Promoter-Methylierung und die Expression von TIMP3 Gen bei Magenkrebs

Promoter-Methylierung und die Expression von TIMP3 Gen bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkarzinom Entwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, der mehr als ein Gen beinhaltet. Aberrant Veränderungen in der DNA-Methylierung als der dritte Mechanismus betrachtet, der anti-Onkogen Inaktivierung führt, die eine wesentliche Rolle bei der Tumorentstehung spielt. In dieser Studie untersuchten wir die Beziehung zwischen der anomale Methylierung des Promotors CpG-Inseln von Gewebeinhibitor von Metalloproteinase-3 (TIMP3) Gen, dessen Proteinexpression und die klinisch-pathologischen Eigenschaften von Adenokarzinom des Magens.
Methoden
Der Methylierungsstatus der Promotor CpG-Inseln und die Proteinexpression von TIMP3-Gens in Tumoren und angrenzenden normalen Schleimhautgewebe von 78 Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens durch Methylierung-spezifische PCR (MSP) und Immunhistochemie nachgewiesen wurden.
Ergebnisse
die CpG-Insel-Methylierung von TIMP3 wurde in Tumorgewebe, Krebs-benachbarten Geweben und Lymphknoten mit Metastasen nachgewiesen. In aufsteigender Reihenfolge, die hypermethylation Frequenz dieser Gewebe waren 35,9% (28 von 78 nicht-neoplastischen Geweben), 85% (17 von 20 im Frühstadium Fälle), 89,7% (52 von 58 progressiven stufigen Fälle) und 100% (78 von 78 metastatischen Lymphknoten). Ein deutlicher Unterschied zwischen Tumoren und nicht-neoplastischen Gewebe (P
< 0,05), aber keinen Unterschied gab es zwischen den Untergruppen von Tumoren (P
> 0,05). Immunhistochemie-Analyse bestätigte TIMP3 Herunterregulation in Tumorgeweben. Die Rate des TIMP3 Genexpression war zu 100% in nicht-neoplastischen Geweben aber anscheinend verringert in unterschiedlichem Ausmaß in den verschiedenen Phasen, dh verringerte sich auf 30% (6/20) in dem frühen Stadium auf 3,4% (2/58) bei der progressive Phase, und auf 0% (0/78) bei metastasierendem Lymphknoten. Unter den 70 Tumorgewebe mit negativen TIMP3 Ausdruck, 64 (91,4%) wurden hypermethyliert und 6 waren nicht methylierten (8,6%), eine signifikante Assoziation zwischen Hyper anzeigt, und reduziert oder negative TIMP3 Ausdruck (P
< 0,01).
Fazit
in CpG-Inseln die Hypermethylierung der Promotorregion der Hauptmechanismus der TIMP3 Genexpression ist und Beweise für die Bewertung von Magenkrebs molekulare Diagnostik und Stufe bereitstellen kann.
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Schlüsselwörter Adenokarzinom des Magens Gewebeinhibitor von Metalloproteinase 3 (TIMP3) Methylierungs Hintergrund
Magenkrebs (oder Magenkarzinom) ist einer der häufigsten malignen Erkrankungen in der Welt. Krankheitsentwicklung bei Magenkrebs ist ein mehrstufiger Prozess, der mehr als ein Gen beinhaltet. Krankheitsfaktoren wirken letztlich von unterschiedlichen Genen in verschiedenen Phasen, eine Änderung in Genstruktur und Expressionsniveaus verursachen, die für die Entwicklung von Magenkrebsentstehung führen. Verlust der Funktion eines Anti-Onkogen kann durch verschiedene Kanäle auftreten. Zusätzlich zu Deletionen und Mutationen, aberrant Veränderungen in der DNA-Methylierung als der dritte Mechanismus, was zu anti-Onkogen Inaktivierung [1, 2] betrachtet, die eine wesentliche Rolle in der Tumorentstehung spielt. CpG-Inseln, die in dem stromaufwärts gelegenen Promotorregion eines housekeeping Gens CpG-reichen Sequenzen sind, sind Bereiche, bei denen Cytosin-Methylierung im allgemeinen nicht auftritt, obwohl Stimulation durch bestimmte Faktoren auf seine Methylierungs führt. Folglich wird die DNA-Expression in diesem Bereich gehemmt [3]. Die Inaktivierung von vielen tumorassoziierten Genen wie P16, THBS1, TIMP3, hMLH1, MGMT und an die Methylierung der jeweiligen Promotorregionen bezogen [4-8]. Gewebeinhibitor von Metalloproteinase-3 (TIMP3) auf Tumorentwicklung verbunden ist, insbesondere der Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen sowie die Hemmung von Tumorwachstum, Angiogenese, Invasion und Metastasierung [9].
In dieser Arbeit entdeckten wir die Methylierung Antagonisierung des TIMP3 Genpromotor CpG Insel und Protein-Expression in normalen Geweben Magenschleimhaut, Magenkrebsgewebe, und metastatischen Lymphknoten von 78 Patienten mit Magenkrebs unter Verwendung methylierungsspezifische PCR (MSP) und Immunhistochemie. Wir untersuchten die Korrelation von Gen-Promotor-Methylierung mit seinem entsprechenden Proteinexpression und dann analysiert, um die Beziehung des TIMP3 Gen CpG Insel abnormal Methylierung mit der Entwicklung, sowie klinischen und pathologischen Merkmale von Adenokarzinom des Magens.
Materialien und Methoden
Materialien
Alle 78 Fälle von Magen-Normalgewebe, Magenkarzinom und Lymphknotenmetastasen durch pathologische Diagnose verifiziert wurden. (:; Weiblich n = 54
: n
= 24 männlich) mit einem mittleren Alter Die Tumorproben wurden von März 1998 bis Mai 2005 im Ersten Affiliated Hospital und der Provinz Liaoning Tumor Krankenhaus von postoperativen Patienten mit Magenkrebs erhalten von 56,2 ± 7,5 Jahre. Unter den Proben erhalten, 20 von Magenfrühkarzinomen waren, 58 von fortgeschrittenem Magenkrebs waren, waren 44 der Differenzierung, und 14 waren undifferenziert. Tumor-Staging wurde auf der Grundlage der Internationalen Union gegen Krebs TNM-Standards, Typisierung von Magenkrebs Wachstum Weg und Statut von Staging und Magenkrebs Typisierung in Japan [10-12] von der China Medical University Cancer Institute. Hydrochinon (10 mmol /l) und Natriumhydrogensulfat (3,9 mol /L) wurden von Sigma bezogen. Ein DNA-Reinigungssystem wurde von Promega bezogen. TIMP3 Antikörper und SP-Kit wurden von Boster Biological Engineering Co., Ltd (Dalian) erworben. Alle Proben wurden behandelt und anonymisiert nach den ethischen und rechtlichen Standards. Das Protokoll, das von der Medizinischen Ethikkommission der Provinz Liaoning Tumor Hospital und China Medical University genehmigt wurde.
MSP
Im MSP-Methode [13], Methylase Verarbeitung wurde als positive Kontrollen auf normalen peripheren Blutzellen und verwendet durchgeführt. Unbehandelte Zellen wurden als negative Kontrollen verwendet. Die Sequenzen der methylierten (TIMP3-M) und unmethylierter (TIMP3-U) Primer waren wie folgt: (1) TIMP3-M-Primersequenzen, 5'CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTTCGGTTTTC-3 'und 5'-CCGAAAACCCCGCCTCG-3'; und (2) TIMP3-U-Primersequenzen, 5'-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3 'und 5'-CCCCCCAAAAACCCCACCTCA-3'. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 ° C anfänglichen Denaturierung für 5 min, 95 ° C Denaturierung für 30 s (40 Zyklen), 59 ° C Annealing für 60 s (40 Zyklen), 72 ° C Erweiterung für 60s (40 Zyklen ) und 72 ° C Verlängerung für 10 min. Agarose-Gelelektrophorese und EB-Färbung wurden dann durchgeführt. Daten aus den Gelen wurden mit einem Laser-Scanner Dichte (Pharmacia LKB Ultroscan) und anschließend analysiert gesammelt. Alle Experimente wurden dreimal wiederholt, und der Mittelwert wurde für die statistische Analyse verwendet.
Immunhistochemie
Für Immunhistochemie, wir haben das streptomycesavidin-Peroxidase-Färbung. Immunhistochemische Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Als diagnostisches Kriterium wurde die Beobachtung einer bräunlich-gelbe Zytoplasma nach der Färbung ein positives Ergebnis für TIMP3 Ausdruck betrachtet. Für die Kontrollen wurde ein normaler Gewebebereich als positive Kontrolle gefärbt, und ein Abschnitt normales Gewebe wurde als Negativkontrolle und gefärbt mit PBS anstelle eines primären Antikörpers eingesetzt. Scoring-Standard wurde nach dem Verfahren von Shimizu [14] beschrieben durchgeführt. Wir beobachteten die Färbungsintensität und Verteilung von positiven Zellen bei hoher Vergrößerung; keine Färbung als 0, schwache Färbung erzielt wurde, aber deutlich stärker als die negative Kontrolle als 1 erzielt wurde, ist ein klarer Fleck als 2 erzielt und eine starke Fleck als 3. Keine positive Kontrollzelle erzielt wird erzielt als 0. Die erforderliche Anzahl der positiven Zellen, das heißt < 30%, 30% -60% und > 60%, wurden als 1, 2 bzw. 3 erzielt. Bezogen auf die Gesamtergebnisse, wurden die Proben TIMP3 Ausdruck bewertet. Eine Punktzahl von ≤2 wurde als negativ eingestuft, war ein Wert von 3 schwach positiv, eine Punktzahl von 4 auf 5 bis hin positiv war, und eine Punktzahl von 6 war stark positiv. Die statistische Analyse
die Unterschiede zwischen den TIMP3
Gen-Promotor-Methylierung Rate und Proteinexpression der Proben wurden detektiert und statistisch analysiert durch den χ
2 und Fisher Methoden. Alle Daten wurden mit SPSS12 Statistik-Software analysiert.
Ergebnisse

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