metilação do promotor e expressão do gene TIMP3 no câncer gástrico

metilação do promotor e expressão do gene TIMP3 no câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
desenvolvimento de carcinoma gástrico é um processo multi-estágio que envolve mais de um gene. aberrantes alterações na metilação do ADN são considerados como o terceiro mecanismo que conduz à inactivação de anti-oncogenes, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento de tumores. Neste estudo, avaliou-se a relação entre a metilação aberrante do promotor CpG ilhas do inibidor tecidual de 3 gene metaloproteinase (TIMP3), a sua expressão de proteínas, e as características clinicopatológicas de adenocarcinoma gástrico.
Métodos
O estado de metilação do promotor ilhas CpG e a expressão da proteína do gene TIMP3 em tumores e tecidos da mucosa normais adjacentes de 78 pacientes com adenocarcinoma gástrico foram detectadas por PCR específicos de metilação (MSP) e imuno-histoquímica.
resultados of the CpG ilha de metilação de TIMP3 foi detectado em tecidos tumorais, tecidos de câncer adjacentes e linfonodos com metástases. De forma a aumentar, a frequência hipermetilação de estes tecidos eram de 35,9% (28 de 78 tecidos não neoplásicas), 85% (17 de 20 casos em fase inicial), 89.7% (52 de 58 casos de fase progressiva), e 100% (78 de 78 linfonodo metastático). Foi encontrada uma diferença marcante entre tumores e tecidos não neoplásicas (P Art < 0,05), mas não houve diferença entre os subgrupos de tumores (P
> 0,05). A análise imuno-histoquímica confirmou TIMP3 infra-regulação em tecidos tumorais. A taxa de expressão do gene TIMP3 foi de 100% nos tecidos não neoplásicas mas aparentemente diminuiu em graus diferentes em diferentes etapas, isto é, diminuiu para 30% (20/06) na fase inicial, a 3,4% (2/58) no estágio progressivo, e para 0% (0/78) em linfonodos metastáticos. Entre os 70 tecidos tumorais com expressão TIMP3 negativos, 64 (91,4%) foram hipermetilado e 6 foram não metilado (8,6%), indicando uma associação significativa entre a hipermetilação e reduziu ou expressão TIMP3 negativo (P Art < 0,01).
Conclusão
a hipermetilação da região promotora em ilhas CpG é o principal mecanismo da expressão do gene TIMP3 e pode fornecer evidências para o diagnóstico e estágio molecular avaliação de câncer gástrico.
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Palavras-chave
gástrica Adenocarcinoma Tissue Inhibitor da metaloproteinase 3 (TIMP3) Background metilação
o câncer gástrico (ou carcinoma gástrico) é uma das neoplasias mais comuns no mundo. o desenvolvimento da doença no câncer gástrico é um processo multi-estágio que envolve mais de um gene. factores doença acaba actuar em genes diferentes em diferentes fases, provocando uma alteração nos níveis de expressão e estrutura do gene que levam ao desenvolvimento da carcinogénese gástrica. A perda da função de um anti-oncogene pode ocorrer através de vários canais. Além deleções e mutações, mudanças aberrantes na metilação do ADN são considerados como o terceiro mecanismo que leva à inactivação de anti-oncogene [1, 2], que desempenha um papel essencial no desenvolvimento de tumores. ilhas de CpG, os quais são ricos em CpG sequências localizadas na região promotora a montante de um gene de manutenção, são regiões em que metilação da citosina em geral não ocorre, embora a estimulação por certos factores leva a sua metilação. Por conseguinte, a expressão de ADN é inibido nesta região [3]. A inactivação de muitos genes associados a tumores, tais como P16, THBS1, TIMP3, hMLH1, e MGMT estão relacionadas com a metilação das suas respectivas regiões promotoras [4-8]. inibidor tecidual da metaloproteinase-3 (TIMP3) está relacionada com o desenvolvimento de tumores, particularmente antagonizar a actividade de metaloproteinases de matriz, bem como inibir o crescimento do tumor, angiogénese, invasão e metástase [9].
Neste trabalho, foi detectada a metilação do promotor do gene TIMP3 ilha CpG e a expressão de proteínas em tecidos normais da mucosa gástrica, tecidos de cancro gástrico e linfonodos metastáticos de 78 pacientes com cancro gástrico utilizando PCR específicos de metilação (MSP) e imuno-histoquímica. Nós exploramos a correlação de metilação do promotor do gene com a sua expressão da proteína correspondente e, em seguida, analisada a relação de CpG island gene TIMP3 metilação anormal com o desenvolvimento, bem como as características clínicas e patológicas, de adenocarcinoma gástrico.
Materiais e métodos
materiais
Todos os 78 casos de tecido gástrico normal, carcinoma gástrico e linfonodos metastáticos foram verificados pelo diagnóstico patológico. As amostras de tumor foram obtidos entre março de 1998 a maio de 2005, o Primeiro Hospital Filiado e Liaoning Provincial Tumor Hospital de pacientes no pós-operatório com câncer gástrico (masculino: n
= 54; feminino: n
= 24), com uma idade média de 56,2 ± 7,5 anos. Entre as amostras obtidas, 20 eram de câncer gástrico precoce, 58 eram do cancro gástrico avançado, 44 ​​foram de diferenciação, e 14 foram indiferenciada. estadiamento do tumor foi baseada nos padrões de paragem Union Against Cancer Internacional TNM, digitação de câncer gástrico Crescimento Way e Estatuto Staging, e digitando câncer gástrico no Japão [10-12] da China Medical University Cancer Institute. Hidroquinona (10 mmol /L) e bissulfato de sódio (3,9 mol /L) foram adquiridos da Sigma. Um sistema de limpa-se o ADN foi adquirida a Promega. anticorpo TIMP3 e kit de SP foram adquiridos de Boster Biological Engineering Co., Ltd. (Dalian). Todas as amostras foram tratadas e tornados anónimos de acordo com os padrões éticos e legais. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Hospital da Província de Liaoning Tumor e China Medical University.
MSP
No método MSP [13], o processamento metilase foi realizado em células do sangue periférico normais e utilizados como controlos positivos. As células não tratadas foram usadas como controlos negativos. As sequências dos iniciadores metilados (TIMP3-M) e não metilados (TIMP3-U) foram como se segue: (1) sequências de iniciadores TIMP3-M, 5'CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTTCGGTTTTC-3 'e 5'-CCGAAAACCCCGCCTCG-3'; e (2) sequências de iniciadores TIMP3-U, 5'-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3 'e 5'-CCCCCCAAAAACCCCACCTCA-3'. As condições da reacção PCR foram as seguintes: 95 ° C desnaturação inicial de 5 min, 95 ° C, a desnaturação durante 30 segundos (40 ciclos), 59 ° C, emparelhamento durante 60 (40 ciclos), 72 ° C, extensão durante 60 s (40 ciclos ), e extensão a 72 ° C durante 10 min. Foram, então, realizada electroforese em gel de agarose e coloração com EB. Os dados dos géis foram recolhidos com um scanner de densidade de laser (Pharmacia LKB Ultroscan) e posteriormente analisados. Todos os experimentos foram repetidos três vezes, e o valor médio foi utilizado para análise estatística.
Imunohistoquímica
Para imuno-histoquímica, foi utilizado o método de coloração streptomycesavidin-peroxidase. coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Como critério de diagnóstico, a observação de um citoplasma amarelo acastanhado após coloração foi considerado um resultado positivo para a expressão TIMP3. Para os controlos, uma área de tecido normal foi corada, como controlo positivo, e uma secção de tecido normal foi utilizado como controlo negativo e coradas com STF em vez de um anticorpo primário. Pontuação padrão foi realizada de acordo com o método descrito por Shimizu [14]. Observou-se a intensidade ea distribuição das células positivas em alta ampliação coloração; nenhuma coloração foi pontuada como 0, coloração fraca, mas significativamente mais forte do que o controlo negativo foi pontuado como 1, uma mancha clara marcado, tal como 2, e uma mancha forte é pontuada como 3. Nenhuma célula de controlo positivo é pontuada como 0. O número necessário de células positivas, ou seja, < 30%, 30% -60%, e > 60%, foram marcados como 1, 2, e 3, respectivamente. Com base nos escores totais, as amostras foram avaliadas para a expressão TIMP3. Uma pontuação de ≤2 foi classificada como negativa, uma pontuação de 3 foi fracamente positivo, uma pontuação que varia 4-5 foi positivo, e uma pontuação de 6 foi fortemente positivo.
Análise estatística
As diferenças entre o TIMP3 taxa de metilação do promotor de genes e expressão de proteínas das amostras foram detectados e analisados ​​estatisticamente pelos ×
2 e métodos Fisher. Todos os dados foram analisados ​​com software estatístico SPSS12.
Resultado
gene TIMP3 análise de metilação do promotor
extraído DNA genómico a partir da amostra foi amplificado por MSP. Os tamanhos dos produtos de PCR metilados e não metilados foram 116 e 122 pb, respectivamente. gene TIMP3 fenômeno metilação do promotor foi geralmente observada em tecidos normais gástricas, carcinoma gástrico, e amostras de metástases em linfonodos. As taxas de detecção positivos foram como se segue: 85% (17/20) para o cancro gástrico precoce, 89,7% (52/58) para o cancro gástrico avançado, 98,7% (77/78) para linfonodos metastáticos, e apenas 35,9% (28 /78) para o tecido gástrico normal. Um aumento significativo no gene TIMP3 metilação do promotor foi observada em todos os grupos do cancro gástrico (P
< 0,01; Figura 1 e Tabela 1), o que sugere que a metilação do gene TIMP3 podem estar envolvidos na carcinogénese e metástase de tumores de cancro gástrico e tecidos de nódulos linfáticos metastáticos. Figura 1 metilação-específica PCR (MSP): 1, controle normal (tecido gástrico normal); 2, câncer gástrico precoce; 3, câncer gástrico avançado; 4, a transferência de linfonodo. M, marcador DL2000; m, fragmento de amplificação de metilação; u, fragmento de amplificação unmethylation.
Tabela 1 gástrica carcinoma TIMP3 promotor metilação e expressão da proteína
Organizações
n (%)
TIMP3 promotor metilação
proteína TIMP3 expressão
positiva
positiva
estômago normal
78
28 (35,9)
78 (100,0)
precoce do câncer gástrico
20
17 (85,0)
9 (45,0)
câncer gástrico avançado
58
52 (89,7)
21 (36,2)
metástases linfonodais
78
77 (98,7)
12 (15,4)
análise imunohistoquímica da expressão da proteína TIMP3
expressão da proteína TIMP3 foi positivo em todos os 78 casos de tecido gástrico normal (100%). Entre os casos de carcinoma gástrico, 9 em cada 20 pacientes foram positivos para câncer gástrico precoce; 11 casos foram negativos (55%), 21 casos foram positivos, e 37 foram negativas (63,8%) em 58 casos de câncer gástrico avançado; e 12 casos foram positivos e 66 casos foram negativos (84,6%) em 78 pacientes com gânglios linfáticos gástricos metastáticos. A expressão TIMP3 reduzida que foi observada nos grupos de cancro gástrico verificou-se ser estatisticamente significativo (P
< 0,01; Figura 2 e Tabela 1), o que sugere que a taxa de expressão da proteína TIMP3 diminuída em tumores de cancro gástrico e tecidos de linfonodos metastáticos . Esta redução da expressão da proteína do gene pode ser devido ao aumento observado anteriormente em metilação TIMP3 nas amostras de cancro gástrico porque metilação é conhecida por suprimir a expressão da proteína. a expressão da proteína TIMP3 foi localizado principalmente no citoplasma das glândulas normais. Em algumas células, uma pequena quantidade de expressão foi encontrado nas membranas de células (Figura 2). Nas células normais da mucosa gástrica, não se observou qualquer destruição estrutura glandular e coloração não foi significativamente reduzida. As glândulas câncer gástrico precoce mostrou danos estruturais e coloração de células de câncer fraco. Os avançados tecidos com cancro gástrico mostraram grandes áreas de crescimento maciço (carcinoma indiferenciado) e, além das células individuais, o resto não foram coloridos. Figura 2 TIMP3 imunoistoquímica de proteínas (SP 400 ×): um tecido gástrico normal; b, câncer gástrico precoce; c, cancro gástrico avançado; d, transferência de linfonodo.
Relação entre o gene TIMP3 metilação do promotor e a expressão da proteína TIMP3
No grupo do cancro gástrico avançado, a taxa de metilação TIMP3 foi significativamente maior do que os tecidos em crescimento e lumpish aninhados (100% vs 77,8%, respectivamente, P
< 0,01). A taxa de metilação TIMP3 em linfonodos metastáticos no grupo ≥7 tecidos foi significativamente maior do que a < 7 grupo tecido (100% vs 83,3%, respectivamente; P
< 0,05). O grupo subseroso e serosa do tecido foi significativamente maior do que o grupo de tecido da submucosa e do miométrio (91,3% e 96,6% vs. 50%, respectivamente; P
< 0,05). Aumento da taxa de metilação do gene TIMP3 foi geralmente observada no crescimento difuso-like, metástases em linfonodos (≥7) e tumores subserosos e serosa, o que implica que existia nenhuma relação entre metilação TIMP3 gene eo tamanho do tumor, tipo macroscópico, e tipo histológico. A taxa positiva dos 58 casos de tecidos de câncer gástrico avançado foi de 36,2% (21). a expressão da proteína TIMP3 em tecidos em crescimento em massa e aninhado foi significativamente maior do que a dos tecidos de crescimento difuso-like (55,6% vs.19.4%, respectivamente; P
< 0,01). a expressão da proteína TIMP3 no nódulo linfático metastático ≥7 tecidos foi significativamente maior do que a < 7 tecido (47,2% vs 18,2%, respectivamente; P
< 0,05) (Tabela 2). Estes resultados sugerem que a diminuição da taxa de expressão da proteína TIMP3 foi mais comum no crescimento e no linfonodo metastático difuso-like (≥7) tumores, mas a expressão reduzida não estava relacionado com o tamanho do tumor, o tipo bruto, tipo histológico e profundidade de invasion.Table 2 relação entre avançada metilação patologia câncer TIMP3 gástrico e seu nível de expressão da proteína
Índice
n
metilação do promotor TIMP3
tamanho do tumor proteína TIMP3

O tamanho do tumor (cm) Art < 5
5 Sims 3 (60,0)
1 (20,0)
5-10
45
42 (93,3)
18 (40,0) Art > 10
8
7 (87,5) Página 2 (25,0)
tipos gerais
Borr.2
12
10 (83,3 )
4 (33,3)
Borr.3
37
33 (89,2)
15 (40,5)
Borr.4
9
9 (100,0)
2 (22,2)
diferenciação histológica
Diferenciada
44
39 (88,6)
17 (38,6)
indiferenciado
14
13 (92,9)
4 (28,6) padrão
Crescimento
Tufos + aninhada
27
21 (77,8)
15 (55,6)
difuso como
31
31 (100,0 ) b
6 (19.4) b
metástase linfática Art < 7
36
30 (83,3)
17 (47,2)
≥7
22
22 (100,0) uma página 4 (18,2)
uma infiltração
submucosa muscular
6 Sims 3 (50,0)
1 (16,7)
subseroso
23
21 (91,3) uma
9 (39,1)
Serosa
29
28 (96,6)
11 (37,9)
aP Art < 0,05, a BP Art < 0,01.
Discussão
A formação de malignidade é multifactorial e ocorre em múltiplos estágios. As características biológicas de tumores malignos incluem crescimento invasivo e metástases. O mecanismo por trás do desenvolvimento do tumor envolve mudanças anormais na estrutura e função do gene no interior da célula. teóricos modernos considerar que o processo de formação de tumores compreende dois mecanismos principais: o primeiro é a nível genético, isto é, faz com mutação do gene da sequência de nucleótidos de ADN muda; ea segunda é no nível epigenético. Estudos anteriores concentraram-se em mudanças na expressão gênica que são herdadas através da meiose e não envolvem uma mudança na sequência de DNA, mas afetam a função de regulação da expressão e o gene do DNA, principalmente por modificação química. Este mecanismo está a ganhar cada vez mais atenção dos investigadores de processos de formação de tumor [15, 16].
No DNA de tecidos tumorais, Abberant metilações são frequentemente observadas em regiões promotoras de genes, incluindo o oncogene em hipometilação. Este gene está intimamente relacionado com ciclo de proliferação celular e hipermetilação de genes supressores de tumor. Estas alterações anormais de metilação podem activar oncogenes [17-19], e inibir a transcrição de ARNm de genes supressores de tumor [20], que conduz à inactivação do gene. metilação aberrante no ADN ocorre através da presença de ilhas CpG metilados altamente na extremidade 5 'de uma região de controlo do promotor. A família TIMP de proteínas tem quatro membros: TIMP-1, 2, 3 e 4. O TIMP-1, 2, e 4 são proteínas secretoras solúveis. Em contraste, o TIMP-3 é uma proteína não-solúvel que combina com a matriz extracelular, está localizada na membrana celular externa [21], e pode estar estreitamente relacionado com a membrana basilar. A função de TIMPs, é a inibição do factor de necrose tumoral-α (TNF-α) -Converter enzimas e a indução de morte celular programada através do receptor de TNF-α estável da superfície da célula [22]. A indução da apoptose por meio de TIMP ocorre por duas vias: a MMP dependentes e independentes. Embora o TIMP-3 e 4 têm uma elevada afinidade para a MMP-2, as proteínas inibem efectivamente a MT1-MMP, activando assim o processo de MMP-2 zimogénio e inibir o crescimento de células tumorais e metástases. Smith et ai. [23] verificaram que a expressão de TIMP-3 em linhas celulares de cancro do cólon humano são raras na mitose. A maioria das células são presos na fase G1, embora a aplicação do anticorpo para o TNF-α diminui paragem da mitose por 70%.
Para explorar o relacionamento entre TIMP3 e cancro gástrico, bem como o seu mecanismo na inactivação gástrica, foram detectados genes TIMP3 5 'hipermetilação ilha CpG na mucosa normal gástrico, carcinoma gástrico e gânglios linfáticos metastáticos. Nós descobrimos que em > 85% de todos os tecidos de cancro gástrico, o gene TIMP3 5 'ilha CpG exibiram metilação aberrante que foi significativamente maior (P
< 0,01) do que a do grupo de tecido gástrico normal, o que implicava que TIMP3 promotor do gene da ilha CpG metilação reduzida expressão do gene TIMP3 e foi, assim, o principal mecanismo supressor tumoral-inactivação no câncer gástrico. Gagnon et al. [24] relataram que, em todas as linhas de células de cancro MCF-7 pulmonares com perda de expressão de ARNm de TIMP3 e promotor do gene TIMP3 ilha CpG metilação, desmetilação foi induzida por 5-Aza-CdR. expressão TIMP3 antes e depois 5-Aza-CdR de indução foi avaliada por RT-PCR, que mostrou que a desmetilação resultou em TIMP3 gene re-expressão, consistente com os nossos resultados.
No presente estudo, todos os 78 casos de tecido gástrico normais foram positivas para a expressão da proteína TIMP3. Entre estes 78 casos, apenas 28 (35,9%) foram positivos para a metilação. Entre os 20 pacientes com cancro gástrico precoce, 9 foram positivas para a expressão da proteína TIMP3 e 17 (85%) foram positivos para a metilação. Entre os 58 casos de cancro gástrico avançado, 21 foram positivas para a expressão da proteína TIMP3 e 52 (89,7%) foram positivos para metilação. Entre os 78 casos de linfonodos metastáticos, 12 foram positivas para a expressão da proteína TIMP3 e 77 casos (98,7%) foram positivos para a metilação. Aumento da taxa de metilação foi significativa entre o câncer precocemente, o câncer avançado, e amostras dos nódulos linfáticos metastáticos em comparação com amostras de tecido normal (P
< 0,01), confirmando que a perda de expressão da proteína TIMP3 foi estreitamente relacionado com promotor do gene TIMP3 CpG ilha metilação. Feng HF et ai. [25] relatou os mesmos resultados em JAR e JEG-3 linhas celulares de coriocarcinoma. Portanto, nosso estudo confirmou que promotor do gene TIMP3 CpG ilha metilação foi a principal razão para a expressão da proteína TIMP3 reduzida no câncer gástrico.
Entre as 58 amostras de cancro gástrico avançado, 52 foram positivas para o promotor TIMP3 CpG ilha metilação e 21 foram positivos para a expressão da proteína TIMP3. Esta constatação sugeriu que, além da CpG island methylation, outros factores tais como a variação genética fez com que a ausência de expressão do gene TIMP3. Nas nossas experiências, 34 amostras foram positivas para a metilação, e unmethylation foi geralmente interpretado como se segue: estado de metilação incompleta de genes podem existir, e se o tecido tumoral é misturado com as células não tumorais, um produto de PCR positivo para unmethylation (por MSP com iniciador não metilado) podem ser observadas. a expressão da proteína TIMP3 da amostra foi negativa, portanto, essas amostras foram definidos como metilação positivo.
Na China, a taxa de sobrevida em 5 anos de pacientes com carcinoma gástrico é apenas cerca de 40% após a ressecção. O mau prognóstico está associado com extensa invasão local e /ou linfonodo metástases regionais [26]. recorrência local permanece como uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer após a ressecção em pacientes com câncer gástrico [27]. Por isso, devem ser estabelecidos critérios fiáveis ​​para a previsão de recorrência e identificação de tumores compreender os processos moleculares e celulares, bem como descobrir novas e possíveis alvos moleculares terapêuticos [28].
Kerbel [29] relatou que subclonagem células tumorais com potencial metastático tem uma vantagem de crescimento na fase inicial do foco primário. A razão para tal é que a vantagem do crescimento da população de células metastática do subclone pode segregar um factor particular ou factor de crescimento de célula local, causando, assim, uma reacção que resulta em especial de crescimento selectivo. A detecção de níveis de marcadores moleculares em amostras de tumor primário pode reflectir as características gerais metastáticas de todo o tumor. Neste grupo, as taxas de metilação foram apenas 35,9% para os tecidos normais gástricos, 85% e 89,7% para os primeiros e cancros avançados, respectivamente, 98,7% para os nódulos linfáticos metastáticos. Consistentemente a expressão da proteína de alta TIMP3 foi observada apenas em tecidos gástricos normais. cancros iniciais e avançados gástricos apresentaram fraca expressão focal, e gânglios linfáticos metastáticos quase não mostrou expressão positiva. Esta constatação sugeriu que TIMP3 metilação aumentada com a progressão do tumor e que a expressão da proteína diminui gradualmente. Por conseguinte, a vantagem potencial de crescimento e metástase de células aumentou gradualmente, resultando finalmente na metástase. Yegnasubramanian et ai. [30] relataram que a metástase do tumor foi relacionada com a metilação TIMP3 em linhas celulares de cancro da próstata como revelado pela MSP em tempo real de amostras de 73 pacientes com cancro da próstata mais cedo, 91 pacientes com cancro da próstata metastático e 25 casos com tecido prostático. Este resultado implica uma relação entre CpG metilação e a classificação e o progresso do câncer de próstata. TIMP3 gene de metilação supostamente desempenha um papel importante no processo de metástase, e a detecção da metilação de CpG TIMP3 tem algum valor prático na previsão do potencial metastático do tumor primário.
TIMP3 tem uma elevada frequência de variação genética em muitos tipos de humano tumores malignos, incluindo as mutações, deleções, metilação, translocação cromossómica, e assim por diante [31]. Estas mutações resultam na perda da função normal de um gene supressor de tumor, ou seja, a inibição da proliferação de células (isto é, a inactivação do gene) e está estreitamente relacionada com o desenvolvimento de cancro [32]. No entanto, poucos estudos têm sido realizados sobre modificação genética TIMP3 no cancro gástrico primário, e os resultados destes estudos mostram resultados discrepantes de uma taxa de eliminação baixo gene para nenhuma mutação em tudo. Deste modo, outros mecanismos de inactivação de cancro gástrico envolvem gene TIMP3 têm sido investigadas [33]. Assim, a complexidade da patogénese do tumor não é apenas um reflexo de alteração genética por mutação ou deleção mas também uma reflexão de alterações epigenética, tais como a metilação do DNA. Um estudo em profundidade da relação entre a metilação do DNA e expressão gênica, bem como o seu mecanismo correspondente, é recomendado porque os resultados podem orientar o tratamento clínico de câncer.
Declarações
Financiamento
O estudo foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.271.477) e do projeto patrocinado pela Fundação de Pesquisa científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses, Ministério de Educação do Estado (No. 2002-247). submetidos arquivos originais
dos autores para imagens
Abaixo estão os links para os arquivos originais submetidos dos autores para imagens. 'arquivo original para a figura 1 13000_2013_791_MOESM2_ESM.tiff Autores' 13000_2013_791_MOESM1_ESM.jpeg Autores arquivo original para a figura 2 Competindo Grupos de Interesse Os autores declaram que não têm interesses conflitantes entre si. contribuições
dos autores
ZG e JZ realizados os exames patológicos e PCR, DD e ZG analisou os dados e ZG redigido o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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