Lineage Analyse von frühen und fortgeschrittenen Rohr Adenokarzinomen des Magens: kontinuierlicher oder diskontinuierlicher

Lineage Analyse von frühen und fortgeschrittenen Rohr Adenokarzinomen des Magens: kontinuierlicher oder diskontinuierlicher
Zusammenfassung
Hintergrund
Eradikation von Magenfrühkarzinomen ( GC) wird gedacht, um Verringerung der Sterblichkeit von GC zu tragen, da die meisten der frühen GCs Fortschritte zu den fortgeschrittenen GCs. Allerdings ist früh GC alternativ eine ruhende Variante des GC betrachtet, und es schreitet selten zu fortgeschrittenen GC. Das Ziel dieser Studie war es, das Ausmaß der Überlappung von genetischen Linien zwischen frühen und fortgeschrittenen Rohr Adenokarzinome (TUBs) des Magens zu klären.
Methoden
Immunhistochemische Färbung für p53 durchgeführt wurde 28 operativ reseziert Mägen mit 13 intramukosalen mit und 15 invasive TUBs. Durch Chromosomen- und Array-basierte komparative genomische Hybridisierung (CGH) wurde genomische Kopienzahl Verfassung zwischen der Schleimhaut und invasive Teile der invasiven TUBs und zwischen den Schleimhaut Teile der invasiven und intramukosalen TUBs verglichen, unter Verwendung von 25 und 22 TUBs sind. TP53
Mutation in den Exons 5-8 in 20 TUBs wurde untersucht.
Ergebnisse | chromosomalen CGH ergab, dass 4Q + und 11q + waren häufiger in fortgeschrittenen und frühen TUBs jeweils während der Kopienzahl ändert sich in 8Q und 17p zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen frühen und fortgeschrittenen TUBs. Allerdings Array CGH hat gezeigt, dass der 13 intramukosalen TUBs sucht, Verlust von MYC
(MYC
-) und die Verstärkung von TP53
(TP53
+) wurde in 9 TUBs und MYC erkannt
+ und /oder TP53
- wurde in 3 TUBs nachgewiesen. Von den Schleimhautproben von 9 invasive TUBs zeigte 7 MYC
- /TP53
+ und keiner zeigte MYC
+ und /oder TP53
-. Von den 9 Proben aus den invasiven Teile, 1 (aus submucosalem Krebs) zeigte MYC
- /TP53
+ und 6 (1 aus submucosalem und 5 von fortgeschrittenen Krebserkrankungen) zeigte MYC
+ und /oder TP53
-. Die letztgenannten 6 Tumoren zeigten üblicherweise ein mutiertes Muster (diffuse oder null) in p53 Immunhistochemie und 4 der 6 Tumoren bewertbar für TP53
Sequenzanalyse ergab Mutationen. Die gesamte Array-CGH-Muster angedeutet, dass zwischen der Schleimhaut und invasive Teile wurde genetischen Abstammungslinie diskontinuierlich in 5 Krebs im fortgeschrittenen Stadium und kontinuierlich in 3 submuköse Krebserkrankungen gefunden. Schlussfolgerungen
genetischen Linien oft unterschieden zwischen frühen und fortgeschrittenen TUBs
. MYC
- /TP53
+ und MYC
+ und /oder TP53
-. Können die Unterschriften von ruhenden und aggressiven TUBs sein, die jeweils in den Magen
Hintergrund
Magenkrebs bleibt die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit, trotz der jüngsten Abnahme der Mortalität in den entwickelten Ländern [1]. Magenkarzinomen (GCs) klassifiziert morphologisch in zwei Hauptkategorien: Rohrbildenden Art und diffusen Typ [2, 3] und in der Inszenierung, in frühen Krebserkrankungen (mit Beteiligung der Schleimhaut und die Submukosa) und Krebs im fortgeschrittenen Stadium (mit Beteiligung der Muscularis propria oder Tiefer). Frühe GC ist eine heilbare Krebs angesehen [4]; sie fortschreitet angeblich zu fortgeschrittenen GC nach Dauer als einem frühen Stadium der GC [5, 6] variiert. In Japan, können frühzeitig GCs endoskopisch werden sowie chirurgisch [7], basierend auf den Prinzipien der Früherkennung und Behandlung aktiv reseziert. Auf der anderen Seite, halten einige Pathologen, dass die rohrbildenden Neoplasien, die auf die Schleimhaut beschränkt sind eine lange Zeit in Anspruch nehmen zu müssen oder keine tiefere Gewebe einzudringen. Dadurch werden diese Läsionen genannt Dysplasie [4].
Vor kurzem wurde ein Massenscreening-Programm für Neuroblastome in Japan [8-10] suspendiert wurde, weil eine diskontinuierliche genetischen Abstammungslinie zwischen der Früh- und der Spät präsentiert Neuroblastome gefunden wurde. Neuroblastome Negative und späten präsentierenden (≥1 Jahr) zeigte nahezu diploidy mit dem Verlust der terminalen 1p, während positive Neuroblastome bei Säuglingen zeigten nahezu Triploidie ohne 1p Deletion [11, 12]. Auf der anderen Seite schlug -basierte Analyse vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), dass hochgradige atypische adenomatöse Hyperplasie in der Lunge der wahre Vorläufer von Bronchioloalveolarkarzinom ist [13]. Im Magen, ist es ein Problem, inwieweit genetische Abstammung Anfang überlappt wird und GCs vorgerückt.
Diffusen Typ GCs verwendeten wir CGH, dass chromosomale Kopienzahl Veränderungen der intramukosalen Siegelringzellkarzinome zu demonstrieren, die zeigten, eine Schichtstruktur [14] wurden in einem Anteil von schlecht differenzierten GCs bei fortgeschrittenen Stadien [15] übernommen. Das Vorhandensein einer Schichtstruktur aus Siegelring Zellen in der Schleimhaut Teile dieser fortgeschrittenen Krebserkrankungen auch vorgeschlagen, dass Siegelringzellkarzinome eine wahre Vorläufer von schlecht differenzierten GCs sein kann. CGH-basierte Abstammungslinie Analyse eines anderen Teilmenge von schlecht differenzierten fortgeschrittenen GCs mit Rohrkomponenten, aber keine Schichtstruktur in der Schleimhaut Teil zeigte, dass GCs dieser Teilmenge aus einer röhrenförmigen Komponente in einem Tumor abgeleitet wurden und wurden von 17p- und 8Q + [16] gekennzeichnet und Inaktivierung des Wildtyp TP53 und Videos Mutation und den Verlust der Heterozygotie (LOH) [17]. Um die Frühphasen-Gegenstück dieser Art von GC zu bestimmen, analysierten wir intramukosalen Rohr Adenokarzinome (TUBs) unter Verwendung von CGH. Diese Studien zeigten, dass die intramukosalen TUBs zeigte nicht nur mehrere chromosomale Veränderungen gemeinsam fortgeschrittenen GCs, sondern auch zeigte häufig 8q- und 17p +, die sich kritisch verschieden von fortgeschrittenen und schlecht differenzierten GCs waren [18].
In der vorliegenden Studie, Urheber- Anzahl Veränderungen der Chromosomen und Gene wurden in den Schleimhaut und invasive Teile einer anderen Reihe von frühen und fortgeschrittenen TUBs mit Array und chromosomalen CGH untersucht. Auf der Basis dieser Daten haben wir gezeigt, Fälle von kontinuierlichen und diskontinuierlichen Linien zwischen intramukosalen und invasive Teile einzelner Tumoren und fanden heraus, dass TP53
und MYC
Marker gute Linie für Magen TUBs sein kann.
Methoden
Die Institutional Review Board über die medizinische Ethik an Shiga University of Medical Science erteilte Genehmigung zur Durchführung dieser Forschung unter der Bedingung, dass die verwendeten Materialien anonym sein müssen. die Tumorproben
Diese Studie 28 enthalten operativ reseziert Mägen (Tabelle 1) mit 13 intramuköse Kübel und 15 invasive TUBs [6 submuköse und 9 fortgeschrittenen Krebserkrankungen, die den Muskularis propria oder tiefere Gewebe (das rohrförmige Bauteil jedes Tumors beurteilt wurde mehr als 30% sein) eingedrungen]. Jeder Magen wurde in Formalin und eingebettet in Paraffin fixiert. Diese wurden in unserer Abteilung, die zufällig aus den von 1996 diagnostizierten Materialien ausgewählt, um 2008 histologische Typen und Tumorstadien wurden nach bestimmt der japanischen Klassifikation von Magenkrebs [19] und pTNM Inszenierung sind. Wenn ein Schleimhaut histologische Muster gefunden wurde, in einem individuellen invasiven Tumor heterogen zu sein, wurde das Teil mit dem niedrigsten Grad der atypism als die Schleimhautprobe entnommen, die die Möglichkeit einer erneuten Invasion von invasiven Krebszellen in die Schleimhaut verhindern kann. In invasiven Karzinomen, DNA-Proben wurden von intramukosalen und invasive parts.Table 1 Zusammenfassung der klinischen, histopathologischen und molekulargenetische Daten von 25 Rohr Adenokarzinom des Magens erhalten
Case No.
Alter /Geschlecht
histologischen Typ *
Invasion **
LN **
Bühne **
CGH
p53 IHC

TP53mutation

M1
57/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M2
72/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M3
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M4
67/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M5
74/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M6
65/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M7
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M8
70/F
tub1 ≫ pap
T1 (M)
N0
IA
c /a
-
- M9
51 /M
TUB1 > tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M10
52/M
tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M11
57/F
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
-
M12
89/M
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
+
+
M13
70/M
tub1
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
NA
S1m
73/F
tub2
T1(SM)
N0
IA
c/a
+
-
S1i
NT /a
+
- S2m
81 /F
pap
T1 (SM)
N1
IB
c /a
+
- S2i
NT /a
+
+
S3m
79 /M
TUB1
T1 (SM)
N0
IA
c /a
+
+
S3i
NT /a
+
+
S4m
63 /M
tub2 > TUB1
T1 (SM)
N0
IA
c /NT
+
NT
S5M
75 /M
pap > tub2
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
S6m
79/M
pap
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
A1m
71/M
tub2
T2(SS)
N2
IIIA
c/a
null
-
A1i
NT /a
null
NA
A2m
73 /M
TUB1 > tub2
T2 (SS)
N0
IB
c /a
+
- A2i
NT /a
+
+
A3M
56 /M
pap
T2 (SS)
N1
II
c /a
+
- A3i
NT /
a +
+
A4m
81 /M
tub2 /pap
T2 (SS)
N2
IIIA
c /a
null
- a4i
NT /a
null
+
A5M
56 /M
TUB1
T2 (MP)
N0
IB
c /NT
- NT
A5i
NT/NA
-
NA
A6m
45/F
tub2
T2(SS)
N1
IB
c/NT
+
NT
A7m
79/F
tub2
T2(MP)
N1
IB
c/NT
+/-
NT
A8m
69/M
tub1
T3(SE)
N2
IIIB
c/a
null
-
A8i
NT /a
null
NA
A9m
67 /F
tub2
T2 (SS)
N1
II
c /a
+
- A9i
NT /a
+
+
* japanische Klassifizierung von Magenkarzinom; ** PTNM Klassifizierung. In der Spalte der Sache, M = intramukosalen Krebs; S = Krebs die Submukosa beteiligt sind; A = Krebs im fortgeschrittenen Stadium; m = Schleimhaut Teil; i = invasive Teil. In der Spalte der CGH, c = chromosomalen CGH; a = Array-CGH. In der Spalte von p53 Immunhistochemie (IHC); "+" Zeigt an diffus (> 70%) positive Kerne, "-" zeigt sporadisch (< 5%) positive Kerne; "Null" gibt überhaupt keine Immunreaktivität. In der Spalte der TP53-Mutation
; "+" Und "-" zeigen an Gegenwart und Abwesenheit der Mutation sind; NA = nicht beurteilbar; NT = nicht getestet
Immunohistochemistry
Immunhistochemische Färbung wurde mit monoklonalen Antikörpern gegen p53-Protein durchgeführt (DO-7, 1: 100, Dako, Glostrup, Dänemark).. Nach der Antigen-Wiedergewinnung von Gewebeschnitten in destilliertem Wasser bei 121 ° C für 5 min wurde die Immunreaktivität durch ein indirektes Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Verfahren unter Verwendung der Histofine Kit (Nichirei, Tokyo, Japan) und Diaminobenzidin-Reaktion nachgewiesen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Folien der negativen Kontrolle ohne primären Antikörper und diejenigen der positiven Kontrolle wurden parallel verarbeitet.
Laser Mikrodissektion und DNA-Präparation
Tumorzellen wurden von 5 um dicke Gewebeschnitte erhalten eine LMD6000 Lasermikrodissektion System ( Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland). Für einzelne Tumore wurden Krebszellen von Bereichen >erhalten; 3 mm 2, wobei die Krebszellen für ≥90% der Gesamtzellzahl berücksichtigt. Diese Krebszellen wurden in 200 &mgr; l Proteinase K-Lösung bei einer Konzentration von 200 ug /ml für etwa 70 h bei 37 ° C verdaut, gefolgt von Phenol /Chloroform-Extraktion DNA.
Amplifikation des gesamten Genoms
Probe DNA amplifiziert unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotid-grundiert Polymerase-Kettenreaktion (DOP-PCR) in 2 Phasen, wie zuvor beschrieben [20], die in PCR-Produkte ergab mehr als 2 kb groß, geeignet für die nick-Translation Kennzeichnung für CGH.
für Array CGH, DNA-Probe wurde mit der GenomePlex Tissue Whole Genome Amplification Kit (WGA2 Kit; Sigma, St. Louis, USA) verstärkt [21]. Bei einigen DNA-Proben, die nicht ausreichend verstärkt werden konnte, wurde die WGA5 Kit (Sigma) verwendet.
CGH (Hybridisierung der Sonde DNA-Markierung und digitale Bildanalyse)
DOP-PCR-amplifizierte Tumor und normalen DNA wurde unter Verwendung von markiertem Fluorescein-12-dUTP und Tetramethylrhodamin-5-dUTP (Roche, Mannheim, Deutschland), die jeweils durch Nick-Translation [15]. Hybridisierung und Bildanalysen wurden wie vorher beschrieben durchgeführt [22]. Gewinne und Verluste in der DNA-Kopienzahlen wurden von grün auf rot-Verhältnisse >definiert; 1,2 und < 0,8, respectively. Chromosome 1p32-pter, 16p, 19, 22 und Y wurden aus diesen Analysen ausgeschlossen.
Array CGH
Oligo CGH-Microarray (60 K, 60-mer) (Agilent, Santa Clara, USA) wurde in dieser Studie verwendet nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, Tumor und Kontroll-DNA war nicht enzymatisch markiert mit Cy5 und Cy3 bzw. das Genom DNA ULS Kennzeichnung Kit (Agilent) und kompetitiv hybridisiert an den Microarray verwendet wird. Mit Feature Extraction Ver.9.5.3 (Agilent), die Fluoreszenzintensität der Tumoren und Kontrollen wurde von den hybridisierten Array Bilder berechnet, um einen DNA-Microarray-Scanner erfasst unter Verwendung von (Agilent). Kopie-Anzahl Gewinne und Verluste wurden als Logarithmus der Basis 2 des Tumors Signalintensität mit dem Referenzsignalintensitätsverhältnis mehr definiert als 0,3219 und kleiner als -0,3219, respectively.
Mutationsanalyse für TP53
PCR Primersätze wurden hergestellt für Exons 5-8 von TP53
, die den flankierenden Introns jedes Exon hybridisieren. Sehen Sie weitere Datei 1 für die Primer-Sequenzen. Die erste PCR-Mischung bestand aus einem Puffer, 200 uM dNTPs, 1,5 mM MgCl 2, 0,8 uM Primer, 1 ng /&mgr; l Proben-DNA und 0,5 U Platinum Taq (Invitrogen, Kalifornien, USA) in einem 25 &mgr; l Endvolumen . Nach der anfänglichen Denaturierung bei 94 ° C für 2 min, 40 Zyklen der PCR wurden 30 sec bei 94 ° C, 54 ° C für 1 min und 72 ° C für 1 min, bei 72 ° C nach der abschließenden Verlängerungsschritt für 10 Minuten. Nach Bestätigung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese wurde PCR-Sequenz ausgeführt, um das BigDye-Terminatoren v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Kalifornien, USA) verwendet. Die Reaktionsmischung bestand aus einem Puffer, 2 &mgr; l des ersten PCR-Produkts, 0,15 uM Primer und 0,5 ul BigDye Terminator V 1.1 in 10 &mgr; l Endvolumen. Nach der anfänglichen Denaturierung bei 96 ° C für 1 min, 25 Zyklen der PCR wurden für 10 sec bei 96 ° C, 50 ° C für 5 Sekunden und 60 ° C für 4 min. Die Vorwärts- und Rückwärtssequenzen wurden unter Verwendung des ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems) bestimmt. Mutationen wurden durch Vergleich dieser Proben an die Referenz-DNA-Sequenz (: HSU94788 GenBank Zugangsnummer) nachgewiesen. Allelische Status wurde unter Verwendung des Verhältnisses von mutierten zu Wildtyp-Spitzenwerte bei der Sequenzierung Profile bestimmt.
Statistische Analysen
Kontingenztafeln von Fisher-Test und Cochran-Armitage-Tests analysiert. Unterschiede von 2-seitigen Tests mit P < 0,05 als statistisch signifikant.
Ergebnisse | Immunhistochemie für p53
Färbungsmuster wurden überexprimiert nur berücksichtigt, wenn ≥70% Tumorzellen positiv gefärbten Kerne zeigten, wenn sie in einem Low-Power-Bereich angesehen. Acht der 13 intramuköse Krebs, alle 6 submuköse Karzinome und 4 der 9 fortgeschrittenen Krebserkrankungen zeigten diffus positive nukleäre Färbung für p53 (Tabelle 1). Ein Schwerpunkt Färbungsmuster wurde im Fall # A7 beobachtet. Ein Muster wurde als negativ betrachtet (die den Wildtyp TP53
), wenn das Vorhandensein von spärlich, sporadisch und schwache Kernfärbung beobachtet wurde in < 5% der Kerne. Ein Null-Färbungsmuster wurde in Fällen beobachtet # A1, A4 # und # A8, was auf eine non-sense-Mutation des TP53
[23].
Chromosomale CGH
Fünfundzwanzig Proben von 25 Fällen (10 mukosalen , 6 submuköse und 9 Krebs im fortgeschrittenen Stadium) wurden für die chromosomalen CGH verwendet. Alle diese Proben wurden von intramukosalen Läsionen erhalten, die die niedrigste Stufe der atypism zeigte.
Während 4Q + in der Mehrheit aufgetreten (6/9 Fälle) von fortgeschrittenen TUBs, wurde es in den 16 frühen TUBs (P = 0,0005) nicht erkannt. Eine weitere deutlich unterschiedliche chromosomale Veränderung zwischen frühen und fortgeschrittenen Krebserkrankungen war 11q +, die in 11 der 16 frühen Krebserkrankungen und 2 der 9 Krebs im fortgeschrittenen Stadium (p = 0,0414) nachgewiesen wurde. Von den 10 untersuchten intramuköse TUBs zeigte 3 Verlust von 8Q (8q-) und /oder Verstärkung von 17p (17p +), während 7 und 2 8Q gezeigt + und 17p-, respectively. Von den 15 Proben von mukosalen invasive TUBs sucht, 3 und 4 zeigten 8q- und 17p + bzw. während 7 und 6 8Q gezeigt + und 17p-, respectively.
Array CGH
Einunddreißig Proben von 22 Fällen (13 Schleimhaut, 3 submuköse und 6 Krebs im fortgeschrittenen Stadium) wurden unter Verwendung von Array-CGH (Abbildung 1) bewertet. DNA-Proben wurden von intramukosalen und /oder invasive Läsionen erhalten. Abbildung 1 Array-CGH-Daten von MYC und TP53 und TP53 Sequenzierungsdaten in frühen und fortgeschrittenen Rohr Adenokarzinomen des Magens. Frühe Krebserkrankungen sind unterteilt in intramukosalen (m) Krebs und submuköse (sm) Krebserkrankungen. Siehe Tabelle 1 für die Probennummern. Die Ziffern sind Mittel Prüf- /Referenzverhältnisse von Array-CGH. Erhebliche Verluste und Gewinne sind mit rot und grün angedeutet ist. Wildtyp (wt) und Mutation in Exon (ex) und dazwischenliegende Sequenz (IVS) von TP53
mit gelb und grau angezeigt sind, beziehungsweise.
Wie in Abbildung 1 und Tabelle 2 gezeigt, damit einhergehenden Verlust von MYC
(MYC
-) und die Verstärkung von TP53
(TP53 +
) wurden in 9 der 13 intramukosalen TUBs erkannt, 7 der 9 Schleimhautproben von invasiven TUBs, 1 der 3 invasive Proben von submuköse Krebs und keiner der 6 invasive Proben von fortgeschrittenen Krebserkrankungen. Ein Muster von MYC + Karten und /oder TP53
- wurde in 3 der 13 intramuköse Karzinome nachgewiesen, keine der 9 Schleimhautproben invasive Kübel, 1 der 3 invasive Proben von 3 submuköse Krebs und 5 der 6 invasive Proben von 6 erweiterte cancers.Table 2 Änderungen von MYC
und TP53
Zahlen in frühen und fortgeschrittenen Rohr Adenokarzinomen des Magens kopieren
Tumortiefe
mucosae
Submukosa
MP oder tiefer -



Teil Mucosal
SM
Mucosal Teil
Tief
cCGH
(10)
aCGH
(13)
cCGH
(6)
aCGH
(3)
aCGH
(3)
cCGH
(9)
aCGH
(6)
aCGH
(6)
8q(MYC
)+
7
2 (2 *)
3
0
1 (1 *)
4 0
3 (2 *)
8Q (MYC
) -
3
9 (9 **)
3
2 (2 **)
1 (1 **)
0
5 (5 **)
1 (0 **)
17p (TP53
) +
3
10 (9 **)
3
2 (2 **)
2 (1 ** )
1 6 (5 **)
1 (0 **)
17p (TP53
) - 2
3 (2 *)
2
0
1 (1 *)
4 0
4 (2 *)
SM, die Submukosa; MP, die Muscularis propria. cCGH und aCGH, Chromosomen- und Array-basierte komparative genomische Hybridisierung; Ziffern in Klammern zeigen die Gesamtzahl der untersuchten Proben. Bold Buchstaben zeigt die Ergebnisse von aCGH. Sternchen in Klammern geben die Gleichzeitigkeit von MYC
+ und TP53
-. Doppel Sternchen concomitance von MYC
dar. - Und TP53
+ bezogen auf die gesamte Array
CGH-Muster wurden genetischen Abstammungslinien gefunden in 5 fortgeschritten und 3 submuköse Karzinome diskontinuierliche und kontinuierliche zwischen der Schleimhaut und invasive Teile sein , beziehungsweise. Wie in 2 gezeigt, zeigte die Probe aus dem mukosalen Teil # S3 4p-, 4q-, 8Q +, 9p-, 13q +, 15q-, 18q-, 20q + und Y-, während die Probe von der invasive Teil # S3 die gleichen Abweichungen von der Schleimhaut Teil geerbt, zeigte zusätzliche Abbildungsfehler (2q-, 7p +, 8P-, 10p +, 14q + und 20q +) und verlor 4p- und 22q +. In # S1, Verstärkungen von 1q, 14q, 19 und 20, und der Verlust der 18q war in mukosalen und submukosalen Proben häufig, wenn die Gewinne von 1q, 14q, 19q und 20 in der Submucosa als die signifikanten Niveau etwas geringer waren. In # S2, beide eine gemeinsame Veränderung der Schleimhaut und Submukosa-Teile war ein Gewinn von 20p. Die Submukosa-Probe zeigte zusätzliche Gewinne in 10p, 12 und 13q und Verluste in 3Q, 4, 5, 8P, 9P, 9q, 10q, 12p, 14q, 16 und 19p. Die Schleimhaut-Probe zeigte Verlust der 18q, die in dem submukösen Probe wiederhergestellt wurde, möglicherweise durch uniparental Disomie [24, 25]. In # A1, # A3, A4 #, # A8 und A9 #, Abweichungen in den Proben aus den Schleimhaut Teile wurden in denen der invasiven Teile nicht erkannt. In # A2 könnte die Kontinuität der genetischen Abstammungslinien wegen der Abwesenheit signifikanter Kopienzahl Veränderungen im Schleimhaut Teil beurteilt werden. Abbildung 2 Array-CGH-Profile. Die chromosomalen Regionen Kopienzahl Aberrationen in der Schleimhaut Teil # S3 (S3m) sind grundsätzlich in der invasive Teil (S3i) in denjenigen enthalten sind, während die in der Schleimhaut Teil # A1 (A1m) von denen des invasiven Teils unterschiedlich sind (A1i)
TP53
Mutationsanalyse
Mutations in 7 der Tumoren festgestellt wurden, die für die Sequenzanalyse der Exons 5-8 von TP53
(Figur 1, Tabelle 3) untersucht wurden. 1 von die 10 intramukosalen Krebs, 2 der 3 submuköse Krebs und alle 4 Krebs im fortgeschrittenen Stadium (nur die invasive Teile). In all diesen 7 Tumoren war die TP53
Allel hemizygot außer in 1 intramuköse Krebs (# M12) mit einem heterozygoten Muster für eine Exon-8-Mutation (Abbildung 3) und eine diffuse oder eine Nullmuster für p53, angegeben als durch Immunhistochemie. Kein TP53
Mutation wurde in p53- Proben nachgewiesen, wie in Abbildung 4. In p53 + /null Proben gezeigt, 2 der 15 Proben des Schleimhaut Teil zeigte TP53
Mutation, während 6 der 7 Proben von invasiven Teil TP53 zeigte
Mutation (P = 0,0023). In 1 der submuköse Krebserkrankungen zeigt TP53
+ und eine hemizygous Mutation (die invasive Teil # S2), TP53
+ kann uniparental Polysomie widerspiegeln [24, 25] .Tabelle 3 Kopienzahl Änderungen der TP53
und MYC
und p53-Immunreaktivität in den für die Mutation getesteten Proben analysiert
Fall Nr
MYC
TP53
Mutation von TP53exons 5-8
Allelmutante
MDM2
p53 IHC
M3
-
+
Gew
-
- M4
- +
Gew
ns
- M5
-
+
Gew
ns
+
M6
- +
Gew
- +
M7
ns
+
Gew
- +
M8
- +
Gew
ns
- M9
- +
Gew
ns
+
M10
- +
Gew
- +
M11
ns
-
wt
ns
- M12
+
- Exons 5/8
hemi /hetero
ns
+
M13
+
- NA
ns
- S1m
- +
Gew
- +
S1i
-
+
Gew
- +
S2m
- +
Gew
- +
S2i
ns
+
Exon 7
hemi
ns
+
S3m
ns
ns
Exon 8
hemi
ns
+
S3i
+
- Exons 5/6/8
hemi
ns
+
A1m
- +
Gew
-
null
A1i
+
- NA
- null
A2m
- +
Gew
ns
+
A2i
+
- Exon 8
hemi
ns
+
A3M
- +
Gew
ns
+
A3i
-
- Exon 5
hemi
- +
A4m
- +
wt
- null
a4i
ns
ns
Exon 5
hemi
ns
null
A8M
ns
+
wt
- null
A8i
+
- NA
ns
null
A9m
- +
Gew
- +
A9i
+
+
Exon 6
hemi
ns
+
ns = nicht signifikant; wt = Wildtyp; NA = nicht beurteilbar; Hemi = hemizygous; . Hetero = heterozygot
M12, Exon 5: R175H (CGC > CAC), C182C (TGC > TGT), S183L (TCA > TTA); 8 Exon: R267R (CGG > CGA)
S2i, Exon 7: C242F (TGC > TTC)
S3m, Exon 8: R273S (CGT > AGT)
S3i, Exon 5: A161V ( GCC > GTC); Exon 6: T211I (ACT > ATT); 8 Exon: R273S (CGT > AGT)
A2i, Exon 8: R273 H (CGT > CAT)
A3i, Exon 5: A161T (GCC > ACC)
a4i, Exon 5: IVS5 + 1G > T
A9i, Exon 6: Y220C (TAT > TGT)
3 TP53 Mutationsmuster Abbildung. Eine heterozygote Mutation mit einer signifikanten Wildtyp-Komponente in Exon 8 (A) und einer hemizygous Mutation in Exon 5 (B) in einem intramukosalen Krebs (# M12). Mutationen in den anderen untersuchten Tumoren waren hemizygous wie in C (# S2) gezeigt.
4 Beziehungen zwischen p53 Immunhistochemie Abbildung, die Kopienzahl von TP53 und Hot-Spot-Mutation von TP53. Für "p53 +" und "p53-" finden Sie in der Legende in Tabelle 1 "TP53
+", "TP53
-" und "TP53
n /s" zeigen signifikante Kopienzahl Gewinn und Verlust und keine signifikante Veränderung, respectively. Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Proben in invasive Teilen. Die Ziffern sind Probennummern. Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Proben in invasive Teilen. NA = nicht beurteilbar.
Auf der anderen Seite, in den Schleimhautproben, die diffuse /null Muster oft mit Wildtyp TP53
verbunden war. Um dieses Ergebnis zu erklären, wurde die MDM2
Kopienzahl unter Verwendung von Array-CGH-Daten untersucht. Von den insgesamt 22 Proben beurteilt für TP53
Mutationsanalyse, MDM2
copy-number Verlust zeigte in 10 der 14 Proben mit dem Wildtyp TP53
und 1 der 8 Proben mit TP53
Mutation . (P = 0,0237)
Diskussion
In intramukosalen TUBs zeigte chromosomalen CGH 8q- und /oder 17p + bei einer Frequenz von 3 von 10 Tumoren untersucht; Diese Veränderungen waren häufiger in einer früheren Studie, die Random-Priming-Markierung verwendet [18]. In der vorliegenden Studie wurde 8Q + häufig erfasst sowohl im intramukosalen Krebs (7/10) und invasiven Karzinomen (7/15); jedoch die oben erwähnten früheren Daten zeigten selten 8Q +. Diese Diskrepanzen können spiegeln Unterschiede in den Markierungsverfahren verwendet wird; CGH Ergebnisse mit Nick-Translation Kennzeichnung oder Random-Priming-Kennzeichnung wurden FISH-Signale verglichen, und es wurde festgestellt, dass Nick-Translation Kennzeichnung nicht selten falsch-positive Gewinne zeigte [26]. Jedoch waren die gleichen Markierungsbedingungen, signifikante Unterschiede in der Häufigkeit von 4q + und 11q + Verwendung zwischen frühen und fortgeschrittenen Krebsarten nachgewiesen, möglicherweise Unterschiede in der genetischen Abstammungslinien zwischen ihnen reflektiert. Chromosomalen CGH Daten von fortgeschrittenen Krebserkrankungen in dieser Studie waren konsistent mit früheren chromosomalen Daten CGH erhalten mit Nick-Translation Kennzeichnung für erweiterte GCs (dh 17p- und 8Q + waren durchaus üblich) [27-30].
Obwohl klinisch erkennbar frühen Krebserkrankungen sind in der Regel betrachtet die Vorstufen von Krebs im fortgeschrittenen Stadium [5, 6], die intramukosalen und invasive Teile der fortgeschrittenen TUBs oft zeigte diskordanten Kopienzahlen von MYC
und TP53
in dieser Studie: MYC
- und TP53
+ in 5 der 6 Proben der Schleimhautteile, wie sie allgemein in den intramuköse Krebs untersucht und MYC
+ und /oder TP53
- in 5 der 6 Proben der invasive Teile. Zusätzlich bezogen auf das gesamte Array CGH-Muster der Schleimhaut und invasive Teile von Tumoren, eine diskontinuierliche wurde genetischen Abstammungslinie in 5 der 6 fortgeschrittenen Krebserkrankungen gefunden. Daher scheint es, dass die Tumor Klone in den Schleimhaut Teile der fortgeschrittenen Krebserkrankungen nicht Vorläufer des invasiven Teils waren, aber Minute intramuköse Krebsarten, die wahrscheinlich mit den invasiven Karzinomen koexistiert. Es wurde berichtet, dass mehrere Minuten Krebsarten sind häufiger in TUBs als in undifferenzierten Typ GCs [31]. In fortgeschrittenen TUBs könnte der intramukosalen Vorläufer einer invasiven Komponente aufgrund Geschwüre im Tumor verloren haben, oder wurde der Vorläufer nicht untersucht, weil es nicht mit dem Teil der niedrigste Stufe der atypism, die die Prüfung der Schleimhaut zu übereinstimmten Teil der invasiven GCs wurde in der vorliegenden Studie beschränkt.
auf der anderen Seite, in submuköse Krebs, eine kontinuierliche genetische Abstammung wurde in allen drei submuköse Tumoren untersucht gefunden. Es kann sein, weil die Schleimhaut Teil im Grunde in der frühen GCs und weil die Schleimhaut Vorläufer einer invasiven Komponente zeigte die niedrigste Stufe der atypism gehalten und wurde nicht ausgeschlossen, von der vorliegenden Array analysiert. Die Schleimhaut und invasive Teile hatten gemeinsame Bereiche Kopienzahl Aberrationen mit concordant Haltepunkte, und die meisten Veränderungen in der Schleimhaut Teil wurden in denen des invasiven Teil enthalten. . Bei der Gen-Ebene, die Kopienzahl von MYC
und TP53
zwischen den Schleimhaut und Submukosa-Teile in 2 der 3 submuköse Krebs einstimmten
Die TP53
- und /oder MYC
+ wurde Muster nicht nur in den invasive Teilen 1 der submukösen Krebs erkannt und die meisten der fortgeschrittenen Krebserkrankungen, sondern auch in 3 der 13 intramuköse Krebsarten. In diesen Tumoren zeigten p53 Immunhistochemie eine diffuse oder null (Mutation) Muster (Tabellen 1 und 3), was darauf hindeutet, dass die
TP53 - kann LOH und die resultierende Inaktivierung von Wildtyp TP53
reflektieren. Die Sequenzierung Analysen der Mutation Hot Spots von TP53
haben gezeigt, dass hemizygous Mutationen (dh Mutation und LOH) wurden in den Schleimhautproben von 1 der 3 intramukosalen Krebs und 1 Submukosa-Krebs mit einer TP53
erkannt - Muster, wie auch die invasive Teile der 4 fortgeschrittenen Krebserkrankungen, die für TP53 Mutationsanalyse
informativ waren. Eine solche Inaktivierung von Wildtyp TP53
, die weitere genomische Instabilität führen kann, wurde in fortgeschrittenen GCs [15, 17] häufig berichtet. Das MYC
Genort ist auch bekannt, häufig Kopienzahl Gewinne oder Verstärkungen in verschiedenen fortgeschrittenen Krebserkrankungen [32] zu zeigen. MYC
+ /TP53
- kann somit als die Unterschrift des aggressiven GC gerechtfertigt werden
Es wurde berichtet, dass LOH sowie Mutationen von TP53 Was sind häufiger in fortgeschrittenen GCs erkannt als in früh. GCs [17, 33], und dass im frühen GCs, TP53
Mutationen sind häufiger in submukösen TUBs detektiert als in intramuköse TUBs [34, 35]. Diese Tendenz wurde auch in der vorliegenden Studie beobachtet, aber Mutationsanalysen zeigten, dass Hot-Spot-Mutationen wurden in der Schleimhaut Teil der Tumoren nicht erkannt, mit der Ausnahme in 1 intramuköse Krebs (# M12). Darüber hinaus Kopienzahl Verlust von MDM2
, die eine Rolle bei den Abbau von p53 spielt [36], mit diffusen p53-Überexpression in Abwesenheit eines TP53
Mutation korreliert. Dieses Phänomen wird kaum berichtet, konnte aber in frühen GCs einer der Mechanismen der p53-Überexpression sein. In frühen Krebsarten
kann es ruhend und invasive Komponenten sowie wahre Vorläufer von fortgeschrittenen Krebserkrankungen sein. Unter den frühen in der vorliegenden Studie untersuchten Krebsarten, eine invasive Teil 1 Tumor (# S3) und 3 intramukosalen Krebserkrankungen (# M11, # M12 und # M13) zeigte die Unterschrift von aggressiven Krebs (MYC
+ und /oder TP53
-) und häufige Mutationen von TP53
; jedoch in 1 submuköse Krebs (# S1) zeigten die invasive Teile der Signatur ruhender Krebs (MYC
- /TP53
+).

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