análise de linhagem de adenocarcinomas tubulares iniciais e avançados do estômago: contínua ou descontínua

análise de linhagem de adenocarcinomas tubulares iniciais e avançados do estômago:? contínuas ou descontínuas da arte abstracta
Fundo
Erradicação do carcinoma gástrico precoce (GC) é pensado para contribuir para a redução na mortalidade de GC, dado que a maioria do início do progresso GCs aos GCs avançados. No entanto, no início de GC é alternativamente considerada uma variante dormente de CG, e isso raramente progride para GC avançada. O objetivo deste estudo foi o de esclarecer a extensão da sobreposição de linhagens genéticas entre o início e adenocarcinomas tubulares avançados (banheiras) do estômago.
Métodos
coloração imuno-histoquímica de p53 foi realizada utilizando 28 estômagos cirurgicamente ressecados com 13 intramucoso e 15 banheira invasivos. Por hibridização genômica comparativa chromosome- e baseada em array (CGH), genômica constituição número de cópias foi comparado entre a mucosa e peças invasivos das banheiras invasivos e entre as partes mucosas das banheiras invasivos e intramucoso, utilizando 25 e 22 banheiras, respectivamente. TP53
mutação em exons 5-8 foi examinada em 20 banheiras.
Resultados
cromossômica CGH revelou que 4q + e 11q + foram mais comuns em banheiras avançados e iniciais, respectivamente, enquanto que o número de cópias muda em 8q e 17p mostrou diferenças não significativas entre banheiras precoces e avançados. No entanto, array CGH revelou que, dos 13 banheiras intramucoso examinados, perda de MYC
(MYC Restaurant -) eo ganho de TP53
(TP53
+) foi detectado em 9 banheiras e MYC
+ e /ou TP53 viajantes - foi detectado em 3 banheiras. Das amostras de mucosa de 9 banheiras invasivos, 7 apresentaram MYC viajantes - /TP53
+ e nenhum mostrou MYC
+ e /ou TP53 Restaurant -. Dos 9 amostras das partes invasivos, uma (a partir de cancros da submucosa) mostrou MYC
- /+
TP53 e 6 (1 a partir da submucosa e 5 a partir de cancros avançados) mostrou MYC
+ e /ou TP53
-. Os últimos 6 tumores geralmente mostrou um padrão mutante (difuso ou null) em imuno-histoquímica p53, e 4 dos 6 tumores passíveis de avaliação para TP53
análise da sequência revelou mutações. A matriz CGH padrão geral indicou que, entre a mucosa e peças invasivos, linhagem genética foi encontrada descontínua em 5 cancros avançados e contínua em 3 cancros da submucosa.
Conclusões
linhagens genéticas muitas vezes diferiu entre início e avançados banheiras. MYC viajantes - /TP53
+ e MYC
+ e /ou TP53.
- Podem ser as assinaturas de banheiras de dormentes e agressivas, respectivamente, no estômago
Fundo
O câncer gástrico continua a ser a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, apesar da diminuição recente na sua taxa de mortalidade nos países desenvolvidos [1]. carcinomas gástricos (GCs) são classificados morfologicamente em 2 categorias principais: tipo e tipo difuso de formação de tubular [2, 3] e, no estadiamento, em cânceres precoces (que envolvem a mucosa ea submucosa) e cancros avançados (que envolvem a muscular própria ou Deeper). GC precoce é considerado um cancro curável [4]; que supostamente progride para GC avançada após durações variáveis ​​como um estágio inicial de GC [5, 6]. No Japão, cedo GCs pode ser activamente ressecado por via endoscópica, bem como cirurgicamente [7], baseado nos princípios da detecção e tratamento precoce. Por outro lado, alguns patologistas consideram que as lesões neoplásicas de formação de tubulares que estão confinados à mucosa levar um longo tempo ou não são capazes de invadir os tecidos mais profundos. Com isso, essas lesões são chamadas de displasia [4].
Recentemente, um programa de rastreio em massa para neuroblastomas no Japão [8-10] foi suspenso por uma linhagem genética descontínua foi encontrada entre a precoce e os neuroblastomas apresentadoras de atraso. neuroblastomas negativos e tardias apresentadoras (≥1 ano) mostrou quase diploidia com perda de terminal de 1p, enquanto neuroblastomas positivos em crianças mostraram quase triploidia sem 1p exclusão [11, 12]. Por outro lado, a hibridação genómica (CGH) com base na análise comparativa sugeriu que o alto grau de hiperplasia adenomatosa atípica no pulmão é o verdadeiro precursor do carcinoma broncoalveolar [13]. No estômago, o que é um problema em que medida linhagem genética é sobreposto no início e avançado GCs.
No tipo difuso GCs, usamos CGH para demonstrar que alterações cromossômicas número de cópias nos carcinomas de células intramucoso anel de sinete que mostravam uma estrutura em camadas [14] foram herdados em uma fração de GCs pouco diferenciado em estágios avançados [15]. A presença de uma estrutura em camadas de células em anel de sinete nas partes da mucosa destes cancros avançados também sugerido que os carcinomas de células anel de sinete pode ser um verdadeiro precursor de GCs pobremente diferenciadas. análise de linhagem baseada-CGH de um outro subconjunto dos GCs avançada pobremente diferenciadas, com componentes tubulares, mas não estrutura em camadas na parte da mucosa revelou que os GC deste subconjunto foram derivados a partir de um componente tubular em um tumor e foram caracterizados por 17p- e 8q + [16] e inactivação do tipo selvagem TP53
por mutação e perda de heterozigosidade (LOH) [17]. A fim de determinar a contraparte em estágio inicial deste tipo de GC, analisamos adenocarcinomas tubulares intramucoso (banheiras) usando CGH. Estes estudos descobriram que as banheiras intramucoso mostrou não só várias alterações cromossômicas comum a GCs avançados, mas também frequentemente mostrou 8q- e 17p + que foram criticamente diferente de GCs avançados e pouco diferenciados [18].
No presente estudo, contra cópia alterações de números de cromossomas e genes foram examinados nas mucosas e invasivos partes de outra série de banheiras precoces e avançados usando array e cromossômica CGH. Com base nesses dados, nós demonstramos casos de linhagens contínuas e descontínuas entre intramucoso e peças invasivos de tumores individuais e descobriu que TP53 Comprar e MYC
podem ser bons marcadores de linhagem para banheiras gástricas.
Methods of the Institutional Review Board de Ética médica da Universidade Shiga de Ciência médica concedida a aprovação para a realização desta pesquisa sobre a condição de que os materiais utilizados devem ser anônimo.
amostras de tumor
este estudo incluiu 28 estômagos cirurgicamente ressecados (Tabela 1) com 13 banheiras intramucoso e 15 banheiras invasivos [6 submucosa e 9 cancros avançados que invadiram a muscular própria ou tecidos mais profundos (o componente tubular de cada tumor foi avaliado como sendo mais de 30%)]. Cada estômago foi fixado em formalina e embebido em cera de parafina. Estes foram selecionados aleatoriamente a partir dos materiais diagnosticados em nosso departamento de 1996 a 2008. histológica tipos e fases de tumor foram determinados de acordo com a Classificação japonesa de câncer gástrico [19] e pTNM encenação, respectivamente. Quando um padrão histológico da mucosa foi encontrado para ser heterogénea em um tumor invasivo indivíduo, a parte com o menor grau de atypism foi tomado como a amostra da mucosa que pode evitar a possibilidade de re-invasão das células cancerosas invasivas na mucosa. Nos cancros invasivos, amostras de DNA foram obtidas de intramucoso e invasivo parts.Table 1 Resumo dos dados genéticos clínicos, histopatológicos e moleculares de 25 adenocarcinoma tubular de estômago
Case No.
Idade /sexo
tipo histológico *
Invasion **
LN **
Stage **
CGH
p53 IHC

TP53mutation

M1
57/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M2
72/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M3
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M4
67/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M5
74/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M6
65/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M7
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M8
70/F
tub1 ≫ pap
T1 (M)
N0
IA
c /a Restaurant -
- M9
51 /M
tub1 > tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M10
52/M
tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M11
57/F
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
-
M12
89/M
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
+
+
M13
70/M
tub1
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
NA
S1m
73/F
tub2
T1(SM)
N0
IA
c/a
+
-
S1i
NT /a
+
- S2M
81 /F
pap
T1 (SM)
N1
IB
c /a
+
- S2i
NT /a
+
+
s3m
79 /M
tub1
T1 (SM)
N0
IA
c /a
+
+
S3I
NT /a
+
+
S4M
63 /M
tub2 > tub1
T1 (SM)
N0
IA
c /NT
+
NT
S5M
75 /M
pap > tub2
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
S6m
79/M
pap
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
A1m
71/M
tub2
T2(SS)
N2
IIIA
c/a
null
-
A1i
NT /a
nula
NA
A2m
73 /M
tub1 > tub2
T2 (SS)
N0
IB
c /a
+
- A2i
NT /a
+
+
A3M
56 /M
pap
T2 (SS)
N1
II
c /a
+
- A3I
NT /um
+
+
A4M
81 /M
tub2 /pap
T2 (SS)
N2
IIIA
c /a
nula
- A4i
NT /a
nula
+
A5m
56 /M
tub1
T2 (MP)
N0
IB
c /NT
- NT
A5i
NT/NA
-
NA
A6m
45/F
tub2
T2(SS)
N1
IB
c/NT
+
NT
A7m
79/F
tub2
T2(MP)
N1
IB
c/NT
+/-
NT
A8m
69/M
tub1
T3(SE)
N2
IIIB
c/a
null
-
A8i
NT /a
nula
NA
A9m
67 /F
tub2
T2 (SS)
N1
II
c /a
+
- A9i
NT /a
+
+
* classificação japonesa de carcinoma gástrico; ** Classificação pTNM. Na coluna de Processo n, M = intramucosal cancro; S = cancro envolvendo a submucosa; A = cancro avançado; m = parte da mucosa; i = parte invasiva. Na coluna de CGH, C = cromossómico CGH; a = array CGH. Na coluna de imuno-histoquímica de p53 (IHC); "+" Indica difusamente (> 70%) núcleos positivos, "-" indica esporadicamente (< 5%) núcleos positivos; "Nulo" indica nenhuma imunorreactividade em tudo. Na coluna de TP53
mutação; "+" E "-" indicam a presença e ausência da mutação, respectivamente; NA = não avaliável; NT = não testado A imuno-histoquímica

coloração imuno-histoquímica foi realizada com anticorpos monoclonais para a proteína p53 (DO-7, 1: 100; Dako, Glostrup, Dinamarca).. Após recuperação de antigénio de secções de tecido em água destilada a 121 ° C durante 5 min, a imunorreactividade foi detectada por um método de biotina-estreptavidina-peroxidase indirecta utilizando o Kit Histofine (Nichirei, Tóquio, Japão) e a reacção diaminobenzidina. As secções foram contrastadas com hematoxilina. As lâminas de controlo negativo sem o anticorpo primário e os do controlo positivo foram processadas em paralelo. Microdissecação
laser e preparação de ADN
As células tumorais foram obtidos a partir de secções de tecido de 5 um de espessura utilizando um sistema de laser LMD6000 microdissecação ( Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Para os tumores individuais, as células cancerosas foram obtidas a partir de áreas de > 3 milimetros 2, onde as células cancerosas foram responsáveis ​​por ≥90% da contagem total de células. Estas células cancerosas foram digeridos em 200 ul de solução de proteinase K a uma concentração de 200 ug /ml durante cerca de 70 h a 37 ° C, seguido por extracção do DNA com fenol /clorofórmio.
Amplificação do genoma inteiro de amostra de ADN foi amplificado usando degenerada preparado oligonucleótido-polimerase de reacção em cadeia (DOP-PCR) em 2 fases, como descrito anteriormente [20], o que resultou em produtos de PCR mais do que 2 kb de tamanho, adequado para rotulagem de nick-translation para CGH. Compra de matriz CGH, o ADN da amostra foi amplificada usando a GenomePlex Tissue Kit de Amplificação do genoma inteiro (WGA2 Kit; Sigma, St. Louis, EUA) [21]. Para algumas amostras de ADN que não podia ser suficientemente amplificados, foi utilizado o Kit de WGA5 (Sigma).
CGH (hibridação, a sonda de marcação de ADN e análise de imagem digital)
tumor DOP-amplificado por PCR e o ADN foi marcado utilizando o normal fluoresceína-12-dUTP e tetrametilrodamina-5-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha), respectivamente, por Nick tradução [15]. análises de hibridação e de imagem foram realizados como descrito anteriormente [22]. Ganhos e perdas no número de cópias de DNA foram definidos por verde para rácios vermelhas > 1,2 e < 0,8, respectivamente. Cromossomos 1p32-pter, 16p, 19, 22 e Y foram excluídos dessas análises.
Disposição CGH
Oligo CGH microarrays (60 K, 60-mer) (Agilent, Santa Clara, EUA) foi utilizado neste estudo , de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, o ADN de tumor e de controlo foi marcado com Cy5 e Cy3, respectivamente não enzimaticamente, usando o genoma de ADN ULS Rotulagem Kit (Agilent) e hibridadas competitivamente ao microarray. Usando a função de Extracção Ver.9.5.3 (Agilent), a intensidade de fluorescência dos tumores e os controlos foi calculada a partir das imagens de matriz hibridadas capturados usando um scanner de DNA microarrays (Agilent). Os ganhos e perdas número de cópias foram definidos como base 2 logaritmo da intensidade do sinal do tumor com a relação de intensidade de sinal de referência mais de 0,3219 e menos de -0,3219, respectivamente. A análise da mutação Compra de conjuntos de primers TP53
PCR foram preparadas para exons 5-8 de TP53
, que hibridam com os intrões que flanqueiam cada um dos exões. Veja arquivo adicional 1 para sequências de iniciador. A primeira mistura de PCR consistiu de um tampão, 200 uM dNTP, MgCl 1,5 mM 2, 0,8 uM de iniciadores, 1 ng /ADN e amostra ul 0,5 U Taq Platinum (Invitrogen, California, EUA) num volume final de 25 ul . Após desnaturação inicial a 94 ° C durante 2 min, 40 ciclos de PCR foram realizados a 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 1 min, seguindo-se o passo de extensão final a 72 ° C durante 10 min. Após a confirmação dos produtos de PCR por electroforese em gel de agarose, sequência de PCR foi realizada utilizando o kit de sequenciação do ciclo v1.1 BigDye Terminators (Applied Biosystems, Califórnia, EUA). A mistura de reacção consistiu de um tampão, 2 ul do primeiro produto de PCR, iniciador 0,15 uM e 0,5 ul de Big Dye Terminator 1,1 V num volume final de 10 ul. Após desnaturação inicial a 96 ° C durante 1 min, 25 ciclos de PCR foram realizados a 96 ° C durante 10 seg, 50 ° C durante 5 sec e 60 ° C durante 4 min. As sequências para a frente e reversa foram determinados utilizando o ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems). As mutações foram detectadas por meio da comparação destas amostras com a sequência de ADN de referência (GenBank número de acesso: HSU94788). estatuto Allelic foi determinada utilizando a proporção de mutante para níveis de pico de tipo selvagem em perfis de sequenciamento.
Análise estatística tabelas de contingência
foram analisados ​​pelo teste exato de Fisher e os testes de Cochran-Armitage. Diferenças de testes de 2 lados com P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados da imuno-histoquímica para os padrões de coloração p53
foram considerados overexpressed somente quando ≥70% de células tumorais apresentavam núcleos coradas positivamente quando visto em um campo de baixa potência. Oito dos 13 cancros intramucosal, todos os cancros da submucosa 6 e 4 dos 9 cancros avançados mostraram difusamente coloração nuclear positiva para p53 (Tabela 1). Um padrão de coloração focal foi observada no caso # A7. Um padrão foi considerado negativo (representando o tipo selvagem TP53
), quando foi observada a presença de coloração nuclear esparso, esporádico e fraco em < 5% dos núcleos. Um padrão de coloração nulo foi observado em casos # A1, A4 e # # A8, sugerindo uma mutação non-sense de TP53
[23].
Cromossômica CGH
Vinte e cinco amostras de 25 casos (10 mucosa , 6 submucosa e 9 cancros avançados) foram utilizados para cromossômica CGH. Todas estas amostras foram obtidas de lesões intramucoso que apresentaram o menor grau de atypism.
Enquanto 4q + ocorreu na maioria (6/9 casos) de banheiras de avançados, não foi detectado nos 16 banheiras precoce (p = 0,0005). Outra alteração cromossômica significativamente diferente entre os cancros mais cedo e avançados foi 11q +, que foi detectada em 11 dos 16 primeiros cânceres e 2 dos 9 cancros avançados (P = 0,0414). Dos 10 banheiras intramucoso examinados, 3 apresentaram perda de 8q (8q-) e /ou ganho de 17p (17p +), enquanto 7 e 2 mostrou 8q + e 17p-, respectivamente. Das 15 amostras de mucosa de banheiras invasivos examinados, 3 e 4 mostraram 8q- e 17p +, respectivamente, enquanto 7 e 6 mostraram 8q + e 17p-, respectivamente.
Disposição CGH
Trinta e uma amostras de 22 casos (13 mucosa, submucosa 3 e 6 cancros avançados) foram avaliados usando um array CGH (Figura 1). As amostras de ADN foram obtidas a partir de intramucosal e /ou lesões invasivas. Figura dados CGH 1 de agregados de MYC e TP53 e TP53 dados de sequenciamento em adenocarcinomas tubulares iniciais e avançados de estômago. cancros iniciais são divididos em (m) cancros intramucoso e submucosos cânceres (sm). Consulte a Tabela 1 para números de amostra. Numerais são rácios de ensaio /referência médios de matriz CGH. perdas significativas e ganhos são indicadas com vermelho e verde, respectivamente. tipo selvagem (WT) e a mutação no exão (ex) e intervir sequência (IVS) de TP53
são indicados com amarela e cinzenta, respectivamente.
Como mostrado na Figura 1 e na Tabela 2, a perda concomitante de MYC
(MYC Restaurant -) eo ganho de TP53
(TP53 +
) foram detectados em 9 das banheiras intramucoso 13, 7 dos 9 amostras de mucosa de banheiras de invasoras, 1 das 3 amostras invasivas de câncer submucosos e nenhuma das amostras de 6 invasivos de cancros avançados. Um padrão de MYC +
e /ou TP53 viajantes - foi detectado em 3 dos cânceres intramucoso 13, nenhuma das 9 amostras de mucosa de banheiras de invasoras, 1 das 3 amostras invasivas de 3 cânceres submucosos e 5 dos 6 amostras invasivas de 6 avançado cancers.Table 2 Alterações de MYC Comprar e TP53
copiar números em adenocarcinomas tubulares iniciais e avançados de estômago
tumor profundidade
Mucosa
submucosa
MP ou mais profundo -



mucosa parte
SM
mucosas parte
profundo
cCGH
(10)
aCGH
(13)
cCGH
(6)
aCGH
(3)
aCGH
(3)
cCGH
(9)
aCGH
(6)
aCGH
(6)
8q(MYC
)+
7
2 (2 *)
3
0
1 (1 *) 4
0 Sims 3 (2 *)
8q (MYC
) -
3
9 (9 **) Sims 3 Página 2 (2 **)
1 (1 **)
0
5 (5 **)
1 (0 **)
17p (TP53
) + Sims 3
10 (9 **) Sims 3 Página 2 (2 **) Página 2 (1 ** )
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