MIR-449 hämmar celltillväxt och nedregleras i magcancer

MIR-449 hämmar celltillväxt och nedregleras i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen i världen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död. Utvecklingen av magcancer förknippas främst med H. pylori
infektion som leder till fokus på patologi studier på bakterie- och miljöfaktorer, och i mindre utsträckning på den mekanistiska utveckling av tumören. MicroRNAs är små icke-kodande RNA-molekyler som är involverade i post-transkriptionell genreglering. De finns för att reglera gener som är involverade i olika biologiska funktioner och förändringar i mikroRNA uttryck har kopplats till patogenesen av många maligniteter. Den aktuella studien är inriktad på att identifiera mikroRNA involverade i gastric cancer och utforska sin mekaniska relevans genom att karaktärisera sina mål.
Resultat
Invitrogen nCode miRNA mikroarrayer identifierade MIR-449 kan minskas i ett-åriga Gastrin
KO möss och i H. Pylori
infekterade gastric vävnader jämfört med vävnader från vildtyp djur. Tillväxt på gastriska cellinjer överuttryck miR-449 hämmades med 60% jämfört med kontroller. FACS cellcykelanalys av MIR-449 överuttryckande celler visade en signifikant ökning av sub-G en fraktion som indikerar apoptos. ß-Gal-analyser indikerade en åldrande fenotyp av gastric cellinjer överuttryck miR-449. Affymetrix 133v2 arrayer identifierade GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1 Mössor och CDK6
som MIR-449 mål. Luciferasanalyser användes för att bekräfta GMNN
, MET
, CCNE2 Mössor och SIRT1
som direkta mål. Vi visar också att MIR-449 överuttryck aktiverad p53 och dess nedströms mål p21 samt apoptos markörer klyvs CASP3 och PARP. Viktigt är qPCR analyser visade en förlust av MIR-449 uttryck i kliniska gastric tumörer mänskliga jämfört med normala vävnader.
Slutsatser
I denna studie dokumenterar vi en minskad expression av MIR-449 i Gastrin
KO möss och ytterligare bekräftat sin förlust i gastriska tumörer mänskliga. Vi undersökte funktion miR-449 genom att identifiera sina direkta mål. Dessutom visar vi att MIR-449 inducerar åldrande och apoptos genom aktivering av p53 vägen.
Bakgrund
Gastric cancer är bland de fem vanligaste cancerformer i världen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall [1] . Det är främst, men inte uteslutande, orsakade av H. Pylori
infektion [2] som inte alla H. Pylori
smittade personer utveckla tumörer [3]. Andra faktorer som är inblandade i utvecklingen av magcancer inkluderar graden och typen av det inflammatoriska svaret [2] liksom nivåerna av Gastrin
hormon [4, 5]. Flera studier har visat att både hypergastrinemia [6, 7] och bristen på Gastrin [5] bidrar till patogenesen av gastrisk cancer. Aklorhydri är ett vanligt inslag i musmodeller benägna att utveckla metaplasi och cancer [6, 8, 9]. Gastrin
knockoutmöss är aklorhydri [10], som gynnar en bakteriell gastric överväxt [11, 12], och kroniska bakteriella mag infektioner leder till gastric metaplasi som kan utvecklas till magcancer [6, 12].
Sedan upptäckten mikroRNA, har hittats implicerats i ett mycket brett spektrum av normala och patologiska processer [13]. MicroRNAs utöva sina reglerande funktioner posttranscriptionally genom att binda till delvis komplementär sekvensmotiv övervägande i 3 'UTR av mål mRNA resulterar i mRNA destabilisering och translationella repression [14]. Ur biologisk synpunkt är mikroRNA utmanande objekt att studera eftersom de reglerar kohorter av målgener, som inte lätt identifieras. Ur terapeutisk synvinkel, mikroRNA är mycket intressant eftersom flera studier har visat kraften av mikroRNA som biomarkörer och inledande prekliniska studier har fastställt att mikroRNA kan terapeutiskt riktas in vivo [15].
Profilering studier har bevisat mikroRNA avreglering ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive alla större cancer [16]. MicroRNAs påverkar sannolikt tumörogena processer på två nivåer. För det första har flera studier etablerade pro-onkogena eller tumör undertryckande roller enskilda mikroRNA stadigt förbinder dessa till cancer etiologi som exemplifieras av MIR-155, MIR-10b och MIR-21 [17-19]. För det andra regelverket mikroRNA i sig verkar ha tumörhämmande fungerar som genetiska ablation av viktiga microRNA biogenes faktorer, såsom Dicer starkt öka cancerbenägenhet [20] och förlust av funktionsmutationer har identifierats i viktiga mikroRNA bearbetningsfaktorer i humana tumörer [21-23].
i denna studie vi ta upp vikten av mikroRNA i gastric cancer dra nytta av den Gastrin
knockout musmodell och H. pylori
infektion av möss av vildtyp. Vi identifierar MIR-449 som betydligt nedregleras eller förlorade i musmodeller av magcancer samt primära gastriska tumörer mänskliga. Identifiering av mRNA-mål visar att denna mikroRNA utövar sannolikt tumörhämmande funktioner genom samordnade regleringen av en kohort av cancerassocierade cellcykelregulatorer inklusive status, GMNN, CCNE2, SIRT1 och HDAC1.
Metoder
Möss
Tre olika åldersgrupper (12-16 veckor, 1 år eller 1 ½ år) av vild typ (wt) eller gastrin
knockout (KO) möss användes. Alla möss var på en blandad 129 /SVJ, C57BL /6J bakgrund, korsades minst fyra gånger till C57BL /6J [12]. Mössen hölls under specifika patogenfria förhållanden och övervakas i enlighet med Federation of European försöksdjursvetenskap föreningar rekommendation [24] med 12 timmar ljus, 12 h mörker cykler.
H. pylori
infektion
C57BL6 /J-möss (n = 10) inokulerades med en icke-mus-anpassad klon av H. Pylori
stam 67:21, isolerades ursprungligen från en antral biopsi erhållen från ett svenskt hona med magsår. Stammen är VacA + och innehåller hela Cag patogenicitet ö (PAI) med genetisk stabilitet i CAG PAI [25]. Mössen inokulerades varannan dag (tre gånger) under en 5-dagars period. DNA extraherades och analyserades med avseende på närvaro av Helicobacter-arter med användning av en semi-nested polymerase chain reaction-denaturerande gradient-gelelektrofores-analys, som är specifik för släktet Helicobacter, såsom beskrivits tidigare [26]. En matchad grupp med oinfekterade C57BL6 /J-möss användes som kontroller. Sälja The magar av alla möss dissekerades in i fundus och antrum före RNA-extraktion. Alla djurförsök har godkänts av den danska djurskyddskommittén (2005 /562-40) och den danska skogen och naturstyrelsen (20010077355/6).
Möss antrum sektioner
Möss avlivades genom cervikal luxation. Antrum avlägsnades, tvättades försiktigt i iskall PBS, frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C tills RNA-extraktion.
Kliniska prover analyser
biopsier från magcancer och de intilliggande normala vävnader erhölls från patienter opererats för magcancer vid Institutionen för gastrointestinal kirurgi, Rigshospitalet. Införandet skedde i juli till december 2008 och alla patienter förutsatt undertecknat, informerat samtycke (Etiska kommittén godkännande H-B-2008-049) och danska dataskyddsmyndigheten (2008-41-2138). De biopsier placerades i RNAlater (Ambion) i operationssalen och därefter frystes vid -80 ° C tills RNA-extraktion.
RNA-extraktion och qPCR analyser
RNA extraherades med användning av TRIzol (Invitrogen) enligt tillverkaren. miRNA expressionsprofil bedömdes med hjälp Taqman miRNA analyser (Applied Biosystems) för HSA /MMU-MIR-449a och b, HSA /MMU-MIR-34a, b och c och rnu44 eller HSA /MMU-MIR-191. Primersekvenser för Affymetrix mål validering listas i ytterligare en fil 1, tabell S1.
Cellodling
SNU638 och MKN74 odlades i RPMI-1640 (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicillin och 100

• Inverkan av N-acetyl-L-cystein infusion på cytokinnivåer och gastriskt intramucosal pH under svår sepsis
• Godartad mag-kolik fistel i en kvinna uppvisar viktminskning och återkommande kräkningar: ett fall report