Xpert MTB /RIF assay lehet használni archivált gyomor Pipettázzunk és indukált köpet mintákat érzékeny diagnosztizálására gyermekgyógyászati ​​tuberkulózis

Xpert MTB /RIF vizsgálat használható archivált gyomorszivadék és indukált köpet mintákat érzékenyebb diagnózist gyermekgyógyászati ​​tuberculosis katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Tuberkulózis (TBC) a gyermekek elhanyagolt, aminek elsődleges oka az érzékeny diagnosztikai eszközök . Mostanában Xpert MTB /RIF assay forradalmasította a diagnosztikai területen, de annak hasznosságát gyermekkorú TB még nem számoltak be az Indiából és nincs jelentés elérhető a használata hosszú távon archivált minták. Katalógusa Módszerek katalógusa Mi toborzott 130 gyermekkorú betegeknél a valószínű mellkasi tuberkulózis és gyomorszivadék (GA) és indukált köpet (iS) minta 2 egymást követő napon között gyűjtöttük 2009. január 2012. december az összes mintát (n = 520) voltak kitéve a kenet vizsgálat BACTEC-MGIT kultúra és a házak katalógusa multiplex PCR. Egy aliquot Minden minta-t tárolunk -80 ° C-on és teszteltük Xpert MTB /RIF assay 2013
eredménye
Minta bölcs és a beteg bölcs kimutatási aránya kenet mikroszkópia 4,4% és 10%, míg a BACTEC -MGIT kultúra volt ez az arány 24,4%, illetve 46,9% volt. A 130 nap 1 GA minták 31,5% és 27,7% a 2. napon GA minta volt pozitív kultúrát. Csak 17,7% GA minta volt pozitív mindkét napon. A 130 IS mintákban az 1. napon, naponta 2, 15,4% és 23,1% mintákat tenyésztés pozitív. Kombinációja GA és nagyságrendben legjobb eredményt. Egyesíti mind GA és IS, érzékenységének átfogó Xpert MTB /RIF kenet és tenyésztés pozitív minták 95,6%. Ebben kenet negatív és a kultúra pozitív minták érzékenysége 62,5%. Az időtartam mintatárolás befolyásolta a Xpert MTB /RIF teljesítményét teszt (p = 0,0001). A kenet pozitív tárolt minták esetében 650-849 napig, annak érzékenységét volt 85,7% és 77,1% az IS és a GA mintákat csökkent 33,3% és 50% -kal, ha a tárolt több mint 1050 nap.
Discussion
megerősítő diagnózis tuberkulózis különösen gyermekeknél egy orvosi kihívása. Nincs olyan laboratóriumi és radiológiai vizsgálat elérheti a megfelelő szintű diagnosztikai érzékenység. Azonban ebben a tanulmányban foundthat kombinációja több minta és többszörös diagnosztikai tesztek adhat sokkal jobb hozam, bár notoptimum. A jelen tanulmányban, a 2-gyomor Leszívott (GA) és 2 indukált köpet (IS) mintákban két egymást követő napon, és teszteltük a három diagnosztikai módszerek engedett szignifikánsan magas felderítési arány. Annak ellenére, hogy a hosszú távú tárolás, a teljes érzékenysége Xpert MTB /RIF kenet és -kultúrtest pozitív minták is nagyon magas. De miután tárolja ezeket mintának subfreezing feltételek thesensitivity az Xpert MTB /RIF jelentősen csökkent. Ez várható volt, mert még ha a minta kenet és tenyésztés pozitív, a gróf túlélő mycobacteria lemegy, miután több éves ez a szám elérheti a kimutathatatlan szintre. Katalógusa Következtetés katalógusa Ez a jelentés azt mutatja, hogy kenet és a kultúra pozitív minták tároltuk subfreezing feltételek évekig lehet használni az Xpert MTB /RIF vizsgálat, miközben jelentős diagnosztikai vizsgálat érzékenysége és specificitása. katalógusa Kulcsszavak katalógusa Pediatrics tuberkulózis Indiában gyomorszivadék indukált köpet archivált minták MPCR MGIT kultúra, Xpert MTB /RIF Háttér katalógusa egészségügyi Világszervezet (WHO) becslése szerint a globális terhe tuberkulózis (TBC) 9 millió új esetet és 1,5 millió halálesetet 2013 [1]. Ez magában akár 15% teher gyermekkori esetek. Mintegy 74.000 gyermek hal meg minden évben a TB és vannak, körülbelül félmillió új eset fordul elő évente [2]. Mint a felnőttek többsége (70-80%) a gyermek TBC jelen tüdőtuberkulózisban (PTB). A tuberkulózis gyerekek már viszonylag elhanyagolt, elsősorban kihívások a rendelkezésre álló hatékony diagnosztikai eszközök [3]. India 17. között 22 nagy mértékben érintett országokban szempontjából teljes TB előfordulási aránya, de nagyon kevés információ áll rendelkezésre vonatkozó járványtan TB gyermekek, a diagnózis és a kezelési [4, 5].
Legtöbb környezetében diagnózisa gyermekgyógyászati ​​TB alapján készült érintkezési nyomkövetés, és nagyon kevés kísérlet történt az aktív esetfelismerést. Ez elsősorban annak köszönhető, hogy hiányzik a kórjelző klinikai gyermekgyógyászati ​​TB és hiánya érzékeny diagnosztikai eszközök [3, 4, 6, 7].
A korlátozott eszközökkel megerősítő laboratóriumi diagnosztika, értékelése kórtörténet, tuberkulin bőrteszt, mellkas röntgen, és hiányzik a válasz antibiotikumok segítenek abban, hogy a klinikai diagnózist. Smear mikroszkópia és mikrobiológiai megerősítés ritkán érhető miatt rossz e vizsgálatok érzékenységét, részben a paucibacillary betegség természete és képtelenség a fiatal gyermekek, hogy optimális köpet minta [6]. Alternatív minták közé gyomorszivadék (GA), indukált köpet (IS), orr-garat szívjon, bronchio-alveoláris mosás, gége pálcikát, string teszt és székletmintát [3, 7-10]. Attól függően, hogy a diagnosztikai teszt használható, ezek a minták azt mutatják, változó érzékenység és specificitás. Leírták, hogy a gyomormosás mintákat a legmagasabb (40-92%) felderítési arány, érzékenységétől függően a laboratóriumi vizsgálati elfogadott. További mintákat mutattak rosszabb észlelési arány kezdve 4-43% -os bronchusmosó, 24-30% az orr-garat törekvés, 27-63 a gége tampon és 20-30% felhasználásával indukált köpet. Néhány munkás is használják húr teszt, de az eredmények nem voltak biztató [3, 7, 11-13].
A közelmúltban vezették be a Xpert MTB /RIF assay (Cepheid, USA) jelentősen átalakította a diagnosztika tuberkulózis felnőtteknél , de annak alkalmazása a diagnózis a gyermekgyógyászati ​​TB értékelés alatt. Ez a vizsgálat a gyors és eredményeket ad, 2 órán belül [14]. A politikai nyilatkozat az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 2011-ben, ajánlott a használata Xpert MTB /RIF assay előzetes diagnosztikai eszköz a gyermekek körében, a felnőttek feltételezett humán immundeficiencia vírus (HIV) járó gümőkór és minden MDR TB gyanús esetek [ ,,,0],15]. Ezt követően több munkás kezdett használ Xpert MTB /RIF vizsgálat a diagnózis a gyermekgyógyászati ​​tuberculosis [10, 16-18]. Azonban a széles körű alkalmazása Xpert MTB /RIF a diagnózis a gyermekgyógyászati ​​TB rutinszerűen még mindig egy távoli opciót. A mai napig csak néhány tanulmány alkalmazásáról szóló a Xpert MTB /RIF diagnosztizálására gyermekgyógyászati ​​TB. Két tanulmány beszámol a használata a Xpert MTB /RIF indukált köpet két való felhasználását gyomormosás mintákban. Nincs olyan tanulmány, amely beszámol használata Xpert MTB /RIF mindkét GA és IS mintákat egyidejűleg ugyanazon beteg. Továbbá, nincs tanulmány az Indiából származó értékelését Xpert MTB /RIF diagnosztizálására gyermekgyógyászati ​​pulmonális TBC. Sőt, a közüzemi Xpert MTB /RIF archivált GA és IS mintákat korábban még nem vizsgálták. Mivel az Xpert MTB /RIF lett csak 2011 után, nincs más gyorsteszt, amely képes észlelni a tuberkulózis és a RIF ellenállás egyidejűleg mintákat gyűjtöttük 2011 előtt A vizsgálat azt is vizsgálja, milyen hatása hosszú távú tárolása klinikai minták esetében a kimutatása TB által Xpert MTB /RIF vizsgálattal.
Azt korábban beszámolt arról, hogy GA minta jobb hozamokat, mint ami a minták [19]. Egy későbbi jelentés azt is kimutatta, hogy semlegesíti a pH gyomorszivadék feldolgozás előtt vezet magasabb szennyezettségi javítása nélkül az észlelési arány [20]. A jelen tanulmányban számolunk be a teljesítményt a Xpert MTB /RIF archivált GA és IS mintákban, két egymást követő napon a gyermekek valószínű mellkasba TB, akiket részeként kettős vak, randomizált, kontrollált vizsgálat, hogy tanulmányozza a szerepét mikrotápanyag kiegészítés gyermekekben belüli mellkasi tuberkulózis. katalógusa módszerek katalógusa vizsgálati terv és figyelemmel felvételi katalógusa a vizsgálat között a 2009. január 2012. december All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) és Kalawati Saran Gyermekkórház ( KSCH), mind a New Delhi, India. Ez a munka része volt egy kettős vak, randomizált, kontrollált vizsgálat, hogy tanulmányozza a szerepét mikrotápanyag kiegészítés gyermekeknél belüli mellkasi tuberculosis [19-22]. Összesen 403 gyermek (58,2% lány) év közötti 6 hónap és 14 év [medián életkor, 120 hónapot; interkvartilis tartomány (IQR), 7-168 hónap], a várható belüli mellkasi TB vontunk be. A szabványos klinika radiológiai kritériumok gyanítható belüli mellkasi tuberkulózisos ebben a vizsgálatban használt, mint korábban publikált [19-22]. A diagnózis a mellkasi tuberkulózis ajánlásai alapján Indian Academy of Pediatrics. Bármely gyermek köhögés és láz több mint 2 hétig nem javul alatt hét-tíz nap amoxicillin során és a legutóbbi megmagyarázhatatlan fogyás vagy történelem érintkezés TB beteg az elmúlt két évben. Minden tuberkulózis gyanúsított ment mellkas röntgen (oldalsó és első-hátsó). Jelenlétében tartós röntgen rendellenességek, nem-felbontású klinikai tünetek és alternatív okot a tünetek és a mellkas röntgen leletek, valószínű diagnózis a mellkasi tuberculosis készült. Minden gyermek valószínűsíthető tuberkulózis vetettük alá tuberkulin bőrteszt (TST), ambuláns gyomor Leszívott (GA) és indukált köpet (IS) vizsgálatát AFB kenet és a kultúra. Gyermekek kezdődtek ATT mint egy ajánlásait RNTCP [5]. Röviden: Az összes gyermek valószínű belüli mellkasi tuberkulózis voltak kitéve a gyomor aspiráció (GA) és indukált köpet (IS) gyűjtemény két egymást követő napon (D1 & D2). A gyerekeket arra a kérdésre kell 6 órás éheztetés reggel a kijelölt klinikán. Miután elmagyarázta az eljárást, és a hozzájárulás megszerzésének a szülők és a szóbeli hozzájárulását a gyermekek megfelelő méretű betöltőnyílás (10-12G) helyeztünk át egyik orrlyukba, amíg elérte a gyomrot. A cső helyzete ellenőriztük befúvásos levegőt a gyomorba. A tartalma gyomor teljesen leszívattuk, tartani steril tartályba. Szokásos összegyűjtött mennyiségek körül volt 10 ml. A mintákat szállítottak el a laboratóriumba belül további feldolgozás 1-2 óra.
Ugyanebben ül gyomor aspirációs követte indukált köpet egy rés körülbelül fél órát. A köpet indukció, a gyermek alapozott 2 felfújja szalbutamol belélegzés által kimért dózisú inhalációs (MDI Asthalin, 100 ug /puff, Cipla, India)) és a távtartó (Zeroastat VT távtartó, Cipla, India), majd porlasztás 3 ml 3 % sóoldat elkövetkező 15-20 perc. Minden mintát adott egyedi kódszámokat; és a laboratóriumba küldeni anélkül, hogy a linket a klinikai és a beteg adatait. A mintákat feldolgozása ugyanazon a napon AFB kenet, BACTEC-MGIT kultúra és a házon belüli katalógusa PCR [23]. Klinikai és más beteg adatai kerültek rögzítésre excel sheet kezeljük gyermekorvos és a laboratórium nem volt tudatában a klinikai diagnózis az alanyok. Katalógusa Etikai megfontolások
jóváhagyta a vizsgálatot intézményi etikai bizottság All India Institute of Medical Sciences Újdelhi és Kalawati Saran Children Hospital, New Delhi, India, és a tárgyalást regisztrált clinicaltrials.gov (NCT 00801606). Írásos beleegyezését adta nyert szülei /gyámjai minden gyermeknek. Katalógusa Laboratóriumi módszerek katalógusa minták feldolgozása katalógusa IS és GA (pH nem semlegesített) mintákat dolgoztunk korábban leírt [19, 21, 23, 24] . Röviden, a mintákat centrifugáltuk 10.000 x g, 10 perc, 4 ° C hőmérsékleten; felülúszót dekantáljuk, és üledéket újra szuszpendáljuk azonos térfogatú 0,5% NALC-4% -os NaOH-keverék 50 ml Ridge capped kerek fenekű feldolgozás csövekbe. A szuszpenziót alaposan (4 x 10 s-onként) vortexeltük, hogy megfelelő keverést és inkubáljuk 37 ° C-on 10 percig. Inkubálás után lúgos pH-oldattal semlegesítjük, foszfát-puffer [PBS-sel (pH 6,8, össztérfogat 50 ml)], majd a végső centrifugálás 10000 x g, 10 perc, 4 ° C-on. A felülúszót dekantáljuk; az üledéket újra szuszpendáljuk 2 ml PBS-ben és 0,5 ml térfogatú aliquot részekre osztottuk 4 steril csövekben. Egy aliquot használták kenet előkészítés, az egyik a kultúra és a másik tesztelésre egy házon katalógusa multiplex PCR (m-PCR). Egy aliquot részt -80 ° C-on további felhasználásig. Az egyik aliquot, egy 500 ul szuszpenziót oltottuk BACTEC MGIT-960 folyékony tenyésztési rendszer (BACTEC TM MGIT, Becton Dickinson, Sparks, USA), a standard protokoll [25]. Függetlenül attól, hogy pozitív vagy negatív villant eredményeképpen minden kultúrában vizsgáltunk Ziehl-Neelsen festés. Differenciálása izolátumokat Mycobacterium tuberculosis katalógusa (MTB) vagy nem gümőkóros mycobaktériumban (NTM) vállalta a fajspecifikus házon katalógusa m-PCR [23]. Az IS és a GA minta aliquot, -80 ° C-on, retrospektív vizsgálták az Xpert MTB /RIF vizsgálattal. Katalógusa Xpert MTB /RIF teszt katalógusa 2013-ban a tárolt mintákat kitéve Xpert MTB /RIF tesztelés . Voltak 520 mentesíteni GA és párosítva minták (130x2 GA & 130x2 IS), amelyek a tesztelésre alkalmas, míg mások akár nem elegendő mennyiségű vagy minőségű (szennyezett). A mintát reagens tartalmazó puffer nátrium-hidroxiddal és izopropanolt adunk hozzá, az arány 3: 1 (összesen 2 ml), és inkubáltuk 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A kezelt mintát (2 ml) ezután átvittük az Xpert MTB /RIF patron tartalmazó mosópuffer, liofilizált Reagensek DNS-extrakció és a PCR-amplifikáció. Miután megfelelő keverési, a patront betöltött Xpert MTB /RIF eszköz, mint egy a gyártó utasításai (Cepheid, USA). A műszer végzi mintának keverő, ultrahangos kezeléssel mycobacterialis bacilusok és a belső kontroll (spórák), DNS-kibocsátás és a keverés a PCR reagensek, automatikusan. Ezt követi egy hemi-nested Real Time-PCR-amplifikáció cél felderítése öt színű fluoreszcencia molekuláris beacon próbák és a belső kontroll in situ katalógusa. Az eredmények után keletkezett 2 óra, és jelezték, M. tuberculosis katalógusa - negatív vagy pozitív félig számszerűsített bacilus terhelés a magas, közepes, közepes vagy alacsony, és ha a kórokozó RIF érzékeny vagy rezisztens [14]. A beteg részleteket kapcsolódik a vizsgált minták csak befejezése után a Xpert MTB /RIF értékelést.
Statisztikai analízis
érzékenysége Xpert MTB /RIF úgy határoztuk meg, figyelembe véve MGIT kultúra megerősítette minták valódi pozitív. Annak megállapításához, a specificitása Xpert MTB /RIF, kenet, MGIT kultúra és a házon katalógusa m-PCR negatív mintákat tekinthetők valódi negatív minták. Pozitív prediktív értéke (PPV), a negatív prediktív érték (NPV) és likelihood arány pozitív (LRP) Xpert MTB /RIF számoltuk 95% CI (konfidencia intervallum). LRP egynél nagyobb azt jelzi, hogy a vizsgálat eredménye valószínűleg valódi pozitív és kevesebb mint egy azt jelenti, hogy a vizsgálat eredménye valószínűleg valódi negatív [26]. Pearson chi négyzet próbát végeztünk összehasonlítást beteg bölcs elemzés. Hogy kizárjuk aránya megállapodás véletlenül, Cohen kappa katalógusa tesztet használtuk. A p-érték < 0.05.was tekintettük statisztikailag szignifikáns [STATA 11.0 (College Station, Texas, USA) szoftvert használják minden statisztikai elemzés]. Katalógusa Eredmények
Ebben a vizsgálatban között végzett 2009. január december 2012. összesen 403 gyermek (58,2% lány) év közötti 6 hónap és 14 év [medián életkor, 120 hónapot; interkvartilis tartomány (IQR), 7-168 hónap], a várható belüli mellkasi TB vontunk be. Csak azok a gyerekek kerültek, akitől mind GA és IS mintákban két egymást követő napon is rendelkezésre áll. Ezért párosított IS és a GA kapott minták, két egymást követő napon 130 gyermek analizáltuk Xpert MTB /RIF vizsgálatban. A megtisztított mintákat -80 ° C-on 21,4-51,9 hónapig (medián tárolási időszak 32,5 hónap; IQR 27-35,1), mielőtt ezeket vetettük alá Xpert MTB /RIF elemzést. A laboratórium a munkafolyamat és az eredmények összefoglalását ábrán mutatjuk be. 1. ábra. 1 Folyamatábra ábrázoló felvétele minták áramlási minta feldolgozása, az alkalmazott módszerek és eredmények, mint egy STROBOSZKÓP iránymutatások
diagnosztikai eredményét IS és GA mintákban két egymást követő napon katalógusa csak 23-ből 520 (4,4%) minták 13 (10%) gyerekek AFB kenet pozitív (1.). Ezek közül 23 minta, 9 volt D1 és D2 8 volt GA mintákban. Második nap (D2) GA mintákban észlelt további 3 AFB kenet pozitív esetek miközben hiányzott 4 esetben amelyek pozitívak voltak D1, így nem volt nettó járulékos értéket egy D2 GA mintát. Csak a 3. minta volt pozitív mindkét D1 vagy D2. A D2-IS hozzáadott minta egy esetben, hanem kihagyott egy eset. Hatvan egyet 130 (46,9%) a gyermekek [127 520 (24,4%) minták] diagnosztizáltuk a kultúra megerősítette a tuberkulózis vagy a kenet vagy kultúra (1. táblázat). Out of 130 D1-GA minták 41 (31,5%), míg 36 (27,7%) a D2-GA minták tenyésztés pozitív. Huszonhárom (17,7%) gyermeknél a kultúra pozitív GA mindkét napon (2. táblázat). A hozam indukált köpet mintákat gyenge volt. 130 IS mintákban D1, csak 20 minta (15,4%) volt pozitív, míg a D2, 30 (23,1%) minták kultúra pozitív (3. táblázat). Tizenhat (12,3%) gyermeknél a kultúra pozitív IS mindkét napon. A MGIT kultúra hozamok GA és IS mintákban két egymást követő napon is látható (lásd a 2. & 3, sorrendben). Nem volt további értéke a második nap GA minta kenet mikroszkópos (9 vs 8), a kultúra (41 vs 36), vagy az Xpert MTB /RIF assay (33 vs katalógusa 34). Azonban, IS gyűjtött minták két egymást követő napon, feltéve, egy további jelentős értéket kultúra (20 vs katalógusa 30), de egy jelentéktelen további növekmény a Xpert MTB /RIF assay (22 vs katalógusa 25). Kombinációja egy GA, és az egyik minta adta a legjobb diagnosztikai eszközökkel, függetlenül attól, hogy a D1 vagy D2. Csaknem 50% mintákat (akár GA vagy IS) voltak Xpert MTB /RIF pozitív mindkét napon (ábra. 2) .table 1 teljesítménye Xpert MTB /RIF esszé bakterológiai pozitív és negatív mintákat bakterológiai [kombinációja gyomor Leszívott (n
= 260) és az indukált sputa (n = 260 katalógusa)] gyűjtött gyermekek valószínű mellkasba tuberkulózis katalógusa Bakteriológiai kritériumok (N = 520) Matton alszempontból
Nem . (%) Matton Xpert MTB /RIF Eredmények
Pozitív (%) Matton Negative (%) Matton bakterológiai pozitív (n = 127 katalógusa; 24,4%) hotelben kenet (+), a kultúra (+) hotelben 23 (4,4) *, **
22 (95,7) hotelben 1 (4,3) hotelben kenet (-), a kultúra ( +) hotelben 104 (20) *
65 (62,5) hotelben 39 (37,5) hotelben kenet (+), a kultúra (-) hotelben 0 katalógusa 0 katalógusa 0
Részösszeg
127 katalógusa 87 (68,5) hotelben 40 (31,5) hotelben bakterológiai negatív (n = 393 katalógusa 75,5%) hotelben kenet (-), a kultúra (-)
393 katalógusa 31 (7,9) hotelben 362 (92,1) hotelben összesen 520 katalógusa katalógusa 118 (22,7) ** katalógusa 402 (77,3) hotelben A táblázat azt mutatja, nagy hatékonysággal Xpert MTB /RIF a kultúra és a kenet pozitív mintát, de mérsékelt észlelési arány kenet negatív tenyésztés pozitív minták katalógusa *, ** P katalógusa < 0.001, (+) - pozitív, (-) - Negatív, szám a zárójelben százalékos katalógusa 2. táblázat teljesítménye MGIT 960 kultúra gyomorszivadék begyűjtött két egymást követő napon 130 gyermek valószínű mellkasba tuberkulózis katalógusa MGIT960 Kultúra Eredmények
nap 1
Pozitív Matton Negatív Matton Összesen Matton Day 2

• FGF9 származó rákkal összefüggő fibroblasztok egy lehetséges közvetítő invázió és anti-apoptózis gyomorrák cells
• Antioxidáns hatás és elektronmikroszkópos változások a gyomor rákos sejtvonalak által kiváltott Northeastern Thai ehető népi növényi kivonatok