA, Chemicon, Temecula, CA, USA) og forstærkes af en universel primer (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 ') blev anvendt til den universelle methylerede og umethyleret kontrol-DNA, hhv. Baseret på standardkurven, blev methylering tæthed af overgangsperioden-CpG stedet beregnes ved hjælp af følgende formel: methylering andel (%) = (methylering intensitet /(methylering + unmethylation intensitet)) × 100 [8, 11, 13, 15, 18]. For at validere reproducerbarheden af ​​den variable densitet methylering under anvendelse af en semikvantitativ analyse blev klassifikation 5-niveau med 20% methylering tilvækst og klassificering 10-niveau med 10% methylering tilvækst sammenlignet i de parrede vævsprøver. Den sammenlignende analyse af de parrede prøver blev udført ved hjælp af de duplikerede DNA af de 40 væv og 48 par 1-cm-tilstødende væv ud over 100 par antrum og kroppens væv, der blev indhentet fra de 50 H. pylori
- negative mave væv og den 50 H. pylori
-positive mave væv (figur 2). Figur 2 Analyse af variabel methylering i overgangsperioden-CpG sites. (A og B) reproducerbarhed klassifikation 5-niveau med 20% methylering tilvækst (A) og 10-niveau klassifikationer med 10% methylering tilvækst (B) blev verificeret ved den andel af de parrede vævsprøver viser ingen forskelle i niveauet af methylering. De duplikerede DNA'er fra samme væv (lukkede søjler), et par 1-cm-tilstødende væv (grå søjler) og et par af antrum og kropsvæv (åbne søjler) blev sammenlignet. (C og D) Analyse af et mellemliggende methylering niveau. Hyppigheden af ​​undermethylated og overmethylated tilfælde blev estimeret baseret på et mellemniveau spænder to niveauer (20% methylering) (C) og et niveau (10% methylering) (D) for klassificering 10-niveau fælles i H. pylori
- negativ maveslimhinden.
overmethylation på hver overgangsperiode-CpG sted i H. pylori
-positive og ekskluderet maveslimhinden blev beregnet ved den relative andel af overmethylated sager til den samlede sum af den over- og under -methylated tilfælde. H. pylori
associeret overmethylation beregnedes under anvendelse af H. pylori
-positiv-til-negative forholdet mellem hver overgangsperiode-CpG-overmethylation sats. Dette blev anvendt til at vurdere forholdet mellem methylering af overgangs--bindingssteder for CpG, og afstanden mellem transkriptionsstartstedet og den nærmeste retroelement (figur 3). Figur 3 H. pylori
induceret methylering af CpG-ø-holdige og -lacking gener efter afstanden til de nærmeste retroelements og transskriptionen aktivitet. I alt 14 overgangsperiode-CpG steder blev grupperet i otte CpG-ø-gener (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
og RUNX3
) og seks gener mangler CpG-øer (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
og KRT6A
). Genet-retroelement afstand blev anslået mellem transkriptionelle start- sites og de nærmeste Alu, L1 eller LTR retroelements. Den H. pylori
induceret methylering sats blev repræsenteret af H. pylori
-positiv-til-negative forhold mellem overmethylation sats. Den overmethylation blev beregnet i henhold til den relative andel af overmethylated sager til den samlede sum af de over- og under-methylerede sager. Den transkriptionelle aktivitet af hvert gen blev vist med antallet af udtrykte transkripter [4].
Kloning og sekventering af methylering-variable websted
Den MSP Resultaterne af overgangs--bindingssteder for CpG blev bekræftet med kloning og sekventering af den fælles PCR primersæt dækker såvel methyleret og methyleret CpG sites (Figur 1B) [4, 11, 12]. PCR-produkterne i de fælles primersæt blev klonet ind i T & A kloningsvektor (Real Biotech, Taipei, Taiwan). DNA-sekventering blev udført i 10 kloner af de fælles PCR-vektorer ved hjælp af BigDye Termination Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) og en ABI automatiseret DNA-sekventeringsapparat (PE Biosystmes, Warrington, UK). Fordi de fælles primersæt dækker CpG-fattige regioner producerede forskellige grader af methylering ifølge PCR tilstand, vi justeret PCR tilstand fælles primersæt til opnåelse af methylering tæthed, der var ens i både semi-kvantitativ MSP-assay og sekventering resultater af de 10 fælles-PCR-kloner.
analyse af mikrosatellit-alleler
for PCR-baseret LOH analyse, i alt 40 mikrosatellitmarkører på otte cancer-associerede kromosomer (3p, 4p, 5q, 8 p, 9P , 13q, 17p og 18q) og retningslinjerne for at lave status LOH og MSI blev anvendt som beskrevet andetsteds [20, 21]. Den allele profil af de 40 mikrosatellit sekvenser undersøgt i hvert tilfælde blev oprindeligt kategoriseret i MSI baseret på tilstedeværelsen af ​​hidtil ukendte alleler i homozygot markør og den ensidige allele tab i den heterozygote markør. Efter antallet af LOH-positive kromosomer blev niveauet af LOH scoret som lavt niveau (to eller tre kromosomale tab, LOH-L) og høj-niveau (fire eller flere kromosomale tab, LOH-H) LOH. En eller ingen tab kromosomale blev klassificeret i baseline-niveau (LOH-B) for kræft diffuse-typen og ind i lavt niveau i tarm og blandet type, henholdsvis, afhængigt af deres tilsvarende histologiske subtype.
Statistisk analyse
Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligning af de over- og under-methylering ændringer mellem H. pylori
-negativ eller -positiv maveslimhinden og mavens cancere, med signifikans tildelt værdier under P
værdier mindre end 0,01 . Den Students t
test blev anvendt til sammenligning af methylering forskelle mellem de gastriske noncancerous og cancerøse væv, med signifikans tildelt værdier under P
værdier mindre end 0,05. Statistisk vurdering blev udført ved hjælp af statistisk programpakke SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Methylering-variation i noncancerous væv
I alt 14 overgangsperiode-CpG sites blev valgt fra otte CpG-ø-gener (CDH1
, ARRDC4
, PPARG
, CDKN2A
, TRAPPC2L
, DUSP6
, MLH1
RUNX3
) og seks CpG -island-mangler gener (PGA5
, PGC
, TFF1
, TFF2
, MSLN
og KRT6A
) (tabel 1). Reproducerbarheden af ​​overgangs--CpG stedet amplificeret ved hver MSP primer sæt blev evalueret med de duplikerede DNA'er fra samme væv, et par 1-cm-tilstødende væv og et par antrum og kropsvæv (figur 2A og 2B). 92% af de 40 duplikerede DNA, 73% af de 48 1-cm-tilstødende væv par, og 58% af de 100 antrum og krop par blev scoret som de samme methylering niveauer i klassifikationen 5-niveau. De samme-scoret tilfælde af duplikerede eksperimenter var ca. 25% hyppigere i klassifikation 5-niveau end i klassificeringen den 10-niveau.
Et mellemliggende niveau af variable overgangsperiode-CpG methylering blev analyseret ved hjælp af 1.400 MSP amplikoner af 14 overgangsperiode-bindingssteder for CpG opnået fra 100 H. pylori
-negative mave prøver (figur 2C og 2D). I klassificeringen den 10-niveau, den del af en enkelt fælles methylering niveau (38%) var så lav, at et mellemliggende niveau blev fastsat på grundlag af to almindelige niveauer. 937 (67%) af de 1.400 MSP amplikoner blev kategoriseret i et mellemliggende niveau i de 100 væv. Intermediate methylering niveauer af otte CpG-ø marginer tendens til at være lavere end seks CpG-ø-mangler sites (tabel 2). Samlet set store fraktioner af individuelle mave væv (67%) og 1-cm-tilstødende væv par (73%) viste, at overgangs--bindingssteder for CpG blev methyleret i en række ens vægtfylder varierende mellem ca. 20%. Derfor blev et mellemliggende niveau spænder to niveauer (20% methylering) af klassificering 10-niveau bruges til at bestemme over- eller under-methylerede status for overgangsordninger-CpG steder i den gastriske mucosa.Table 2 Hyppigheden af ​​under- og over- denatureret tilfælde som fastlægges på baggrund af mellemliggende methylering niveauer fælles i H. pylori
-negativ gastrisk mucosa (n = 100)
Gene navn

Intermediate methylering tæthed
No. af virksomheder methylerede sager
No. mellemliggende sager methylering
No. af over- methylerede sager
CpG-ø, som indeholder gener
CDH1
0 - 20%
0
79
21
ARRDC4

0 - 20%
0
80
20
PPARG
0 - 20%
0
60
40
CDKN2A

0 - 20%
0
54
46
TRAPPC2L
i 40 - 60%
13
81
6
DUSP6
20 - 40%
26
62
12
MLH1
20 - 40%
20
61
19
RUNX3
30-50%
5
53
42
CpG-ø mangler gener
PGA5
i 40 - 60%
10
78
12
PGC
i 40 - 60%
29
67
4
TFF1
20-40%
11
52
37
TFF2
30-50%
36
60
4
MSLN
60 - med 80%
0
88
12
KRT6A
60-80%
17
65
18
Forholdet mellem H. pylori
- associeret overmethylation enten retroelements eller transskription aktivitet
Hyppigheden af ​​over- og under-methylerede sager blev separat talt at estimere ændringer i den variable methylering af de midlertidige-CpG sites (tabel 3). På en analyse af de overmethylated tilfælde blev alle de CpG-ø margener betydeligt overmethylated i H. pylori
inficerede gastrisk mucosa og ingen af ​​de CpG-ø-mangler sites viste en signifikant forskel til frekvensen af ​​de overmethylated tilfælde . På en analyse af de undermethylated tilfælde, frekvensen af ​​den undermethylated TFF1
genet var signifikant lav i H. pylori
-positiv gastrisk mucosa (P
= 0,003). De methylering data for knoglemarv blev nævnt fra en tidligere undersøgelse under anvendelse af samme radioisotop-mærkning MSP-protokol [4]. I knoglemarven, det PGC
, TFF1
, MSLN
RUNX3
gener var helt denatureret, mens de fleste af de CpG-ø-gener var helt unmethylated.Table 3 Sammenligning af hyppigheden af ​​over- og undermethylated gener påvist i gastrisk ikke-kræft og kræft væv
Gene
noncancerous væv

mikrosatelitter genotype af gastrisk kræft (%)
knoglemarv

H. pylori
negative
(n = 100)
H. pylori
positiv
(n = 100)
LOH-B Hotel (n = 13)
LOH-L Hotel (n = 29)

LOH-H Hotel (n = 24)
MSI
(n = 4)
(n = 18) Hotel (%)

Overmethylation frekvens
CDH1
21
77 *
0 (0) *
7 (24)
3 (13)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
20
62 *
3 (23)
8 (28)
1 (4) *
1 (25 )
0 (0)
PPARG
40
82 *
5 (38)
7 (24)
6 (25)
en ( 25)
0 (0)
CDKN2A
46
90 *
9 (69)
16 (55)
9 (38)
2 (50)
4 (22)
TRAPPC2L
6
21 *
6 (46) *
8 (28) *
en (4)
1 (25)
0 (0)
DUSP6
12
36 *
3 (23)
3 (10)
1 (4)
2 (50)
0 (0)
MLH1
19
37 *
4 (31)
17 (59) *
11 ( 46)
3 (75)
0 (0)
RUNX3
42
85 *
10 (77)
26 (90) *
19 (79) *
4 (100)
18 (100)
PGA5
12
13
5 (38)
8 (28)
1 (4)
0 (0)
0 (0)
PGC
4
10
4 (31)
4 (14)
5 (21)
1 (25)
18 (100)
TFF1
37
52
5 (38)
3 (10) *
3 (13) *
0 (0)
18 (100)
TFF2
4
3
4 (31)
4 (14)
1 (4)
0 (0)
2 (11)
MSLN
12
11
8 (62) *
16 (55 ) *
6 (25)
1 (25)
18 (100)
KRT6A
18
16
4 (31)
16 ( 55) *
4 (17)
3 (75)
3 (17)
Undermethylation frekvens
CDH1
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
ARRDC4
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
PPARG
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CDKN2A
0
0
0 (0 )
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
TRAPPC2L
13
11
1 (8 )
2 (7)
7 (29)
1 (25)
16 (89)
DUSP6
26
25
3 (23 )
13 (45)
12 (50)
2 (50)
18 (100)
MLH1
20
18
7 (54 )
6 (21)
9 (38)
en (25)
17 (94)
RUNX3
5
1
0 (0 )
en (3)
2 (8)
0 (0)
0 (0)
PGA5
10
14
0 (0 )
3 (10)
5 (21)
0 (0)
0 (0)
PGC
29
18
4 (31 )
8 (28)
5 (21)
2 (50)
0 (0)
TFF1
11
1 *
7 ( 54)
19 (66) *
17 (71) *
3 (75)
0 (0)
TFF2
36
26
4 (31)
11 (38)
8 (33)
3 (75)
13 (72)
MSLN
0
0
0 (0)
en (3)
en (4)
2 (50)
0 (0)
KRT6A
17
16
3 (23)
3 (10)
3 (13)
en (25)
5 (28) Salg The gastrisk kræft blev kategoriseret i baseline-niveau LOH (LOH-B) , lavt niveau LOH (LOH-L), høj-niveau LOH (LOH-H) og mikrosatellit instabilitet (MSI). Detaljerne er beskrevet i materiale og metoder afsnittet.
* H. pylori
-positive gastrisk mucosa og gastrisk kræft blev sammenlignet med H. pylori
ekskluderet maveslimhinden. Signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af Fishers eksakte test (P
< 0,01).
Forholdet mellem den overgangsperiode-CpG methylering og afstanden til nærmeste retroelement blev evalueret ved brug af H. pylori
associeret overmethylation sats (figur 3). I de CpG-ø-gener, H. pylori-associeret
overmethylation var højere, når afstanden af ​​den nærmeste retroelement blev kortere. CpG-ø-mangler gener, viste ingen signifikant forskel methylering mellem H. pylori
-positiv og -negativ mucosa blev methyleret, uanset afstand af den nærmeste retroelement.
Methylering af overgangs--bindingssteder for CpG blev sammenlignet mellem maven og knoglemarv i form af transskriptionen aktivitet (tabel 1 og figur 4). CpG-ø-gen gruppe, der var svagt aktive i maven var mere methyleret i H. pylori
-negative og -positive væv end i knoglemarven. Af CpG-ø-mangler TFF2
og PGA5
gener, der blev mest stærkt udtrykt i maven, den gennemsnitlige methylering af den TFF2
genet var lavere end i knoglemarven (1,9) end i H. pylori
ekskluderet (2,6, P
= 0,015) og -positiv mucosa (2,7, P
= 0,015). Methylering af den PGA5
gen middelværdi var ens i knoglemarven (3.1) og H. pylori
ekskluderet (3,0) og -positiv mucosa (3,0). Den PGC
og TFF1
mave-specifikke gener, der svagt var aktive i maveslimhinden sammenlignet med de to master-mave-specifikke gener, var tæt denatureret i knoglemarven (gennemsnitlig methylering niveau, 4.3 og 4.8). Figur 4 methylering i knoglemarven og de gastriske noncancerous og cancerøse væv. Gennemsnitshøjden af ​​methylering i knoglemarven (●), H. pylori
-negativ gastrisk mucosa (■), at H. pylori
-positiv gastrisk mucosa (♦) og baseline-niveau LOH sager (

• Ikke almindelige slimhinder metastaser til stomach
• CD44, men ikke CD24-ekspression er forbundet med dårlig prognose i ikke-cardia adenocarcinom i stomach