analisi Lineage dei primi e avanzate adenocarcinomi tubolari dello stomaco:? continua o discontinua

analisi Lineage dei primi e avanzate adenocarcinomi tubolari dello stomaco:? continui o discontinui
Abstract
sfondo
eliminazione della precoce carcinoma gastrico ( GC) è pensato per contribuire alla riduzione della mortalità dei GC, dato che la maggior parte dei primi progressi GC ai GC avanzati. Tuttavia, GC precoce è considerata una variante alternativa dormiente di GC, e progredisce di rado a GC avanzato. Lo scopo di questo studio è stato quello di chiarire la portata della sovrapposizione di linee genetiche tra l'inizio e adenocarcinomi tubolari avanzate (vasche) dello stomaco
. Metodi
colorazione immunoistochimica per p53 è stata eseguita utilizzando 28 stomaco chirurgicamente asportati con 13 intramucoso e 15 vasche invasivo. Con chromosome- e basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH), genomica numero di copie di costituzione è stata confrontata tra la mucosa e parti invasive delle vasche invasive e tra le parti della mucosa delle vasche invasivi e intramucoso, utilizzando 25 e 22 vasche, rispettivamente. TP53
mutazione in esoni 5-8 è stato esaminato in 20 vasche.
Risultati
cromosomica CGH ha rivelato che 4Q + e 11q + erano più comuni nei vasche avanzate e precoci, rispettivamente, mentre la copia numero cambia in 8q e 17p mostrato differenze significative tra vasche precoci e avanzate. Tuttavia, CGH array ha rivelato che, dei 13 vasche intramucoso esaminato, la perdita di MYC
(MYC
-) e il guadagno di TP53
(TP53
+) è stato rilevato in 9 vasche e MYC
+ e /o TP53
- è stato rilevato in 3 vasche. Dei campioni di mucosa di 9 vasche invasive, 7 hanno mostrato MYC
- /TP53
+ e nessuno ha mostrato MYC
+ e /o TP53
-. Dei 9 campioni delle parti invasive, 1 (da tumori della sottomucosa) hanno mostrato MYC
- /TP53
+ e 6 (1 da sottomucosa e 5 da tumori avanzati) hanno mostrato MYC
+ e /o TP53
-. Questi ultimi 6 tumori comunemente hanno mostrato un modello mutante (diffusa o nullo) in p53 immunoistochimica, e 4 dei 6 tumori valutabili per TP53
analisi di sequenza ha rivelato mutazioni. L'array CGH modello generale ha indicato che, tra la mucosa e le parti invasive, lignaggio genetico è stato trovato discontinua in 5 tumori avanzati e continuo in 3 tipi di cancro della sottomucosa.
Conclusioni
lignaggi genetici spesso differivano tra i primi e avanzati vasche. MYC
- /TP53
+ e MYC
+ e /o TP53
-. Può essere le firme di vasche in sospeso e aggressivi, rispettivamente, nello stomaco
Sfondo
cancro gastrico rimane la seconda causa più comune di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, nonostante un recente diminuzione della sua mortalità nei paesi sviluppati [1]. carcinomi gastrici (GCS) sono classificati morfologicamente in 2 categorie principali: tubolare di formazione tipo e tipo diffuso [2, 3] e, nella stadiazione, in precoce dei tumori (che coinvolgono la mucosa e la sottomucosa) e tumori avanzati (che coinvolgono la muscolare propria o più profondo). GC precoce è considerato un cancro curabile [4]; progredisce riferito al GC avanzata dopo che varia durata come una fase iniziale di GC [5, 6]. In Giappone, all'inizio del GC può essere attivamente asportato endoscopicamente e chirurgicamente [7], basato sui principi di diagnosi precoce e trattamento. D'altra parte, alcuni patologi sostengono che le lesioni neoplastiche tubolari formanti che sono limitati alla mucosa impiegano molto tempo o sono in grado di invadere i tessuti più profondi. In tal modo, queste lesioni sono chiamati displasia [4].
Recentemente, un programma di massa di screening per neuroblastomi in Giappone [8-10] è stato sospeso a causa di una discontinua lignaggio genetico è stata trovata tra il precoce ed i neuroblastomi tardo-presentazione. neuroblastomi negativi e tardo-presentazione (≥1 anno) hanno mostrato quasi diploidia con perdita di terminale 1p, mentre neuroblastomi positivi nei neonati hanno mostrato quasi triploidia senza 1p eliminazione [11, 12]. D'altra parte, ibridazione genomica comparativa (CGH) analisi basata su suggerito che alto grado atipica iperplasia adenomatosa nel polmone è il vero precursore del carcinoma bronchioloalveolare [13]. Nello stomaco, si tratta di un problema fino a che punto lignaggio genetico si sovrappone agli inizi e avanzata GC.
In tipo diffuso GC, abbiamo usato CGH a dimostrare che le alterazioni cromosomiche copia numero di carcinomi a cellule ad anello con castone intramucoso che mostravano una struttura stratificata [14] furono ereditati in una frazione di GC dissociati scarsamente in fase avanzata [15]. La presenza di una struttura a strati di cellule ad anello con castone nelle parti della mucosa di questi tumori avanzati anche suggerito che i carcinomi a cellule anello con il sigillo può essere un vero precursore di GC scarsamente differenziati. analisi lignaggio CGH-based di un altro sottoinsieme di GC avanzati scarsamente differenziati con componenti tubolari, ma nessuna struttura a strati nella parte mucosa ha rivelato che GC di questo sottogruppo sono stati ricavati da un componente tubolare in un tumore e sono stati caratterizzati da 17p- e 8q + [16] e inattivazione del wild-type TP53
da mutazione e la perdita di eterozigosi (LOH) [17]. Al fine di determinare la controparte fase iniziale di questo tipo di GC, abbiamo analizzato adenocarcinomi tubolari intramucoso (vasche) utilizzando CGH. Questi studi hanno trovato che le vasche intramucoso hanno mostrato non solo le diverse modifiche cromosomiche comune a GC avanzati, ma anche spesso mostrato 8q- e 17p + che erano criticamente diverso da GC avanzati e scarsamente differenziati [18].
Nel presente studio, d'autore numero cambia di cromosomi e geni sono stati esaminati nelle mucose e invasive parti di un'altra serie di vasche precoci e avanzate utilizzando array e cromosomica CGH. Sulla base di questi dati, abbiamo dimostrato i casi di lignaggi continui e discontinui tra intramucoso e parti invasive di singoli tumori e abbiamo scoperto che TP53
e MYC
possono essere buoni marcatori lignaggio per vasche gastrici.
Metodi
Il Institutional Review Board di etica medica presso Shiga University of Medical Science concesso l'approvazione per lo svolgimento di questa ricerca, a condizione che i materiali utilizzati devono essere anonime.
campioni tumorali
questo studio ha incluso 28 stomaco chirurgicamente resecati (Tabella 1) con 13 vasche intramucoso e 15 vasche invasive [6 sottomucosa e 9 tumori avanzati che hanno invaso la muscolare propria o tessuti più profondi (la componente tubulare di ogni tumore è stata valutata per essere oltre il 30%)]. Ogni stomaco è stato fissato in formalina ed inclusi in paraffina. Questi sono stati scelti a caso dai materiali diagnosticati nel nostro reparto dal 1996 al 2008. tipi e stadi di tumore istologico sono stati determinati secondo la classificazione giapponese di cancro gastrico [19] e pTNM messa in scena, rispettivamente. Quando un pattern istologico della mucosa è risultato essere eterogenea in un tumore invasivo individuo, la parte con il più basso grado di atypism è stata presa come campione mucosa che può impedire la possibilità di ri-invasione delle cellule tumorali invasive nella mucosa. In tumori invasivi, campioni di DNA sono stati ottenuti da intramucoso e invasivo parts.Table 1 Sintesi di clinici, istopatologici e molecolari dati genetici di 25 adenocarcinoma dello stomaco tubolare
caso No.
Età /sesso
tipo istologico *
invasione **
LN **
fase **
CGH
p53 IHC

TP53mutation

M1
57/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M2
72/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
NT
M3
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M4
67/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
-
-
M5
74/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M6
65/M
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M7
67/F
tub1
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M8
70/F
tub1 ≫ pap
T1 (M)
N0
IA
c /a -
-
M9
51 /M
tub1 > tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M10
52/M
tub2
T1(M)
N0
IA
c/a
+
-
M11
57/F
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
-
M12
89/M
tub2
T1(M)
N0
IA
NT/a
+
+
M13
70/M
tub1
T1(M)
N0
IA
NT/a
-
NA
S1m
73/F
tub2
T1(SM)
N0
IA
c/a
+
-
S1i
NT /
a + -
S2m
81 /F
pap
T1 (SM)
N1
IB
c /
a + -
S2i
NT /
a +
+
S3M
79 /M
tub1
T1 (SM)
N0
IA
c /
a +
+
S3i
NT /
a +
+
S4M
63 /M
tub2 > tub1
T1 (SM)
N0
IA
c /NT
+
NT
S5M
75 /M
pap > tub2
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
S6m
79/M
pap
T1(SM)
N1
IB
c/NT
+
NT
A1m
71/M
tub2
T2(SS)
N2
IIIA
c/a
null
-
A1i
NT /
a nulla
NA
A2m
73 /M
tub1 > tub2
T2 (SS)
N0
IB
c /
a + -
A2i
NT /
a +
+
A3m
56 /M
pap
T2 (SS)
N1
II
c /
a + -
A3i
NT /
a +
+
A4M
81 /M
tub2 /pap
T2 (SS)
N2
IIIA
c /a
nullo -
A4i
NT /
a nulla
+
A5M
56 /M
tub1
T2 (MP)
N0
IB
c /NT -
NT
A5i
NT/NA
-
NA
A6m
45/F
tub2
T2(SS)
N1
IB
c/NT
+
NT
A7m
79/F
tub2
T2(MP)
N1
IB
c/NT
+/-
NT
A8m
69/M
tub1
T3(SE)
N2
IIIB
c/a
null
-
A8i
NT /
a nulla
NA
A9m
67 /F
tub2
T2 (SS)
N1
II
c /
a + -
A9i
NT /
a +
+
* classificazione giapponese di carcinoma gastrico; ** Classificazione pTNM. Nella colonna di Caso, M = cancro intramucoso; S = cancro coinvolge la sottomucosa; A = cancro avanzato; m = parte della mucosa; i = parte invasiva. Nella colonna di CGH, c = cromosomica CGH; un = array CGH. Nella colonna di p53 immunoistochimica (IHC); "+" Indica diffusamente (> 70%) dei nuclei positivi, "-" indica sporadicamente (< 5%) i nuclei positivi; "Null" indica l'assenza di immunoreattività a tutti. Nella colonna di TP53
mutazione; "+" E "-" indicano presenza e assenza di mutazioni, rispettivamente; NA = non valutabile; NT = non testato
immunoistochimica
colorazione immunoistochimica è stata eseguita con anticorpi monoclonali alla proteina p53 (DO-7, 1: 100; Dako, Glostrup, Danimarca).. Dopo antigene recupero di sezioni di tessuto in acqua distillata a 121 ° C per 5 min, immunoreattività è stata rilevata mediante un metodo biotina-streptavidina-perossidasi indiretta utilizzando il kit Histofine (Nichirei, Tokyo, Giappone) e la reazione diaminobenzidina. Le sezioni sono state contrastate con ematossilina. Slides del controllo negativo senza l'anticorpo primario e quelli del controllo positivo sono stati elaborati in parallelo. Microdissezione
laser e la preparazione del DNA
cellule tumorali sono stati ottenuti da sezioni di tessuto a 5 micron di spessore utilizzando un sistema LMD6000 laser microdissezione ( Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). Per i singoli tumori, le cellule tumorali sono stati ottenuti da aree > 3 millimetri 2, in cui le cellule tumorali hanno rappresentato il ≥90% della conta totale delle cellule. Queste cellule tumorali sono stati digeriti in 200 ml di proteinasi K soluzione ad una concentrazione di 200 ug /ml per circa 70 ore a 37 ° C, seguita da estrazione con fenolo /cloroformio DNA.
Amplificazione del genoma totale
DNA campione è stato amplificato utilizzando degenerato polymerase chain reaction oligonucleotide-innescato (DOP-PCR) in 2 fasi, come descritto in precedenza [20], che ha portato i prodotti di PCR più di 2 KB di dimensione, adatte per l'etichettatura nick-traduzione per CGH. Compra di serie CGH, campione di DNA è stato amplificato utilizzando il GenomePlex Tissue Kit Whole Genome Amplification (WGA2 Kit, Sigma, St. Louis, USA) [21]. Per alcuni campioni di DNA che non poteva essere sufficientemente amplificati, è stato impiegato il kit WGA5 (Sigma).
CGH (ibridazione, sondare l'etichettatura del DNA e l'analisi di immagini digitali)
tumore DOP-PCR-amplificato e DNA normale è stato etichettato con fluoresceina-12-dUTP e tetramethylrhodamine-5-dUTP (Roche, Mannheim, Germania), rispettivamente, da traduzione nick [15]. analisi di ibridazione e di immagine sono stati eseguiti come precedentemente descritto [22]. Gli utili e le perdite in numero di copie di DNA sono stati definiti dal verde ai rapporti rossi > 1.2 e < 0,8, rispettivamente. I cromosomi 1p32-pter, 16p, 19, 22 e Y sono stati esclusi da queste analisi.
Array CGH
Oligo CGH microarray (60 K, 60-mer) (Agilent, Santa Clara, Stati Uniti d'America) è stato utilizzato in questo studio , secondo le istruzioni del produttore. In breve, tumorale e il controllo del DNA era non-enzimaticamente marcato con rispettivamente Cy5 e Cy3, usando il DNA ULS Labelling Kit Genome (Agilent) ed in modo competitivo ibridato al microarray. Utilizzando Feature Extraction Ver.9.5.3 (Agilent), l'intensità di fluorescenza dei tumori e dei controlli è stata calcolata dalle immagini di matrice ibridate catturate utilizzando uno scanner microarray (Agilent). utili e perdite Copy-numerici sono stati definiti come base 2 logaritmo della intensità del segnale del tumore al rapporto di intensità del segnale di riferimento superiore rispettivamente 0,3219 e meno di -0,3219,.
mutazione analisi per set di primer TP53
PCR erano preparati esoni 5-8 di TP53
, che ibridano alle introni accompagnamento di ogni esone. Cfr file di 1 per le sequenze di primer. La prima miscela PCR consisteva in un buffer, 200 mM dNTP, 1,5 mM MgCl 2, 0,8 mM di primer, 1 ng /DNA campione microlitri e 0,5 U Platinum Taq (Invitrogen, California, USA) in un volume finale di 25 microlitri . Dopo denaturazione iniziale a 94 ° C per 2 min, 40 cicli di PCR sono state eseguite a 94 ° C per 30 sec, 54 ° C per 1 min e 72 ° C per 1 min, seguita dalla fase di estensione finale a 72 ° C per 10 minuti. Dopo la conferma dei prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio, sequenza di PCR è stata effettuata utilizzando il kit v1.1 Cycle Sequencing BigDye Terminator (Applied Biosystems, California, USA). La miscela di reazione costituita da un buffer, 2 microlitri del primo prodotto di PCR, 0,15 mM primer e 0,5 microlitri BigDye Terminator V 1.1 in un volume finale di 10 microlitri. Dopo denaturazione iniziale a 96 ° C per 1 minuto, 25 cicli di PCR sono state eseguite a 96 ° C per 10 sec, 50 ° C per 5 sec e 60 ° C per 4 min. Le sequenze in avanti e all'indietro sono stati determinati utilizzando l'ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Le mutazioni sono state rilevate confrontando questi campioni alla sequenza del DNA di riferimento (GenBank numero di accesso: HSU94788). stato allelico è stato determinato utilizzando il rapporto di mutante a wild-type livelli di picco nei profili di sequenziamento
. Analisi statistiche
Tabelle di contingenza sono state analizzate con il test esatto di Fisher e test Cochran-Armitage. Le differenze di test 2 lati con P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Risultati
immunoistochimica per p53
schemi di colorazione sono stati considerati solo quando overexpressed ≥70 le cellule tumorali hanno mostrato% nuclei positivamente macchiati se visto in un campo a bassa potenza. Otto dei 13 tumori intramucoso, tutti i 6 tumori sottomucosa e 4 dei 9 tumori avanzati ha mostrato diffusa colorazione nucleare positivo per p53 (Tabella 1). Un modello di colorazione focale è stato osservato nel caso # A7. Un modello è stato considerato negativo (che rappresenta il tipo selvatico TP53
) quando la presenza di colorazione nucleare sparse, sporadica e debole è stata osservata in < 5% dei nuclei. Un pattern di colorazione nullo è stato osservato in casi # A1, A4 e # # A8, suggerendo una mutazione non-senso di TP53
[23]
. Cromosomica CGH
Venticinque campioni provenienti da 25 casi (10 della mucosa , 6 sottomucosa e 9 tumori avanzati) sono stati utilizzati per cromosomica CGH. Tutti questi campioni sono stati ottenuti da lesioni intramucoso che hanno mostrato il più basso grado di atypism.
Mentre 4q + riscontrata nella maggior parte (6/9 dei casi) di vasche avanzate, non è stata rilevata nei 16 primi vasche (P = 0,0005). Un altro significativamente diversi cambiamenti cromosomici tra i tumori precoce e avanzati era 11q +, che è stata rilevata in 11 dei 16 primi tumori e 2 dei 9 tumori avanzati (P ​​= 0,0414). Dei 10 vasche intramucosa esaminati, 3 hanno mostrato perdita di 8q (8q-) e /o il guadagno di 17p (17p +), mentre il 7 e 2 hanno mostrato 8q + e 17p- rispettivamente. Dei 15 campioni di mucosa di vasche invasive esaminate, 3 e 4 hanno mostrato 8q- e 17p, rispettivamente +,, mentre il 7 e 6 hanno mostrato 8q + e delezioni 17p, rispettivamente.
Array CGH
Trentuno campioni da 22 casi (13 mucosa, sottomucosa 3 e 6 tumori avanzati) sono stati valutati utilizzando CGH array (Figura 1). campioni di DNA sono stati ottenuti da intramucosa e /o lesioni invasive. Figura 1 array CGH dati di dati di sequenziamento TP53 MYC e TP53 e nei primi mesi e avanzate adenocarcinomi tubolari di stomaco. I primi tipi di cancro sono divisi in tumori intramucoso (m) e della sottomucosa tumori (SM). Fare riferimento alla Tabella 1 per i numeri del campione. Numeri sono medi rapporti di esame /di riferimento di CGH array. significative perdite e guadagni sono indicati con il rosso e verde, rispettivamente. wild type (wt) e mutazione nell'esone (ex) ed intervenendo sequenza (IVS) del TP53
sono indicati con giallo e grigio, rispettivamente.
quanto illustrato nella figura 1 e nella tabella 2, la perdita concomitante di MYC
(MYC
-) e il guadagno di TP53
(TP53 +
) sono stati individuati 9 delle 13 vasche intramucoso, 7 dei campioni 9 mucosa di vasche invasivi, 1 dei campioni invasivi 3 di tumori della sottomucosa e nessuno dei campioni 6 invasive di tumori avanzati. Un modello di MYC +
e /o TP53
- è stato rilevato in 3 dei 13 tumori intramucoso, nessuno dei campioni 9 mucosa di vasche invasivi, 1 dei campioni invasivi 3 su 3 tumori della sottomucosa e 5 del 6 campioni invasive di 6 avanzato cancers.Table 2 Alterazioni di MYC
e TP53
copiare i numeri nelle prime e avanzate adenocarcinomi tubolari di stomaco
Tumori profondità
Mucosa
Sottomucosa
MP o più in profondità -



mucose parte
SM
mucose parte
profonda
cCGH
(10)
aCGH
(13)
cCGH
(6)
aCGH
(3)
aCGH
(3)
cCGH
(9)
aCGH
(6)
aCGH
(6)
8q(MYC
)+
7
2 (2 *) 3
0
1 (1 *) 4
0
3 (2 *)
8q (MYC
) -
3
9 (9 **) 3
2 (2 **)
1 (1 **)
0
5 (5 **)
1 (0 **)
17p (TP53
) + 3
10 (9 **) 3
2 (2 **) Pagina 2 (1 ** )
1 6 (5 **)
1 (0 **)
17p (TP53
) - Pagina 2 Pagina 3 (2 *) Pagina 2
0
1 (1 *) 4
0 Pagina 4 (2 *)
SM, la sottomucosa; MP, la muscolare propria. cCGH e aCGH, chromosome- e basata su array ibridazione genomica comparativa; I numeri tra parentesi indicano il numero totale di campioni esaminati. grassetto indica i risultati di aCGH. Gli asterischi tra parentesi indicano concomitanza di MYC
+ e TP53
-. asterischi indicano doppia concomitanza di MYC
-. e TP53
+ commercio basato sulla matrice complessiva modelli CGH, lignaggi genetici sono stati trovati ad essere discontinuo e continuo tra la mucosa e le parti invasive in 5 avanzato e 3 tumori sottomucosa rispettivamente. Come mostrato in figura 2, il campione dalla parte della mucosa # S3 mostrato 4p-, 4q-, 8q +, 9p-, 13q +, 15q-, 18q-, 20q + e Y, mentre il campione dalla parte invasiva # S3 ereditato le stesse aberrazioni dalla parte della mucosa, ha mostrato aberrazioni supplementari (2q-, 7p +, 8p-, 10p +, 14q + e 20q +) e perso 4p- e 22q +. In # S1, guadagni di 1Q, 14q, 19 e 20, e la perdita di 18q era comune in campioni di mucosa e sottomucosa, anche se i guadagni di 1Q, 14q, 19q e 20 nella sottomucosa erano leggermente inferiore al livello significativo. In # S2, un cambiamento comune in entrambe le parti della mucosa e sottomucosa è stato un guadagno di 20p. Il campione sottomucosa ha mostrato guadagni aggiuntivi in ​​10p, 12 e 13q e le perdite nel 3 ° trimestre, 4, 5, 8p, 9p, 9q, 10q, 12p, 14q, 16 e 19p. Il campione della mucosa ha mostrato la perdita di 18q, che è stato restaurato nel campione sottomucosa, eventualmente uniparental disomy [24, 25]. In # A1, A3 #, # A4, A8 e # # A9, aberrazioni nei campioni dalle parti della mucosa non sono stati rilevati in quelli delle parti invasive. In # A2, la continuità di linee genetiche non poteva essere valutato per l'assenza di significative alterazioni copy numero di parte della mucosa. Figura 2 Array CGH profili. Le regioni cromosomiche di numero di copia aberrazioni nella parte mucosa # S3 (S3M) sono inclusi sostanzialmente quelli nella parte invasiva (S3i), mentre quelli nella parte mucosale # A1 (A1m) sono diversi da quelli della parte invasiva (A1ì)
TP53
analisi di mutazione
le mutazioni sono state rilevate in 7 dei tumori che sono stati esaminati per l'analisi delle sequenze degli esoni 5-8 di TP53
(Figura 1, Tabella 3):. 1 di 10 cancri intramucoso, 2 dei 3 tumori sottomucosa e tutti e 4 i tumori avanzati (solo le parti invasive). In tutti questi 7 tumori, il TP53
allele era emizigote tranne in 1 cancro intramucosa (# M12) con un pattern eterozigoti per una mutazione esone-8 (figura 3) ed una diffusa o un modello null per p53, come indicato da immunoistochimica. N TP53
mutazione è stato rilevato in campioni p53-, come mostrato in figura 4. In p53 + /campioni nulli, 2 dei 15 campioni della parte mucosa mostrato TP53
mutazione, che 6 dei 7 campioni di parte invasiva ha mostrato TP53
mutazione (P = 0,0023). In 1 dei tumori della sottomucosa che mostrano TP53
+ e una mutazione hemizygous (la parte invasiva # S2), TP53
+ può riflettere polisomia uniparentale [24, 25] .table 3 Copia numero cambia di TP53
e MYC
e p53 immunoreattività nei campioni testati per la mutazione analisi
caso No.
MYC
TP53
mutazione di TP53exons 5-8
allele mutante
MDM2
p53 IHC
M3
-
+
peso -
-
M4 -
+
peso
ns -
M5
-
+
peso
ns
+
M6 -
+
peso -
+
M7
ns
+
WT -
+
M8 -
+
peso
ns -
M9 -
+
WT
ns
+
M10 -
+
peso -
+
M11
ns
-
WT
ns -
M12
+ -
esoni 5/8
emi /etero
ns
+
M13
+ -
NA
ns -
S1M -
+
peso -
+
S1I
-
+
WT -
+
S2m -
+
peso -
+
S2i
ns
+
esone 7
emi
ns
+
S3M
ns
ns
esone 8
emi
ns
+
S3I
+ -
esoni 5/6/8
emi
ns
+
A1m -
+
peso
-
nullo
A1i
+ -
NA -
nulla
A2m -
+
peso
ns
+
A2i
+ -
esone 8
emi
ns
+
A3m -
+
peso
ns
+
A3i
- -
esone 5
emi -
+
A4M -
+
WT -
nulla
A4i
ns
ns
esone 5
emi
ns
nullo
A8M
ns
+
WT -
nulla
A8i
+ -
NA
ns
nullo
A9m -
+
WT -
+
A9i
+
+
esone 6
emi
ns
+
ns = non significativo; WT = wild type; NA = non valutabile; emi = emizigote; . Etero = eterozigote
M12, esone 5: R175H (CGC > CAC), C182C (TGC > TGT), S183L (TCA > TTA); esone 8: R267R (CGG > CGA)
S2i, esone 7: C242F (TGC > TTC)
S3M, esone 8: R273S (CGT > AGT)
S3i, esone 5: A161V ( GCC > GTC); esone 6: T211I (ACT > ATT); esone 8: R273S (CGT > AGT)
A2i, esone 8: R273 H (CGT > CAT)
A3i, esone 5: A161T (GCC > ACC)
A4i, esone 5: IVS5 + 1G > T
A9i, esone 6: Y220C (TAT > TGT)
Figura 3 TP53 modelli di mutazione. Una mutazione con una significativa componente wild-type nell'esone 8 (A) e una mutazione hemizygous nell'esone 5 (B) in un tumore intramucosa (# M12). Mutazioni in altri tumori esaminati erano emizigote come mostrato in C (# S2).
Figura 4 rapporti tra p53 immunoistochimica, il numero di TP53 e macchia mutazione caldo TP53 copiare. Per "p53 +" e "p53-", vedi la leggenda nella Tabella 1. "TP53
+", "TP53
-" e "TP53
n /s" indica un significativo aumento di copia-numero e la perdita , e nessun cambiamento significativo, rispettivamente. I numeri tra parentesi indicano il numero di campioni in parti invasive. Numeri sono numeri di campioni. I numeri tra parentesi indicano il numero di campioni in parti invasive. NA = non valutabile.
D'altra parte, nei campioni delle mucose, la /modello nullo diffuso è stato spesso associato con wild-type TP53
. Per spiegare questo risultato, il MDM2
numero di copie è stata esaminata usando array di dati CGH. Su un totale di 22 campioni valutati per TP53
analisi di mutazione, MDM2
ha mostrato la perdita di copia-numero in 10 dei 14 campioni con wild-type TP53
e 1 degli 8 campioni con TP53
mutazione . (P = 0,0237)
Discussione
in vaschetta intramucoso, cromosomica CGH rivelato 8q- e /o 17p + ad una frequenza di 3 su 10 tumori esaminati; questi cambiamenti erano più comuni in un precedente studio che ha utilizzato l'etichettatura innesco casuale [18]. Nel presente studio, 8q + è stato spesso rilevato sia nei tumori intramucoso (7/10) e nei tumori invasivi (7/15); Tuttavia, i dati precedenti suddetta raramente mostrato 8q +. Queste discrepanze possono riflettere differenze nei metodi di etichettatura utilizzati; risultati CGH con etichettatura traduzione nick o l'etichettatura innesco casuale sono stati confrontati con i segnali FISH, e si è constatato che l'etichettatura nick traduzione non di rado ha mostrato falsi positivi guadagni [26]. Tuttavia, utilizzando le stesse condizioni di etichettatura, sono state rilevate differenze significative nell'incidenza di 4q + e 11q + tra l'inizio e avanzato di cancro, forse riflettendo le differenze di linee genetiche tra loro. dati cromosomica CGH di tumori avanzati in questo studio sono stati coerenti con cromosomiche precedente i dati CGH ottenuti con nick etichettatura traduzione per GC avanzato (cioè 17p- e 8q + erano abbastanza comune) [27-30].
Anche se clinicamente distinguibili primi tumori sono generalmente considerati i precursori dei tumori avanzati [5, 6], i intramucoso e invasive parti di vasche avanzate spesso hanno mostrato numero di copie discordanti di MYC
e TP53
in questo studio: MYC
- e TP53
+ in 5 dei 6 campioni delle parti mucosali, come comunemente come nei tumori intramucosa esaminati e MYC
+ e /o TP53
- in 5 dei 6 campioni delle parti invasive. Inoltre, sulla base della matrice CGH schema generale della mucosa e parti invasive di tumori, un discontinua lignaggio genetico è stato trovato in 5 dei 6 tumori avanzati. Pertanto, sembra che i cloni tumorali nelle parti della mucosa dei tumori avanzati non erano precursori della parte invasivo, ma i tumori intramucosa minute che probabilmente coesistono con i tumori invasivi. E 'stato riportato che più tumori minuto sono più comuni in vasche che in indifferenziato di tipo GC [31]. In vaschette avanzata, il precursore intramucosa di un componente invasiva potrebbe essere stato perso a causa di ulcerazioni nel tumore, o il precursore non è stato esaminato perché non coincide con la parte del più basso grado di atypism, a cui l'esame della mucosa parte di GC invasivo fu confinato nel presente studio.
D'altra parte, nei tumori sottomucosa, un continuo lignaggio genetico è stato trovato in tutti i 3 i tumori della sottomucosa esaminati. Può essere perché la parte della mucosa è sostanzialmente mantenuto nei primi mesi del GC e perché il precursore della mucosa di un componente invasiva ha dimostrato il grado più basso di atypism e non è stato escluso dalla analizza l'attuale array. La mucosa e le parti invasive avevano regioni comuni di numero di copia aberrazioni con punti di interruzione concordanti, e la maggior parte dei cambiamenti nella parte della mucosa sono stati inclusi in quelli della parte invasiva. . A livello del gene, i numeri di copie di MYC
e TP53
erano coerenti tra le parti della mucosa e sottomucosa in 2 dei 3 tumori sottomucosa
Il TP53
- e /o MYC
+ modello è stato rilevato non solo nelle parti invasivi 1 dei tumori sottomucosi e la maggior parte dei tumori avanzati, ma anche in 3 dei 13 tumori intramucosa. In questi tumori, p53 immunoistochimica ha mostrato un diffuso o modello nullo (mutazione) (Tabelle 1 e 3), suggerendo che il TP53
- può riflettere LOH e l'inattivazione risultante di wild-type TP53
. Il sequenziamento analisi dei punti caldi di mutazione di TP53
hanno dimostrato che le mutazioni hemizygous (cioè mutazione e LOH) sono stati rilevati nei campioni di mucosa 1 dei 3 tumori intramucoso e 1 tumore sottomucosa con
TP53 - modello, come così come le parti invasive delle 4 tumori avanzati che erano informativo per TP53
analisi di mutazione. Tale inattivazione di wild-type TP53
, che può causare ulteriore instabilità genomica, è stato spesso riportato in GC avanzati [15, 17]. Il MYC
gene locus è noto anche per mostrare spesso i guadagni copia-numerici o amplificazioni in vari tumori avanzati [32]. MYC
+ /TP53
- può quindi essere giustificata come la firma di GC aggressiva
E 'stato riportato che LOH così come le mutazioni di TP53 Quali sono più frequentemente rilevata nel GC avanzate rispetto ai primi. GC [17, 33], e che, entro la prima parte GC, TP53
mutazioni sono più frequentemente rilevati in vasche sottomucosa che nelle vasche intramucoso [34, 35]. Questa tendenza è stata osservata anche nel presente studio, ma la mutazione analisi ha indicato che le mutazioni hot spot non sono stati rilevati nella parte della mucosa dei tumori, fatta eccezione per 1 cancro intramucoso (# M12). Inoltre, la perdita di copia-numero di MDM2
, che svolge un ruolo nella degradazione di p53 [36], correlata con diffusa p53 sovraespressione in assenza di un TP53
mutazione. Questo fenomeno è scarsamente segnalato, ma potrebbe essere uno dei meccanismi di p53 sovraespressione all'inizio GC.
Nei primi tumori, ci possono essere componenti sospeso e invasive nonché veri precursori di tumori avanzati. Tra i primi tumori esaminati nel presente studio, una parte invasiva di 1 tumore (# S3) e 3 tipi di cancro intramucoso (# M11, M12 e # # M13) ha mostrato la firma di tumore aggressivo (MYC
+ e /o TP53
-) e frequenti mutazioni di TP53
; tuttavia, in 1 tumore sottomucosa (# S1), le parti invasive mostrato la firma del tumore dormiente (MYC
- /TP53
+).

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